Il nostro protocollo prevede una distinzione tra aree ricche di collagene e aree prive di collagene nelle sezioni del fegato. Può quindi essere utilizzato per studiare i processi della fibrogenesi nei dettagli più grandi. Il principale vantaggio della tecnica risiede nell'uso della microscopia polarizzante per localizzare aree ricche di collagene nelle sezioni del fegato.
I nostri protocolli possono fornire una grande comprensione dello sviluppo della fibrosi epatica e possono anche essere adottati per altri tessuti molli come i polmoni dopo alcune ottimizzazioni. Per iniziare, rimuovere le sezioni di fegato congelate da meno 80 gradi Celsius e scongelarle a temperatura ambiente per due minuti. Fissare le sezioni con paraformaldeide ghiacciata al 4% in PBS per 10 minuti a quattro gradi Celsius, quindi lavare cinque volte con PBS.
Dopo l'ultimo lavaggio, pulire il PBS in eccesso intorno alla sezione epatica usando il tessuto e segnare un confine di circa due per quattro centimetri attorno alla sezione epatica con un pennarello idrofobo. Coprire il campione con PBS, quindi caricare il campione sullo stadio AFM e coprirlo con la testa AFM. Nella microscopia a forza atomica o nel software AFM, vai alla scheda di configurazione e contrassegna un segno di spunta sul salvataggio automatico per salvare automaticamente tutti i file.
Quindi specificare il nome del file e la directory per il salvataggio dei file di misurazione andando alla scheda di configurazione e facendo clic su salvataggio delle impostazioni. Avvicinarsi alla superficie del tessuto con il cantilever AFM accendendo il laser e facendo clic sul tasto di avvicinamento. Al termine dell'avvicinamento, ritrarre la punta a sbalzo facendo clic una volta sul tasto di retrazione, che ritrae il cantilever all'estremità superiore della gamma piezoelettrica.
Se necessario, riallineare il rilevatore utilizzando manopole sulla testa AFM. Spegnere il laser. La punta è ora al centro dell'obiettivo.
Quindi, sovrapporre il campo ottico del microscopio con le mappe di misurazione AFM facendo clic sulla scheda accessori e selezionando la calibrazione ottica di sovrapposizione diretta. Nella finestra successiva, fare clic su Avanti per scattare una serie di immagini del cantilever che scansiona un'area specifica. Fare di nuovo clic su Avanti per passare alla finestra successiva.
Nella prima immagine, fare clic manualmente sul centro della punta del cantilever per rappresentare la posizione della punta nel software. Il cerchio che rappresenta la posizione della punta può essere manipolato in dimensioni indicandone il raggio per aumentare la precisione. Fare clic su Calibra per rilevare automaticamente la posizione della punta a sbalzo in tutte le immagini.
Conferma l'accuratezza del rilevamento delle punte esaminando le immagini. Fare clic su Avanti e quindi su Fine per completare la sovrapposizione ottica. Quindi, sposta lo stage per posizionare un'area ricca di collagene all'interno della casella verde, visibile nella scheda del visualizzatore di dati, utilizzando l'immagine polarizzata.
Selezionare l'area ricca di collagene definendo l'area sotto la scheda griglia, quindi creando un rettangolo nella scheda del visualizzatore di dati premendo a lungo il pulsante sinistro del mouse all'interno della casella verde specificata. Fare clic su conferma nuova regione di scansione per impostare l'area selezionata come area di misurazione. Impostare i parametri del ciclo di feedback.
Imposta I guadagno a 50 hertz e guadagno P a 0,001. Quindi impostare il set point su un nano Newton. Selezionare il valore relativo del set point in base alle proprietà meccaniche dei materiali studiati e alla rigidità del cantilever.
Specificate una linea di base giusta per adattare correttamente le curve di forza. Quindi selezionare la lunghezza del movimento a sbalzo nell'asse Z in base alla topografia della superficie del campione. Impostare il movimento Z su una durata costante.
Impostare il tempo di estensione su un secondo con ritardi di estensione e retrazione su zero. Impostare la frequenza di campionamento su 5.000 hertz. Contrassegnare un segno di spunta davanti all'anello chiuso Z per regolare automaticamente la distanza tra il campione e la punta a sbalzo durante le misurazioni.
Quindi disinnestare il controllo motorizzato dello stage deselezionando il pulsante di coinvolgimento. Accendere il laser e avvicinarsi al campione con il cantilever. Fare clic su avvia scansione per raccogliere le curve di distanza di forza.
Analizza i dati acquisiti utilizzando il software open source AtomicJ. Caricare le curve di forza nel programma facendo clic sull'icona Curve di forza processo e mappe. Quindi nell'assistente di elaborazione, aggiungi le mappe da analizzare facendo clic sul pulsante aggiungi.
Dopo aver caricato le mappe, fare clic su Avanti. Specificare le impostazioni di elaborazione nella finestra successiva. Per stimare automaticamente il punto di contatto tra il campione e il cantilever utilizzando una serie di parametri della curva di raccordo, utilizzare la stima automatica del punto di contatto.
Determinare il punto di contatto tra il cantilever e il campione con il classico metodo a griglia focalizzata. Selezionare il metodo di stima come metodo indipendente dal modello per ottenere la migliore determinazione del punto di contatto in base alla qualità delle curve di forza misurate, che deve essere determinata empiricamente durante l'ottimizzazione dell'analisi dei dati. Adattate la curva di rientro della forza utilizzando un modello classico come L due classico per l'adattamento del modello.
Impostate l'adattamento del modello sulla curva di prelievo. Impostare il rapporto di Poisson a 0,45 come raccomandato per i tessuti molli come il fegato. Impostate l'adattamento della curva utilizzando un grado di linea di base pari a tre e un grado di contatto pari a uno.
Modificate il grado di adattamento polinomiale in base alla scala delle deviazioni delle curve dal modello. Selezionate il modello utilizzato per adattare le curve di prelievo come modello Sneddon. Riempire il raggio della punta sferica a 2,9 micrometri.
Caricare la costante di molla e invOLS dai file di dati abilitando la lettura, quindi fare clic su Fine. Dopo l'analisi dei dati, passare attraverso le curve di forza. Escludere le curve di forza in cui il cantilever si è avvicinato in modo errato alla superficie della sezione del fegato.
Queste curve hanno un rumore elevato e forme aberranti. Successivamente, i dati possono essere copiati o esportati. In questo studio, sezioni epatiche leggermente fissate ottenute dai topi di controllo e topi con fibrosi lieve e avanzata indotta dall'iniezione di tetracloruro di carbonio sono state sondate con AFM.
Le aree vicine alle vene centrali corrispondenti alle aree in cui di solito si formano le fibre di collagene nei topi con tetracloruro di carbonio sono state analizzate nei fegati di controllo. La distribuzione dei moduli di Young era riproducibile in diverse regioni nei fegati di controllo e nelle aree ricche di collagene all'interno di una singola sezione epatica. Nei topi trattati con tetracloruro di carbonio, le mappe di rigidità corrispondenti alle aree pericentrali dei depositi di collagene hanno mostrato valori significativamente più alti dei moduli di Young rispetto alle aree equivalenti nei topi di controllo.
Inoltre, c'è stato un aumento significativo dei valori dei moduli di Young con un trattamento più lungo. È stato anche valutato l'effetto della conservazione prolungata delle sezioni epatiche sulle proprietà meccaniche delle fibre di collagene. Le misurazioni AFM hanno mostrato valori significativamente più bassi dei moduli di Young nelle aree ricche di collagene per le sezioni conservate per tre mesi, rispetto a quelle ottenute entro due settimane.
Il tempo di fissazione della sezione epatica determina notevolmente le proprietà meccaniche della sezione epatica. Raccomandiamo che gli intervalli di tempo indicati nel protocollo debbano essere rigorosamente seguiti. Dopo alcune ottimizzazioni nel protocollo, il metodo indicato può essere utilizzato per qualsiasi tessuto molle che mostri una significativa deposizione di collagene, che è rilevabile mediante microscopia polarizzante.
La tecnica data fornisce ai ricercatori un protocollo unificato e conveniente per studiare il meccanismo del fegato in salute e malattia.
