Questo protocollo descrive in dettaglio tutte le procedure sperimentali, dal tagging epitopico dei geni codificanti il fattore di trascrizione attraverso l'analisi computazionale dei dati, per eseguire la profilazione a livello di genoma delle interazioni di legame fattore di trascrizione-DNA in Candida albicans tramite CUT & RUN. Questa è una tecnica più accessibile, più veloce, più sensibile, meno costosa e fornisce dati di qualità superiore rispetto ai tradizionali approcci ChIP-chip e ChIP-seq. Sebbene il nostro protocollo sia sviluppato per le cellule di Candida albicans isolate da biofilm o colture planctoniche, dovrebbe essere pratico adattarlo praticamente a qualsiasi buona forma di cellule di Candida albicans.
Dopo aver incubato la sospensione cellulare, trasferire un'aliquota di cinque microlitri in un nuovo tubo PCR. A cinque microlitri di nuclei isolati e un'aliquota di cinque microlitri di cellule intatte precedentemente immagazzinate a quattro gradi Celsius, aggiungere un microlitro ciascuno di calcofluor-bianco e SYTO 13. Incubare a 30 gradi Celsius al buio per 30 minuti.
Ispezionare visivamente l'integrità e la purezza dei nuclei isolati utilizzando un microscopio a fluorescenza. Cercare nuclei isolati che mostrino una colorazione SYTO 13 prominente e assicurarsi che non vi siano macchie della parete cellulare dal colorante calcofluor-bianco. Ripetere l'ispezione con celle intatte come controllo per la colorazione della parete cellulare con colorante bianco calcofluor.
Posizionare i tubi su un rack magnetico e attendere che il liquame sia completamente pulito. Scartare il surnatante usando una pipetta. Aggiungere 50 microlitri del tampone anticorpale e mescolare delicatamente mediante pipettaggio.
Aggiungere tre microlitri dell'anticorpo policlonale anti-GFP ai tubi e incubare i tubi su un miscelatore nutating a 4 gradi Celsius per due ore. Centrifugare brevemente i tubi a 100 volte g a temperatura ambiente per cinque secondi e posizionare i tubi su un rack magnetico. Una volta che il liquame è chiaro, scartare il surnatante usando una pipetta.
Mentre i tubi con le perline sono ancora sul rack magnetico, aggiungere 200 microlitri di buffer di permeabilizzazione a celle ghiacciate direttamente sulle perline. Scartare il surnatante usando una pipetta. Ripetere due lavaggi con il tampone di permeabilizzazione delle cellule ghiacciate.
Aggiungere 50 microlitri di tampone di permeabilizzazione delle celle ghiacciate a ciascun tubo e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Aggiungere 2,5 microlitri della proteina AG-MNasi a ciascun campione e mescolare mediante pipettaggio. Posizionare i campioni su un miscelatore di nutating a 4 gradi Celsius e incubare i campioni per un'ora.
Centrifugare brevemente i tubi a strisce a 100 volte g a temperatura ambiente per cinque secondi, quindi posizionare i tubi su un rack magnetico. Una volta che il liquame è chiaro, scartare il surnatante usando una pipetta. Mentre i tubi con le perline sono ancora sul rack magnetico, aggiungere 200 microlitri di buffer di permeabilizzazione a celle ghiacciate direttamente sulle perline.
Scartare il surnatante usando una pipetta. Ripetere due lavaggi con il tampone di permeabilizzazione delle cellule ghiacciate. Aggiungere 100 microlitri del tampone di permeabilizzazione delle celle ghiacciate ai campioni e pipettare delicatamente su e giù cinque volte.
Rimuovere il gel cast dalla scatola di gel e aprire il gel cast secondo le istruzioni del produttore. Rimuovere delicatamente il gel dal gel cast e posizionarlo all'interno di un vassoio di contenimento del gel contenente 100 millilitri di TBE monoreduttore. Aggiungere 10 microlitri della macchia di gel di acido nucleico al vassoio e ruotare delicatamente.
Coprire con un foglio per proteggere dalla luce e incubare staticamente a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi risciacquare il gel due volte con 100 millilitri di acqua di rubinetto deionizzata. Immagine del gel sotto l'illuminazione a luce blu usando un coperchio del filtro ambra.
Per ogni libreria, tagliare il gel leggermente sopra la banda dimero dell'adattatore prominente della coppia di basi circa 125 e sotto il segno della scala della coppia di basi 400. Forare il fondo di un tubo da 0,65 millilitri utilizzando un ago calibro 22 e posizionare il tubo perforato all'interno di un tubo microfugo sterile da due millilitri. Trasferire la fetta di gel nel tubo forato all'interno del tubo di microfuga da due millilitri.
Centrifugare il tubo di microfuga da due millilitri contenente la provetta forata da 0,65 millilitri e prelevare il campione a 10.000 volte g a temperatura ambiente per due minuti per raccogliere il liquame di gel all'interno del tubo di microfuga da due millilitri. Aggiungere 300 microlitri di tampone di eluizione gel freddo al liquame gel. Mescolare su un nutatore a temperatura ambiente per un minimo di tre ore o durante la notte.
Trasferire tutti i liquami liquidi e gel in una colonna filtrante da 0,22 micrometri e centrifugare a 10.000 volte g a temperatura ambiente per un minuto. Scarica il codice sorgente per l'analisi CUT&RUN dalla pagina GitHub facendo clic sul pulsante verde Codice, seguito dall'opzione Scarica ZIP. Decomprimere la cartella in una posizione pertinente sul computer locale.
Installa Conda Environment ed eseguilo una sola volta. Una volta installato Conda, creare un ambiente virtuale fornito con il relativo comando. Attivare l'ambiente virtuale ogni volta che viene eseguito questo flusso di lavoro.
La digestione della parete cellulare e l'integrità nucleare sono state valutate visualizzando sia le cellule intatte di controllo che i nuclei isolati colorati con pareti cellulari fluorescenti e macchie di acido nucleico. In contrasto con i nuclei intatti isolati in cui non si osserva la colorazione della parete cellulare, sia i nuclei che le pareti cellulari sono etichettati in modo fluorescente nelle cellule di controllo intatte. La figura mostra le librerie CUT&RUN TF analizzate utilizzando uno strumento di elettroforesi capillare.
Le librerie CUT&RUN TF di successo sono arricchite per frammenti brevi di dimensioni inferiori a 200 coppie di basi. Le librerie CUT&RUN TF non ottimali mostrano l'arricchimento per frammenti di DNA di grandi dimensioni. La figura qui mostra che i motivi leganti il DNA Ndt80 sono arricchiti in tutti i loci legati a Ndt80 identificati da CUT & RUN, indicando che i picchi aggiuntivi identificati da questa metodologia sono probabilmente siti legati a Ndt80 in buona fede.
L'analisi comparativa ha indicato che il protocollo CUT&RUN ha identificato la maggior parte degli eventi di legame precedentemente noti per Ndt80 ed Efg1 durante la formazione del biofilm. Nel complesso, sia Ndt80 che Efg1 legati ai loci si sovrappongono ai dati ChIP di precipitazione immunitaria della cromatina precedentemente pubblicati e sono identificati solo utilizzando cut&RUN. Ci consente di aumentare significativamente la portata e il ritmo della nostra ricerca incentrata sulle reti regolatorie trascrizionali e sulla Candida albicans.
