L'Office of Science and Engineering Laboratories della FDA sta sviluppando strumenti scientifici normativi per assistere gli sviluppatori di dispositivi medici e i revisori della FDA. Il nostro obiettivo finale è accelerare l'accesso dei pazienti a dispositivi medici innovativi, sicuri ed efficaci attraverso la migliore scienza disponibile. In questo protocollo, applichiamo la tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte all'avanguardia per la valutazione dei dispositivi medici utilizzati per trattare condizioni cardiache potenzialmente letali.
Questo semplice strumento consente la valutazione riproducibile dei dispositivi di elettrofisiologia cardiaca nel piatto utilizzando apparecchiature di laboratorio standard. Può anche essere utilizzato con cellule specifiche del paziente derivate da donatori con varie malattie cardiache. Per iniziare, placcare i cardiomiociti derivati da iPSC umani scongelati su piastre sterili a sei pozzetti rivestite di gelatina allo 0,1% almeno due giorni prima di seminare i cardiomiociti sul substrato flessibile di idrogel.
Coltura i cardiomiociti derivati da iPSC umani in mezzo cardiomiocitario standard per due o quattro giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per consentire loro di riprendersi dalla crioconservazione. Rinfrescare il mezzo esaurito con il 100% del mezzo cardiomiocitario ogni 48 ore. Controllare lo stato dei cardiomiociti umani derivati da iPSC prima della dissociazione valutando la salute delle cellule, garantendo vitalità e battito stabile.
Lavare i cardiomiociti con quattro millilitri per pozzetto di DPBS senza cloruro di calcio o cloruro di magnesio. Aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione a temperatura ambiente a ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere 10 millilitri di mezzo cardiomiocitario a un tubo conico sterile da 15 millilitri.
Dissociare i cardiomiociti dalle piastre a sei pozzetti con una pipetta da 1.000 microlitri e aggiungere la sospensione cellulare al tubo conico. Risciacquare i pozzetti con un millilitro di mezzo cardiomiocitario fresco per raccogliere eventuali cardiomiociti residui e aggiungerli al tubo conico. Quindi portare il volume finale del tubo conico a 15 millilitri con il mezzo.
Centrifugare il tubo a 200 g per cinque minuti e rimuovere il surnatante fino al millilitro. Risospendere le cellule nel mezzo cardiomiocitario a un volume finale di cinque millilitri e contare i cardiomiociti con un contatore cellulare manuale o automatico. Quindi, incubare la sospensione cellulare dei cardiomiociti per circa 30 minuti a temperatura ambiente mentre vengono preparati i substrati flessibili di idrogel.
Preparare una pipetta da 20 microlitri impostata a un microlitro, punte per pipette, una piastra di fondo sterile in vetro a 48 pozzetti e un timer cronometro nella cappa di coltura del tessuto. Mescolare la matrice extracellulare o il substrato di idrogel a base di ECM picchiettando delicatamente il tubo e riposizionandolo immediatamente sul ghiaccio. Avviare il timer del cronometro immediatamente prima di placcare il primo substrato di idrogel e contrassegnarlo come tempo zero.
Pipetare un microlitro di substrato di idrogel su e giù circa tre volte per raffreddare la punta della pipetta. Quindi applicare circa un microlitro del substrato di idrogel non diluito orizzontalmente sul fondo di ciascun pozzetto nella piastra a 48 pozzetti, mantenendo la pipetta con un angolo di 45 gradi. Placcare tutti i substrati di idrogel con lo stesso orientamento in ciascun pozzetto per aiutare a identificare il substrato quando si eseguono gli esperimenti con un ingrandimento 40X.
Posizionare il coperchio sulla piastra a 48 pozzetti e lasciare che i substrati di idrogel incubano per otto-10 minuti a temperatura ambiente nella cappa di coltura tissutale prima di aggiungere le cellule. Dopo l'incubazione, seminare immediatamente i cardiomiociti goccia direttamente sui substrati di idrogel con circa 30.000 cardiomiociti vitali per pozzetto in un volume medio basso di circa 200 microlitri di mezzo cardiomiocitario. Dopo aver chiuso il coperchio, lasciare che i cardiomiociti incubano indisturbati per 10-15 minuti a temperatura ambiente nella cappa per consentire alle cellule di aderire al substrato di idrogel.
Aggiungere delicatamente 100 microlitri di mezzo cardiomiocitario fresco a ciascun pozzetto. Posizionare la piastra chiusa del coperchio su un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per due o quattro giorni. Accendere il microscopio e la camera di controllo ambientale per equilibrare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Rimuovere il mezzo cardiomiocitario dalla piastra a 48 pozzetti e sciacquare delicatamente ogni pozzetto due volte con 600 microlitri di modulazione della contrattilità cardiaca o mezzo di analisi CCM. Quindi aggiungere 300 microlitri di terreno di analisi CCM per pozzetto e posizionare la piastra a 48 pozzetti sul microscopio nella camera di controllo ambientale. Inserire gli elettrodi ed equilibrare le celle per cinque minuti.
Per registrare i video di contrazione utilizzando la microscopia basata su video, aprire il software di registrazione video e impostare un frame rate di 100 fotogrammi al secondo. Quindi selezionare una regione di interesse o ROI vicino al centro del monostrato hiPSC-CM. Quindi stimolare le cellule con un generatore di impulsi commerciale per accelerare elettricamente i monostrati di cardiomiociti 2D.
Posizionare il cardiomiocita a 1,5 volte la soglia a un hertz con parametri di impulso basale. Ad esempio, impulsi monofasici di stimolazione dell'onda quadra con una durata dell'impulso di stimolo di due millisecondi di cinque volt. Registra il video di sola contrazione della stimolazione di base prima del CCM per un minimo di cinque battiti.
Quindi stimolare il monostrato dei cardiomiociti con un segnale elettrico sperimentale di ritardo di 30 millisecondi, due impulsi bifasici simmetrici della durata di fase di 5,14 millisecondi, con durata totale di 20,56 millisecondi, ampiezza di fase di 10 volt e intervallo di interfase pari a zero. Registra il video di contrazione indotto da CCM per un minimo di cinque battiti. Spegnere il segnale CCM, stimolare con un impulso di stimolazione basale e registrare un video di contrazione del periodo di recupero dopo il CCM per un minimo di cinque battiti.
Utilizzare un software di contrazione standard per analizzare automaticamente i video di contrazione e quantificare le proprietà contrattili chiave come ampiezza della contrazione, pendenza di contrazione, pendenza di rilassamento, tempo al picco, tempo al basale 90% e durata della contrazione 50% Le proprietà contrattuali monostrato dei cardiomiociti derivati da iPSC umane 2D sono state caratterizzate e sono stati quantificati i parametri chiave della contrattilità dei cardiomiociti. L'applicazione dei parametri standard di stimolazione CCM ha portato a migliori proprietà contrattili in vitro. Sono stati valutati gli effetti della modulazione extracellulare delle concentrazioni di calcio sulle proprietà contrattili umane con e senza stimolazione CCM.
È stata osservata la dipendenza attesa dal calcio al basale della contrazione, nonché un aumento della sensibilità al calcio indotto da CCM a livello del monostrato cardiomiocitario. Inoltre, l'interrogazione farmacologica della via di segnalazione beta androgenica ha rivelato che gli effetti inotropi indotti da CCM erano in parte mediati dalla segnalazione beta adrenergica. Inoltre, questo strumento può essere esteso ai cardiomiociti della malattia specifici del paziente, compresi quelli della cardiomiopatia dilatativa per comprendere l'effetto della CCM nel contesto degli stati patologici.
Qui, ci concentriamo principalmente sulla valutazione delle proprietà contrattili umane. Tuttavia, utilizzando questo strumento, si potrebbero anche valutare altre letture dell'accoppiamento di contrazione dell'eccitazione cardiaca, compresi i potenziali d'azione e la gestione del calcio. Questo è il primo strumento scientifico regolatorio che combina la tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte con la valutazione dei dispositivi cardiaci.
Questo metodo alternativo apre la strada alla valutazione dei dispositivi medici in un piatto e ha il potenziale per ridurre la necessità di test su animali e soggetti umani.
