Questo metodo consentirà al ricercatore di sondare sistemi difficili da studiare, come peptidi e ioni di metalli di transizione di prima fila, entrambi generalmente impegnativi utilizzando applicazioni più standard. Il vantaggio principale qui è l'utilizzo di tecniche ortogonali perché si completano a vicenda e possono dare maggiori informazioni sul sistema e aiutarci a non perdere alcun fenomeno. Il metodo descritto in questo video è molto adatto per lo studio di altri sistemi.
Anche se lo mostriamo con Cu (II) e un peptide, può essere utilizzato per molte diverse interazioni di peptidi metallici e proteine metalliche. Penso che la parte più difficile sarà trovare una buona scelta tampone per il tuo ione metallico e peptide. Vorrei consultare la letteratura per vedere quali buffer sono stati usati da altri prima.
A dimostrare la procedura sarà Sohee Choi, uno studente laureato nel mio laboratorio di ricerca. Per iniziare, accendere lo spettrofotometro elettronico ad assorbimento e lasciarlo riscaldare per circa 15-20 minuti prima dell'uso. Quindi avviare il software dello spettrofotometro e configurare i parametri, come l'intervallo di scansione da 200 a 900 nanometri, l'intervallo di scansione di 200 nanometri al secondo e la linea di base a doppio fascio corretta.
Quindi, raccogliete una linea di base senza cuvette o campioni nei percorsi del fascio. Utilizzando due cuvette abbinate nello spettrofotometro a doppio raggio, caricare una cuvetta con 115 microlitri di acqua ultrapura e l'altra cuvetta con 115 microlitri di campione di peptide, assicurandosi che non ci siano bolle d'aria nelle cuvette poiché interferiranno con il segnale. Successivamente, posizionare la cuvetta con acqua ultrapura nel fascio di riferimento e la cuvetta con peptide nel fascio del campione.
Quindi raccogliere lo spettro di assorbimento del peptide privo di metalli. Aggiungere una quantità substechiometrica della soluzione di Cu(II) nella cuvetta con il campione di peptide e registrare il volume per l'analisi successiva. Versare delicatamente su e giù per mescolare la soluzione evitando la generazione di bolle d'aria.
Dopo aver equilibrato per cinque minuti, rimettere la cuvetta nel supporto della cella del campione e registrare lo spettro di assorbimento. Quindi ripetere l'aggiunta di aliquote di Cu(II) nella soluzione peptidica per vari equivalenti e registrare il volume totale di Cu(II) aggiunto alla cuvetta. Dopo aver inizializzato il software come descritto in precedenza in due cuvette abbinate, caricare una cuvetta con 115 microlitri di acqua ultrapura e un'altra cuvetta con 115 microlitri della soluzione complessa rame-fene.
Posizionare la cuvetta con acqua nella trave di riferimento e la cuvetta con soluzione complessa rame-fene nella trave campione. Quindi raccogliere lo spettro di assorbimento del complesso di leganti metallici. Successivamente, aggiungere una quantità stechiometrica di peptide alla soluzione complessa rame-fene e convogliare delicatamente su e giù per mescolare accuratamente facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria.
Quindi, incubare la soluzione per cinque minuti per raggiungere l'equilibrio. Rimettere la cuvetta nel supporto della cella del campione e registrare lo spettro di assorbimento. Successivamente, ripetere l'aggiunta di aliquote peptidiche nella soluzione complessa rame-fene per vari equivalenti e registrare il volume di peptide aggiunto in modo che la concentrazione diluita possa essere determinata.
Per prima cosa accendi ITC e avvia il software ITC per eseguire lo strumento. Dopo la prima inizializzazione, riposizionare la buretta e seguire le istruzioni sullo schermo. Quindi rimuovere la buretta e il coperchio dalla cella di riferimento.
Quindi, rimuovere l'acqua dalla cella di riferimento e risciacquare tre volte con 450 microlitri di acqua ultra pura degassata. Aspirare lentamente acqua ultra pura fino al segno di 450 microlitri di una siringa di carico facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nella siringa. Quindi inserire la siringa di carico nella cella di riferimento fino a quando non si trova a circa un millimetro dal fondo e iniettare lentamente parte della soluzione fino a quando rimangono 150 microlitri nella siringa di carico.
Successivamente, spostare rapidamente lo stantuffo della siringa di carico su e giù di circa 25 microlitri più volte per rimuovere eventuali bolle sulla superficie cellulare. Quindi iniettare lentamente fino a quando lo stantuffo raggiunge il segno di 100 microlitri sulla siringa di carico, erogando così un totale di 350 microlitri di acqua ultrapura nella cella di riferimento e sostituire il coperchio della cella di riferimento. Dopo aver rimosso qualsiasi soluzione residua dalla cella del campione, caricare 450 microlitri di EDTA 10 millimolari usando una siringa di carico e immergere per 10 minuti per assicurarsi che gli ioni di metalli in traccia vengano rimossi perché l'EDTA legherà i metalli in tracce.
Dopo aver rimosso la soluzione di EDTA, sciacquare accuratamente la siringa di carico con abbondanti quantità di acqua ultra pura. Pulire l'ITC secondo le indicazioni del produttore risciacquando la cella del campione con acqua ultra pura. Rimuovere l'acqua residua dalla cella campione e quindi condizionare la cella campione risciacquando con 450 microlitri di tampone almeno tre volte.
Quindi, rimuovere il tampone residuo che condiziona la cellula campione e caricare la soluzione peptidica nella cellula campione utilizzando la siringa di carico. Quindi sciacquare la siringa di titolazione con 200 microlitri di soluzione tamponata rimuovendo prima lo stantuffo. Utilizzando una micro pipetta, pipetta la soluzione tampone attraverso il foro nella parte superiore della siringa di titolazione di vetro attraverso la siringa ed fuori dall'ago sottostante.
Successivamente, inserire completamente lo stantuffo nella siringa di titolazione. Quindi immergere la punta dell'ago della siringa di titolazione nella soluzione metallica e tirare lentamente lo stantuffo verso l'alto facendo sì che la soluzione metallica riempia la siringa e provochi un volume vuoto nella parte superiore della parte di vetro della siringa di titolazione. Per rimuovere il volume del vuoto, ruotare la siringa di titolazione parallelamente al pavimento.
Quindi rimuovere lo stantuffo e inclinare leggermente la parte in vetro verso il pavimento. Agitare delicatamente la siringa di titolazione in modo che la soluzione si sposti nella parte in vetro della siringa di titolazione e riempia la maggior parte del volume del vuoto. Ma assicurati che rimangano da due a tre microlitri di volume vuoto.
Mantenendo la siringa parallela al pavimento, reinserire lo stantuffo. Quindi tenere la siringa di titolazione in posizione verticale e immergere nuovamente la punta dell'ago nella soluzione metallica. Quindi, spingere lo stantuffo verso il basso fino a quando l'aria cessa di uscire dall'ago e caricare la siringa di titolazione tirando lentamente verso l'alto lo stantuffo appena sopra il segno di 50 microlitri mantenendo la punta dell'ago nella soluzione.
Inserire con cautela la parte in vetro della siringa di titolazione nella buretta e avvitare fino a stringere le dita. Successivamente, utilizzando un tergicristallo delicato per impieghi leggeri, assorbire la soluzione che fuoriesce dalla siringa di titolazione a causa della compressione dello stantuffo senza toccare la punta dell'ago. Quindi, inserire la buretta con una siringa di titolazione nella cella del campione e fissarla saldamente.
Per impostare i parametri del software ITC, selezionare Instrument Control. Impostare la velocità di agitazione e la temperatura. Quindi, in Dettagli esperimento, immettere le concentrazioni della siringa e delle cellule in unità millimolari.
Successivamente, nella sezione Metodo esperimento selezionare Titolazione incrementale. Fare clic su Setup e specificare 20 iniezioni da 2,5 microlitri e se è richiesta una maggiore risoluzione per osservare l'evento di legame aumentare il numero di iniezioni e diminuire il volume per iniezione. Successivamente, immettere l'intervallo di tempo tra ogni iniezione in modo che sia abbastanza lungo da consentire al segnale di equilibrarsi e tornare alla linea di base, in genere 300 secondi.
Quindi fai clic sul pulsante Esegui per avviare l'esperimento e specificare dove salvare i dati. La titolazione di Cu(II) è stata eseguita in C-Peptide dimostrando che l'aggiunta di 150 micromolari di Cu(II) ha causato un aumento immediato della banda a 600 nanometri attribuita alla banda d-d di Cu(II) e ha continuato ad aumentare fino all'aggiunta di 300 millimolari Cu(II). Un'ulteriore aggiunta al di sopra di 300 micromolari Cu(II) non ha aumentato l'assorbimento del ban d-d che indica la saturazione e che Cu(II) si lega al peptide C in un complesso 1:1 con un valore K logaritmico superiore a sei.
Il peptide C è stato titolato in circa 10 complessi micromolari rame-fene e l'assorbimento dalla banda di trasferimento di carica a 265 nanometri è diminuito indicando che il peptide C era in grado di chelare Cu (II) dal ligando fenantropina con un valore K log da 7,4 a 7,8. Il termogramma ITC mostra la titolazione di 1,4 millimolari Cu(II) in 154 micromolari C-peptide in 15 millimolari tampone MOPS. L'affinità di legame è risultata avere un valore log K di otto con variazione di entalpia come 8 kilojoule per mole.
Energia libera di Gibbs come meno 46 kilojoule per mole, e variazione di entropia come 120 joule per mole per kelvin. Una titolazione controllata di 1,4 millimolari Cu(II) in tampone MOPS 15 millimolare in assenza di C-peptide non mostra alcun legame nel termogramma. Direi di assicurarsi che tutto sia pulito.
Se ci sono ioni metallici o peptidi rimasti da esperimenti precedenti, può influenzare drasticamente la stechiometria e fornire una competizione sconosciuta negli esperimenti di legame. Il dicroismo circolare è un altro metodo per studiare le interazioni tra peptidi metallici e proteine metalliche perché guarda alla chiralità. La spettrometria di massa può anche interrogare questi complessi osservando i cambiamenti di massa.
Questo insieme di tecniche è stato utilizzato da molti laboratori che studiano gli ioni metallici che interagiscono con peptidi o proteine.
