Questo protocollo affronta alcuni problemi chiave esistenti nella generazione di organoidi come la robustezza e l'affidabilità, e siamo stati in grado di applicare questi organoidi migliorati alla ricerca innovativa sull'invecchiamento neuronale. L'eterogeneità e la riproducibilità sono problemi significativi quando si generano organoidi cerebrali corticali. Per superarli, differenziamo prima le hPSC in colonie neuroectodermiche e poi in sferoidi neuroepileliali, che generano un'architettura tissutale riproducibile.
Questi organoidi cerebrali corticali iniziano a mostrare segni tipici di senescenza dopo una prolungata coltura in vitro, che li rendono una piattaforma utile per studiare i processi neuronali legati all'invecchiamento. Per iniziare, placcare le colonie di hPSC su una matrice di membrana basale qualificata hESC da un pozzo di una piastra a sei pozzetti con una confluenza del 60% in tre pozzetti per raggiungere una densità dal 20 al 30% e quindi procedere con l'induzione di colonie neuroectodermiche 2D. Aggiungere N2 medio fresco integrato con doppi inibitori SMAD ogni giorno a ciascun pozzetto per i prossimi tre giorni.
Per generare sferoidi neuroectodermici 3D da colonie neuroectodermiche 2D indotte, rimuovere due millilitri di mezzo N2 dalla piastra a sei pozzetti e lavare una volta con HBSS per garantire che tutto il mezzo N2 venga rimosso. Aggiungere un millilitro di dispase a ogni colonia contenente bene. Incubare la piastra per 20-25 minuti a 37 gradi Celsius e controllare regolarmente il distacco della colonia.
Alla fine dell'incubazione, per fermare l'attività dell'enzima dispasi, aggiungere un millilitro di mezzo N2 al pozzo. Utilizzando una punta della pipetta P1000 a foro largo o una punta della pipetta P1000 modificata tagliata con forbici sterili, trasferire le colonie in un tubo da 15 millilitri e consentire ai grumi della colonia di affondare sul fondo del tubo con gravità. Quindi, con una punta della pipetta P1000 standard, rimuovere con attenzione il surnatante.
Sostituirlo con un millilitro di mezzo N2 fresco e ripetere il lavaggio tre volte per garantire la completa rimozione della dispase. Dopo aver risospeso i grumi cellulari e il mezzo N2, trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti e aggiungere 40 nanogrammi per millilitro di bFGF. Dopo aver criosezionato gli organoidi, rimuovere la soluzione di montaggio in eccesso trasferendo i vetrini in un contenitore di colorazione a vetrino con un coperchio e lavare il tessuto organoide sezionato tre volte con PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
Quindi incubare i vetrini durante la notte a 37 gradi Celsius con una soluzione colorante beta-galattosidasi appena fatta. Lavare i tessuti macchiati tre volte con PBS per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente per rimuovere la soluzione di beta-galattosidasi. Ora montare i fazzoletti lavati con un montante antideflagrante in vetro e lasciare che la soluzione di montaggio si solidifichi per 30 minuti a temperatura ambiente prima di visualizzarla al microscopio.
Prima della differenziazione neuroectodermica, le colonie di hPSC hanno mostrato una morfologia monostrato piatta stretta senza cellule differenziate che contaminano le colonie. L'espressione di NANOG ha anche confermato la pluripotenza delle colonie di hPSC. Dopo la differenziazione delle colonie di hPSC in colonie neuroectodermiche, è stata osservata una morfologia di forma colonnare più lunga ed erano negative per NANOG.
Dopo il trattamento dispasi e l'esposizione a FGF2 nell'N2, le cellule staminali neurali in questi sferoidi proliferarono e formarono un numero significativo di rosette neurali che dimostrarono la polarità apicale-basale dello sferoide per espressione di Z01 nelle cellule al centro e al bordo esterno dello sferoide. Una volta incorporato, lo sferoide prolifera rapidamente e inizia a germogliare, indicato dalla presenza dei nodi tissutali compatti e dalla loro espansione verso l'esterno dal corpo principale tra una e tre settimane, che è stata ulteriormente confermata dall'analisi quantitativa e il diametro dello sferoide è aumentato significativamente in tre settimane. La colorazione a immunofluorescenza ha confermato la presenza di cellule neuro progenitrici e marcatori dello strato corticale negli organoidi con una chiara stratificazione, che era osservabile in diversi punti temporali.
È stato anche studiato l'effetto dei processi correlati all'invecchiamento neuronale sul cervello. Con il tempo, è stato osservato un aumento significativo della presenza di beta-galattosidasi associata alla senescenza e alla settimana 13 è stata rilevata la presenza di p21, che indica senescenza. È importante assicurarsi che tutta la dispersione in eccesso venga rimossa e che si stacchino delicatamente e riseminare le colonie neuroectodermiche intatte per formare sferoidi sani.
Questa piattaforma della nostra opportunità unica di studiare la biologia di un invecchiamento cerebrale umano, consente anche una ricerca sullo sviluppo critico del cervello, a condizione che questi organoidi vengano coltivati utilizzando un bioreattore.
