Nel 1988, Richard Lenski iniziò un esperimento di evoluzione. Ha riempito 12 borracce di Erlenmeyer con un mezzo di crescita definito limitato dal glucosio noto come DM25. Ha inoculato sei di questi palloni con un ceppo di E.coli noto come REL606 che non è in grado di utilizzare lo zucchero arabinosio come nutriente.
Queste popolazioni sono state designate da A-1 a A-6. Ha inoculato gli altri sei con un ceppo quasi identico noto come REL607 che è in grado di utilizzare l'arabinosio. Questi ceppi ancestrali, l'E.coli che si è evoluto da loro, possono essere distinti quando placcati su tetrazolio o agar arabinosio.
I ceppi Ara formano colonie rosse e i ceppi Ara+strains formano colonie bianche. Lenski mise queste fiasche in un'incubatrice tremante a 37 gradi Celsius, permettendo loro di crescere fino alla saturazione e di esaurire il glucosio nel mezzo. A questo punto, ha trasferito l'1% della coltura da ciascuno dei palloni in una nuova serie di 12 palloni contenenti terreno fresco.
Questi cicli quotidiani di trasferimento e ricrescita sono stati continuati per decenni, creando una lunga storia di evoluzione che può essere studiata dai ricercatori. Nel nostro protocollo, descriviamo come le popolazioni dell'esperimento di evoluzione a lungo termine, o LTEE, vengono trasferite e coltivate ogni giorno. Quindi descriviamo come le popolazioni vengono regolarmente controllate per possibili segni di contaminazione e archiviate per fornire un record congelato permanente per studi successivi.
Spesso ci riferiamo a questo come la, cito, documentazione fossile del LTEE. Un modo importante in cui il tempo e il carattere complessivi dei cambiamenti evolutivi vengono monitorati nell'LTEE è attraverso la misurazione delle idoneità relative delle popolazioni e dei ceppi dell'esperimento. Descriviamo come condurre questi test di competizione di co-coltura e analizziamo i dati risultanti per calcolare i valori di fitness relativi.
In questo video mostreremo la prima e l'ultima di queste procedure. In primo luogo, dimostreremo un trasferimento giornaliero dell'esperimento di evoluzione a lungo termine. Disinfettare la superficie su cui verranno condotti i trasferimenti LTEE pulendola con etanolo al 70% o una soluzione di candeggina al 10%.
Accendi un bruciatore Bunsen per creare una corrente ascensionale locale e consentire la fiammatura della vetreria. Preparare 13 palloni Pyrex Erlenmeyer da 50 millilitri ricoperti di bicchieri in Pyrex da 20 millilitri o polipropilene che sono stati lavati e sterilizzati in autoclave. Controllare i palloni per i detriti visibili e sostituire quelli che non sono perfettamente puliti.
Etichettare sei palloni da A-1 a A-6 con un pennarello rosso e gli altri sei matraccio da A+1 a A+6 con un pennarello nero. Etichetta l'ultimo matraccio rimanente, che sarà lo spazio vuoto, con la data, in formato mese-giorno, e il giorno della settimana. Riempire ciascuno dei 13 palloni con 9,9 millilitri di terreno DM25 utilizzando una pipetta sierologica sterile da 10 millilitri.
Infiammare la bocca di ciascun matraccio dopo aver rimosso il becher che funge da coperchio e prima di sostituire il becher. Fiammare la punta della pipetta tra un riempimento e l'altro di ciascun pallone. Rimuovere i palloni LTEE del giorno precedente dall'incubatore agitatore.
Esamina ciascuno a turno tenendolo verso la luce per valutarne la torbidità e il colore. Controllare l'integrità del pallone e cercare la presenza di corpi estranei. Utilizzando un micropipettatore P200 con punta filtrante sterile, trasferire 100 microlitri di coltura da ciascun matraccio LTEE nel pallone corrispondente contenente DM25 fresco.
Inizia con A-1, quindi trasferisci A+1. Successivamente, continua ad alternare tra le popolazioni meno e più. Per tenere traccia di quali colture sono state trasferite, spostare i palloni a sinistra come pipettaggio da o verso di esse.
Osservare una rigorosa tecnica asettica durante i trasferimenti. Utilizzare una punta di pipetta fresca per ogni trasferimento. Infiammare le bocche dei palloni immediatamente dopo aver aperto il tappo e prima di richiudere, e pulire la canna e l'iniettore del micropipettatore con un Kimwipe inumidito con etanolo al 70% tra ogni trasferimento.
Incubare i palloni appena inoculati a 37 gradi Celsius per 24 ore con agitazione orbitale di 120 giri al minuto su un diametro di un pollice. Conservare le colture del giorno precedente a quattro gradi Celsius. Conserva queste culture per due giorni.
Scartare le culture più vecchie che sono state salvate a quattro gradi Celsius tre giorni prima in questo momento. Immettere l'ora, la data, il numero di trasferimento, il nome o le iniziali, se le lingue erano corrette o meno e qualsiasi altra informazione pertinente nel blocco appunti del registro di trasferimento. Altre 6 2/3 generazioni sono passate nella storia dell'esperimento di evoluzione a lungo termine con E.coli.
In caso di problemi, incidenti o sospetti di contaminazione con le colture LTEE del giorno precedente, non trasferirli da essi. Invece, conservare l'intero set di 12 colture a quattro gradi Celsius per un successivo esame e un'ulteriore caratterizzazione. Recupera i palloni di riserva che sono stati trasferiti dal giorno prima e conservati a quattro gradi Celsius.
Posizionali sul piano del banco per riscaldarli a temperatura ambiente. Ruotare delicatamente ogni pallone per risospendere le cellule. Trasferire da ciascun matraccio al mezzo fresco in una nuova serie di matraccio e continuare normalmente l'esperimento.
Nel registro di trasferimento è stato annotato che sono state utilizzate le lingue di backup e registrare lo stesso numero di trasferimento del giorno precedente. Se si nota contaminazione nei palloni di riserva conservati a quattro gradi Celsius, le popolazioni LTEE interessate devono essere riavviate dalle scorte congelate. Successivamente, dimostreremo un test di competizione di co-coltura che può essere utilizzato per misurare l'idoneità relativa di due ceppi o popolazioni dall'esperimento di evoluzione a lungo termine.
Mostreremo un esperimento di competizione che evolve entrambi gli antenati LTEE, REL606 e 607, e due popolazioni evolute, popolazione A-5 a 20.000 generazioni, REL8597; e popolazione A + 5 a 20.000 generazioni, REL8604. Questi test hanno utilizzato una replica di sei volte per ogni coppia di un concorrente Ara e Ara +. Decidi quanti ceppi LTEE della concorrenza e/o popolazioni utilizzerai e quanti test di replica della competizione verranno eseguiti per ogni coppia di concorrenti.
Preparare le forniture necessarie come segue. Per il giorno del risveglio, giorno meno due, riempire un pallone Erlenmeyer sterile da 50 millilitri ricoperto da un becher da 20 millilitri con 9,9 millilitri di DM1000 o brodo di lisogenia, LB, per ceppo o popolazione di E.coli che verrà utilizzato come concorrente. Riempire un altro pallone con 9,9 millilitri dello stesso mezzo per servire come un bianco non inoculato.
Per il giorno di precondizionamento, giorno meno uno, riempire una provetta con 9,9 millilitri di soluzione salina sterile allo 0,85% di peso per volume, due palloni con 9,9 millilitri di DM25 per test replicato tra una coppia di concorrenti e un altro pallone con 9,9 millilitri di DM25 per uno spazio vuoto. Per il giorno in cui inizia la competizione, giorno zero, riempire un pallone con 9,9 millilitri di DM25, riempire una provetta con 9,9 millilitri di soluzione salina sterile e preparare un tetrazolio o arabinosio, o piastra TA, per replica del test di competizione. Riempire un altro pallone con 9,9 millilitri di DM25 per servire come uno spazio vuoto.
Se stai eseguendo una competizione di tre giorni, riempi due serie aggiuntive di fiaschi da competizione. Per l'ultimo giorno della competizione, riempire due provette con 9,9 millilitri di soluzione salina sterile e preparare una piastra TA per replica della competizione. Il giorno meno due di un esperimento di competizione, fai rivivere i concorrenti separatamente dalle scorte di congelatore.
Prelevare i crioviali contenenti le scorte congelate dei ceppi concorrenti dal congelatore a 80 gradi Celsius. Conservare le fiale refrigerate in un bel secchio mentre le si utilizza. Dopo che ogni stock congelato si scongela, vortice accuratamente per risospendere le cellule di E.coli.
In caso di rianimazione di un clone, inoculare il matraccio contenente terreno fresco con 12 microlitri di brodo congelato. Se si rianima una popolazione, inoculare con 120 microlitri di brodo congelato. Incubare i palloni di risveglio nel vuoto a 37 gradi Celsius durante la notte con 120 giri al minuto scuotendo orbitalmente su un diametro di un pollice.
Il giorno meno uno di un esperimento di competizione, precondizioni i concorrenti separatamente in DM25. Prendi le fiasche contenenti le culture dei concorrenti rianimati fuori dall'incubatrice. Trasferire 100 microlitri da ciascun matraccio nella provetta di soluzione salina per quel concorrente.
Vortice accuratamente ogni tubo di diluizione prima di trasferire 100 microlitri dalla coltura diluita in un matraccio con DM25 fresco. Inoculare due di questi palloni di precondizionamento per ciascun test replicato, uno per ciascuno dei concorrenti. Incubare i palloni di precondizionamento nel bianco a 37 gradi Celsius per 24 ore.
Il giorno zero di un esperimento di competizione, inizi la competizione mescolando i concorrenti e il piatto per i conteggi iniziali. Estrarre i palloni di precondizionamento dall'incubatore. Trasferire 50 microlitri di Ara-concorrente nel primo pallone da competizione replicato riempito con DM25 fresco.
Trasferire immediatamente 50 microlitri di Ara+competitor nello stesso pallone da competizione. Mescolare il matraccio ruotando delicatamente. Ripeti questi passaggi per combinare tutte le repliche di tutte le coppie di concorrenti che stavi testando.
Trasferire 100 microlitri da ogni pallone da competizione appena inoculato nella provetta di soluzione salina etichettata per quella replica del test di competizione. Posizionare i nuovi palloni da competizione e metterli in bianco nell'incubatrice vibrante. Nel frattempo, lo stesso giorno, vortice ogni provetta accuratamente e piastra 80 microlitri di queste diluizioni 10.000 volte su piastre TA.
Etichetta il lato del fondo di ogni piastra con la coppia di ceppi che sono stati miscelati, il numero di replica e il giorno zero per indicare che verrà utilizzato per determinare la rappresentazione iniziale di ciascun concorrente. Incubare le piastre TA capovolte in un incubatore a convezione gravitazionale a 37 gradi Celsius fino a quando le colonie dei concorrenti Ara e Ara + sono visibili e distinguibili. Generalmente, ciò si verifica entro 16-24 ore, ma potrebbe richiedere più tempo per alcuni ceppi evoluti.
Conta i numeri di colonie Ara-rosso e Ara + bianco su ogni piastra e registra i risultati. Se stai eseguendo una competizione di tre giorni, trasferisci 100 microlitri di ogni competizione replica a 9,9 millilitri di terreno DM25 fresco in un nuovo pallone dopo la crescita. Incubare questi palloni del primo giorno per 24 ore.
Eseguire un altro trasferimento allo stesso modo e incubare i palloni del secondo giorno per 24 ore per completare tre cicli completi di crescita della co-coltura dei concorrenti in condizioni LTEE. L'ultimo giorno della competizione, il primo o il terzo giorno, a seconda della durata dell'esperimento, dovrai effettuare i conteggi finali. Prendi le borracce da competizione dall'incubatrice.
Trasferire 100 microlitri da ogni pallone da competizione nella prima provetta di soluzione salina per quella replica. Vortice ogni tubo di diluizione 100 volte per miscelarlo accuratamente e trasferire 100 microlitri al secondo tubo di soluzione salina per quella replica. I tubi risultanti contengono diluizioni di 10.000 volte delle colture DM25.
Vortice ogni provetta contenente una diluizione 10.000 volte completamente e placcare 80 microlitri di esso su una piastra TA. Etichetta il lato del fondo di ogni piatto con la coppia di ceppi che sono stati mescolati, il numero di replica e il primo giorno per una competizione di un giorno o il terzo giorno per una competizione di tre giorni per indicare che verrà utilizzato per determinare la rappresentazione finale di ciascun concorrente. Incubare le piastre TA a 37 gradi Celsius e contare le colonie Ara e Ara + dopo la crescita.
Utilizza il foglio di calcolo Excel fornito con questo protocollo, o il pacchetto Fitness RR, per calcolare l'idoneità relativa dei ceppi nella tua competizione e tracciare i risultati. Durante i trasferimenti giornalieri dell'esperimento di evoluzione a lungo termine, la densità delle colture dopo la crescita è molto bassa e spesso deve essere giudicata tenendo una cultura proprio accanto a uno spazio vuoto. L'eccezione è la popolazione A-3 che si è evoluta per utilizzare il citrato nel mezzo come fonte di nutrienti aggiuntiva e cresce fino a circa dieci volte la densità cellulare delle altre popolazioni.
Le misurazioni della densità ottica nelle colture LTEE possono anche essere utilizzate per monitorare la crescita prevista. Per i test di esempio della competizione, ci aspettiamo che un concorrente più adatto aumenti la sua rappresentazione nel tempo, rispetto a un concorrente meno adatto. L'esame delle piastre TA con colonie cresciute da diluizioni di una sola replica della competizione tra i due ceppi antenati mostra che il rapporto rimane relativamente costante nel corso di un esperimento di competizione di tre giorni.
Al contrario, la popolazione A+5 supera rapidamente l'antenato REL606. E la popolazione A-5 supera rapidamente l'antenato REL607. Le due popolazioni evolute sono quasi equamente abbinate.
Le rappresentazioni delle colonie rosse e bianche rimangono quasi le stesse nei tre giorni della competizione. Utilizzando i conteggi delle colonie dopo un giorno di co-coltura, scopriamo che le forme delle popolazioni evolute sono aumentate del 60% durante l'LTEE rispetto ai ceppi ancestrali di E.coli. Continuando a trasferire le competizioni su più giorni, possiamo migliorare la precisione delle misurazioni relative della forma fisica per i concorrenti che sono strettamente abbinati.
Ma quando due concorrenti hanno fitness molto diversi, non c'è più una rappresentazione adeguata di entrambe le colonie dopo una competizione di più giorni per calcolare la relativa forma fisica. I metodi che dimostriamo qui sono fondamentali per studiare la documentazione storica unica dell'LTEE e per continuare questo esperimento di evoluzione senza limiti. Possono anche fornire un punto di partenza per altri che stanno prendendo in considerazione nuovi esperimenti di evoluzione che affrontano nuove domande, utilizzano nuovi ambienti e studiano diversi microrganismi.
