Questo protocollo dimostrerà l'implementazione e l'ottimizzazione della microscopia SRS a focalizzazione spettrale e come può essere utilizzata per applicazioni di istologia Raman stimolate in tempo reale. Il vantaggio principale di questa tecnica è la velocità con cui i campioni possono essere elaborati una volta che la strumentazione è correttamente allineata, poiché SRS non richiede la lavorazione e la colorazione dei tessuti. Questo protocollo è applicabile ad altre applicazioni SRS, non solo limitate all'istologia.
Tali applicazioni includono piccole molecole, farmaci, cellule e tessuti. Inizia installando una coppia di lenti acromatiche per il raggio della pompa per ingrandire le dimensioni del raggio laser di due volte come punto di partenza. Posizionare un obiettivo da 100 e 200 millimetri a circa 300 millimetri l'uno dall'altro.
Quindi allineare il fascio della pompa attraverso il centro di entrambe le lenti. Quindi posizionare uno specchio dopo la seconda lente per inviare il raggio verso una parete a più di un metro di distanza. Traccia il raggio dallo specchio alla parete con una scheda IR e controlla se il raggio cambia di dimensioni.
Collimare il raggio se il raggio cambia di dimensioni in funzione della distanza. Combina i due raggi laser installando uno specchio dicroico con diversi specchietti dello sterzo per la regolazione. Ottimizza la sovrapposizione spaziale della pompa e di Stokes monitorando i fasci dopo lo specchio dicroico in due diverse posizioni a circa un metro di distanza.
Regolare iterativamente lo specchietto retrovisore dello sterzo seguito dallo specchio dicroico per allineare il fascio stokes con il fascio della pompa. Assicurarsi che i raggi combinati vengano inviati al centro degli specchi di scansione del microscopio a scansione laser regolando una coppia di specchi sterzanti quando gli specchietti retrovisori sono parcheggiati. Dopo il condensatore, utilizzare un'altra coppia di lenti con lunghezze focali di 100 millimetri e 30 millimetri, rispettivamente, per trasmettere il fascio trasmesso sul fotodiodo, assicurando che entrambi i fasci siano contenuti all'interno del fotodiodo.
Quindi installare due filtri passa-basso per bloccare il fascio di Stokes modulato. Posiziona un campionatore di fascio nel percorso del fascio di Stokes per raccogliere il 10% del raggio e inviarlo a un fotodiodo veloce per rilevare il treno di impulsi da 80 megahertz. Prendi una delle uscite del buffer fanout e filtrala con un filtro passa banda per ottenere un'onda sinusoidale di 20 megahertz.
Quindi utilizzare un attenuatore RF per regolare il picco di uscita alla tensione di picco a circa 500 millivolt. Inviare l'uscita risultante a uno sfasatore, che consente la regolazione fine della fase RF con una sorgente di tensione. Inviare questa uscita a un amplificatore di potenza RF e collegare l'uscita dell'amplificatore all'EOM.
Dopo aver sbloccato il fascio di Stokes, ottimizzare la profondità di modulazione del primo EOM posizionando un fotodiodo nel percorso del fascio. Regolare la tensione EOM e la piastra a quarto d'onda fino a quando la profondità di modulazione appare soddisfacente. Posizionare un fotodiodo dopo lo specchio dicroico per rilevare il raggio laser.
Blocca prima il raggio di Stokes, quindi ingrandisci uno dei picchi di impulso della pompa sull'oscilloscopio. Posizionare un cursore verticale per contrassegnare la posizione temporale di questo picco con l'oscilloscopio. Ora blocca il raggio della pompa e sblocca il raggio di Stokes.
Tradurre la fase di ritardo in modo che corrisponda temporaneamente alle posizioni di picco sull'oscilloscopio alla posizione contrassegnata nel passaggio precedente. Calcolando la distanza di ritardo necessaria per abbinare i due raggi seguita dall'allungamento del percorso del raggio del raggio più veloce o accorciando il percorso del raggio più lento. Quindi preparare un campione di vetrino per microscopio con DMSO e nastro biadesivo come distanziatore per tenere il campione tra il vetrino e un coperchio.
Posizionare il campione sul microscopio con il lato coverslip rivolto verso l'obiettivo del microscopio e osservare il campione dal pezzo I sotto illuminazione a campo luminoso. Trova il fuoco del campione sia nello strato superiore che in quello inferiore delle bolle d'aria all'interfaccia del nastro di vetro, quindi sposta lo stato attivo in modo che si trovi tra i due strati del nastro. Quindi impostare l'uscita del fascio sintonizzabile a 798 nanometri.
In base alla portata ottica del condensatore, regolare la potenza ottica in modo che sia di circa 40 milliwatt ciascuno per la pompa e i fasci di Stokes al fuoco dell'obiettivo. Quindi apri l'immagine di scansione in MATLAB e fai clic sul pulsante con l'etichetta focus per avviare la scansione. Regolare lo specchietto retrovisore prima dello scanner galvo per centrare il segnale DC sul display del canale uno.
Spostare lo stadio di ritardo motorizzato e osservare da vicino l'uscita di blocco mostrata sul display a due canali. Infine regola il ritardo temporale per massimizzare l'intensità del segnale CA. Regolare lo specchio dicroico per centrare il segnale SRS sul canale CA.
Quindi regolare la fase dell'amplificatore lock-in per massimizzare il segnale. Dopo aver montato il vetrino del campione sul microscopio e regolato la potenza di entrambi i fasci a circa 40 milliwatt ciascuno a fuoco del campione, come dimostrato in precedenza. Apri l'immagine di scansione da MATLAB.
Quindi trova il segnale SRS massimo scansionando attraverso lo stadio di ritardo corrispondente al picco Raman di 2.913 centimetri inversi di DMSO. Acquisire un'immagine SRS corrispondente al picco Raman di 2.913 centimetri inversi di DMSO. Aprite l'immagine in ImageJ e selezionate una piccola area al centro della cornice.
Utilizzare la funzione di misura per calcolare la deviazione media e standard dei valori nell'area selezionata. Per la calibrazione dell'accesso alla frequenza, salvare una scansione iperspettrale con l'intervallo dello stadio di ritardo che copre i picchi Raman di 2, 913 e 2. 994 centimetri inversi di DMSO. Quindi salvare le posizioni dello stage corrispondenti al set di dati iperspettrali.
Eseguire la regressione lineare per le posizioni dello stadio e gli spostamenti Raman a 2, 913 e 2. 994 centimetri inversi. Utilizzando l'equazione di regressione lineare, convertire le posizioni di ritardo nelle frequenze Raman corrispondenti. Per la calibrazione della risoluzione spettrale, stimare la posizione dello stadio in base alla posizione precedente con la maggiore lunghezza del percorso ottico dovuta all'inserimento di aste.
Riallineare la sovrapposizione spaziale delle travi a causa della leggera deviazione della trave quando vengono aggiunte aste di vetro. Installare uno splitter del fascio polarizzante, una piastra a quarto d'onda e un secondo EOM nel percorso del fascio di soaks dopo il primo EOM. Scollegare l'ingresso del segnale al secondo EOM, quindi collegare l'ingresso del segnale al primo EOM e accenderlo.
Modula il fascio di Stokes a 20 megahertz inviando il raggio attraverso il primo EOM. Regola l'inclinazione e la posizione del primo EOM per assicurarti che il raggio sia centrato attraverso il cristallo EOM. Preparare un campione di vetrino con nastro biadesivo, vetrino per microscopio e vetro di copertura.
Posizionare il campione sul microscopio con il lato coverslip rivolto verso l'obiettivo del microscopio. Per l'imaging SRS in modalità epi, installare una piastra a mezza onda prima che il fascio entri nel microscopio per modificare la polarizzazione del fascio che entra nel microscopio. Posizionare uno splitter del fascio polarizzante sopra l'obiettivo per consentire al fascio riflesso posteriore depolarizzato di raggiungere il rilevatore.
Successivamente, utilizzare una lente acromata da 75 millimetri e una lente asferica da 30 millimetri per trasmettere i fotoni sparsi sul retro dall'apertura posteriore dell'obiettivo al fotorilevatore. Montare il rilevatore per raccogliere la luce diffusa posteriore diretta dallo splitter del fascio polarizzante. Quindi installare un filtro per impedire al fascio modulato di entrare nel rilevatore.
La variazione delle lunghezze dell'asta influisce sulla risoluzione spettrale. Quando non vengono utilizzate aste di cinguettio del vetro, i due picchi Raman di DMSO non vengono risolti affatto. Un aumento del numero di aste di cinguettio del vetro inizia a risolvere i due picchi in un punto soddisfacente.
Il cinguettio abbinato risolve entrambi i picchi e può essere utilizzato per calibrare le posizioni dello stadio in base alla frequenza. Due treni di impulsi ritardati di polarizzazione ortogonale utilizzati per visualizzare spettri DMSO mostrano il ritardo temporale tra le eccitazioni SRS con profondità di modulazione accettabile e separazione temporale. Al contrario, uno scarso sfasamento SRS a due colori, dà origine a picchi invertiti o negativi.
Qui vengono mostrate immagini SRS a due colori in tempo reale a 2, 850 e 2.930 centimetri inversi di tessuto cerebrale di topo ex vivo. Le immagini lipidiche e proteiche grezze sono state codificate a colori per produrre una singola immagine raffigurante i contributi lipidici e proteici. False ematossilina e ricolorazione dell'eosina, sono state eseguite anche per imitare la colorazione di ematossilina ed eosina per applicazioni patologiche.
La sovrapposizione temporale spaziale e l'ottimizzazione della risoluzione spaziale sono i passi più importanti per l'approccio di messa a fuoco spaziale di SRS. Questo metodo è generalmente applicabile per altri esperimenti di microscopia a sonda a pompa come la microscopia ad assorbimento transitorio. Il metodo consente anche l'imaging di molecole non fluorescenti nelle cellule e nei tessuti.
Il metodo qui presentato accelera il tempo di acquisizione delle immagini per la futura traduzione dell'istologia Raman stimolata nella clinica.
