Questo protocollo spiega come fabbricare e utilizzare le tecnologie microfluidiche per sfruttare i vantaggi sperimentali in termini di produttività dei campioni, gestione automatizzata e capacità di applicare con precisione lo stress meccanico visualizzando contemporaneamente i campioni. Questa tecnica riduce al minimo la manipolazione manuale di organismi biologici multicellulari, come embrioni e organoidi, per la loro immobilizzazione, allineamento e imaging dal vivo. Consente inoltre l'applicazione della compressione meccanica a loro per studi di meccanobiologia.
La fabbricazione di stampi con caratteristiche di proporzioni elevate per questo chip microfluidico può essere difficile con le tecniche di microfabbricazione convenzionali. I suggerimenti spiegati in questo articolo video possono superare queste sfide. Per iniziare, pulire il wafer di silicio prima con acetone e poi con alcool isopropilico.
Posizionare il wafer di silicio su una piastra calda a 250 gradi Celsius per 30 minuti. Per la disidratazione cuocere. Rivestire il wafer di silicio con esametildisiloxano in un forno a vapore prime.
Mettere una bottiglia di SU-8 2100 Photoresist in un forno a 60 gradi Celsius per 15 minuti per ridurne la viscosità. Versare un millilitro di Photoresist riscaldato per ogni pollice del wafer di silicio posto sulla piastra riscaldante fino a quando il Photoresist copre la maggior parte della superficie. Applicare il pre-spin prima a 250 rotazioni al minuto per 30 secondi, quindi a 350 rotazioni al minuto per altri 30 secondi, entrambi con un'accelerazione di 100 RPM al secondo.
Quindi, applicare prima una rotazione a 500 rotazioni al minuto per 15 secondi con accelerazione di 100 RPM al secondo, quindi a 1.450 rotazioni al minuto per 30 secondi con accelerazione di 300 RPM al secondo. Rimuovere il bordo con un tampone per camera bianca e spruzzare acetone sul wafer per rimuovere le imperfezioni e promuovere un rivestimento uniforme. Esporre il wafer di silicone a 350 millijoule per centimetro quadrato di luce UV attraverso la maschera fotografica.
Utilizzando l'allineatore della maschera di contatto, applicare il forno post-esposizione sul wafer di silicio e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Posiziona il becher all'interno di un altro becher più grande e riempi il becher più grande con una nuova soluzione per sviluppatori. Posizionare una rete metallica sul becher.
Posizionare il wafer di silicio sulla rete metallica capovolta. Lasciare il wafer di silicio immerso nello sviluppatore per 30 minuti con l'agitatore acceso. Trasferire il wafer di silicio in un sonicatore a bagno ad ultrasuoni riempito con lo sviluppatore fresco per un'ora a 40 kilohertz.
Quindi estrarre il wafer dal becher e lavarlo con una nuova soluzione di sviluppo. Preparare la soluzione PDMS pre-polimerizzata mescolando la base PDMS con l'agente di polimerizzazione con un rapporto di 10 a uno. Degasare la miscela mettendola in centrifuga per 500 g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Versare il PDMS prestampato su un wafer di silicio e degasarlo nuovamente. Infine, posizionare il PDMS non polimerizzato in forno a 60 gradi Celsius per la polimerizzazione. Utilizzare un bisturi per tagliare i bordi della regione PDMS polimerizzata corrispondente alla geometria del chip microfluidico.
Perforare i fori di ingresso e uscita sul PDMS usando un punzone per biopsia o un ago con una punta smussata. Posizionare il PDMS sul vetrino con la superficie modellata rivolta verso il vetrino dopo il trattamento al plasma per sigillare i microcanali tramite legame covalente. Consentire alle mosche adulte Oregon-R di deporre le uova su piastre di agar di succo di mela e raccogliere le piastre al momento di sviluppo desiderato dopo la deposizione delle uova per l'esperimento dato.
Inondare l'agar con il lavaggio dell'uovo dell'embrione e agitare delicatamente gli embrioni con un pennello per rimuoverli dall'agar. Trasferire gli embrioni in una soluzione di candeggina al 50% per 90 secondi, mescolando di tanto in tanto. Filtrare gli embrioni attraverso un setaccio di tessuto e lavare accuratamente la soluzione di candeggina con acqua.
Trasferire gli embrioni in una capsula di Petri di vetro da 90 millimetri con un lavaggio sufficiente dell'ovulo embrionale per coprire completamente gli embrioni. Esaminare gli embrioni con transilluminazione su un microscopio da dissezione e selezionare gli embrioni dello stadio di sviluppo desiderato per il caricamento nel dispositivo microfluidico. Innesca tutti e sette i microcanali embrionali riempiendoli con 0,4 micrometri di IPA filtrato attraverso la porta principale di ingresso dell'embrione.
Sostituire l'alcool isopropilico con 0,4 micrometri di acqua deionizzata filtrata. Quindi sostituire l'acqua DI con la soluzione di lavaggio dell'uovo dell'embrione. Raccogliere circa 100 embrioni preselezionati dalla capsula di Petri di vetro utilizzando una pipetta di vetro.
Quindi, pipettare gli embrioni nella porta di ingresso dell'embrione e applicare circa tre pressioni negative PSI all'ingresso del gas utilizzando una pompa per vuoto portatile per aprire i microcanali dell'embrione. Quindi inclinare il chip microfluidico verso il basso in modo che gli embrioni si allineino automaticamente e si stabiliscano nei microcanali dell'embrione. Se gli ingressi dei microcanali dell'embrione vengono ostruiti da più embrioni che entrano contemporaneamente, inclinare il chip microfluidico verso l'alto e poi di nuovo verso il basso per eliminare l'intasamento.
In base alla produttività richiesta, introdurre fino a 300 embrioni nei microcanali embrionali. Una volta completato il carico dell'embrione, rimuovere il vuoto per immobilizzare gli embrioni. Quindi inclinare il chip microfluidico in posizione orizzontale.
Collegare una sorgente di pressione positiva portatile con un manometro all'ingresso del gas per applicare tre compressione PSI. Se verranno condotti esperimenti di imaging dal vivo sugli embrioni stimolati meccanicamente, posizionare il chip microfluidico su un supporto per vetrino da palcoscenico standard per microscopio con l'ingresso del gas collegato alla sorgente di pressione. Esaminare gli embrioni al microscopio fluorescente all'interno dei canali microfluidici.
Una volta completato l'esperimento di compressione, gli embrioni possono essere raccolti per l'analisi a valle. Per fare questo, in primo luogo, applicare il vuoto all'ingresso del gas per liberare gli embrioni. Quindi inclinare il chip microfluidico verso l'alto affinché gli embrioni si spostino verso il basso verso la porta di introduzione dell'embrione.
Raccogliere gli embrioni dal chip microfluidico usando una pipetta di vetro. La funzionalità del dispositivo microfluidico è stata determinata sperimentalmente caricando embrioni di Drosophila nei canali di compressione e applicando una pressione positiva ai canali del gas. Gli embrioni non subiscono una compressione significativa sotto vuoto o in stati di pressione neutra.
Vengono compressi quando viene applicata una pressione positiva. Le misurazioni della larghezza decrescente degli embrioni al microscopio dimostrano come la pressione del gas può essere utilizzata per ottenere un livello di compressione target. I dispositivi microfluidici così realizzati consentono la stimolazione chimica dei campioni immobilizzati.
La stimolazione consente un'elevata imaging spaziotemporale. Una domanda fondamentale nella biologia dello sviluppo è come le forze meccaniche regolano l'espressione di proteine e geni durante lo sviluppo? Questa tecnologia ci consente di applicare la stimolazione meccanica a un gran numero di embrioni contemporaneamente, in modo da poter isolare quantità sufficienti di proteine e RNA per eseguire esperimenti comparativi di proteomica o trascrittomica.
Ciò consentirà ai ricercatori di saperne di più sulle proteine e sui geni sensibili alle forze meccaniche.
