Quello che abbiamo introdotto oggi è un metodo semplificato modificato e chirurgicamente efficiente, per stabilire l'ischemia dell'arto posteriore nei topi ApoE. Questo metodo può essere implementato in qualsiasi struttura per animali. Il principale vantaggio del metodo sinoviale è una bassa invasività, utilizzando un'incisione inferiore a cinque millimetri.
Il metodo ha un hof di apprendimento. Consigliamo quindi di esercitarsi sui modelli microchirurgici prima di lavorare sugli animali, che saranno inclusi nell'analisi finale. Il metodo sarà dimostrato da Kaixuan Yan, un dottore in medicina e lo studente del mio laboratorio.
Inizia preparando le attrezzature e gli strumenti necessari per l'intervento chirurgico. Dopo aver somministrato l'anestesia al topo, applicare quell'unguento sugli occhi per prevenire la secchezza. Quindi posizionare il mouse su una piastra riscaldante per mantenere la temperatura corporea interna a circa 37 gradi Celsius.
Utilizzando un batuffolo di cotone e una crema per la depilazione, rimuovere con cura i peli dalla pelle degli arti posteriori sul lato destro. Posare il mouse in posizione supina sulla piastra riscaldante sotto un microscopio di dissezione. Utilizzare l'alcol per disinfettare la pelle e pulire con il cotone lontano dal lato vegetale dell'incisione.
Usando la pinza appuntita e le forbici chirurgiche fare un'incisione di circa tre o quattro millimetri nel mezzo della regione inguinale. Rimuovere con attenzione il tessuto adiposo sottocutaneo con l'aiuto di pinze appuntite per esporre il fascio neurovascolare femorale prossimale. Utilizzando un batuffolo di cotone inumidito con soluzione salina, spostare con attenzione l'arteria femorale lontano dal nervo femorale e dalla vena femorale.
Quindi utilizzando la punta di una sutura 7.0, perforare attentamente la membrana della guaina femorale. Quindi passare a suture assorbibili 7-0 attraverso l'arteria femorale prossimale e fare doppi nodi usando le forbici a molla. Successivamente transettare l'arteria femorale tra i due legami.
Passare la sutura assorbibile 6-0 attraverso il bordo inferiore dell'incisione e trascinare delicatamente l'incisione nella regione del lato destro del ginocchio dell'arto posteriore per esporre l'arteria femorale distale. Spostare con attenzione il tessuto sottocutaneo da parte per esporre il fascio neurovascolare. Sezionare l'arteria femorale dalla vena femorale e dal nervo femorale e utilizzare il cotone per proteggere il nervo.
Quindi, utilizzando la punta di una sutura 7.0, perforare la membrana della guaina femorale. Passare due suture assorbibili 7-0 attraverso l'arteria femorale distale e fare doppi nodi usando le forbici a molla per transettare l'arteria femorale tra due legami. Successivamente, cucire l'incisione usando le suture riassorbibili 6-0.
Posizionare il mouse su una piastra riscaldante in una gabbia pulita e continuare a monitorare i suoi parametri vitali fino al recupero. Determinare il successo della doppia legatura dell'arteria femorale o DLFA il giorno successivo tramite risonanza magnetica. Prima della procedura DLFA, i pesi dei topi variavano da 29,6 a 38,0 grammi.
Sette giorni dopo l'intervento chirurgico DLFA, i pesi variavano da 26,5 a 34,1 grammi, significativamente inferiori ai pesi pre-DLFA. Le regioni prossimale e distale della FA destra non hanno mostrato alcuna perfusione. I risultati della scala di Tarlov sono stati significativamente ridotti un giorno dopo l'intervento chirurgico.
Sebbene siano aumentati lentamente nei giorni successivi, erano ancora inferiori al basale fino al settimo giorno. Le zampe degli arti posteriori ischemici in sette topi non erano in grado di allungarsi naturalmente rispetto al lato controlaterale. Inoltre, quattro dei topi hanno mostrato un leggero scolorimento delle zampe rispetto al lato controlaterale.
La colorazione H&E del muscolo GM destro ha rivelato miofibre che mostravano necrosi ischemica irregolare, in cui le cellule satelliti proliferanti avevano sostituito le miofibre necrotiche e sono state distribuite in massa o con una dispersione regolare. Le miofibre che mostravano infiltrazioni infiammatorie da parte di macrofagi multinucleati avevano perso le loro normali caratteristiche morfologiche, con pochissime miofibre rigenerate presenti. Le sezioni trasversali di queste miofibre rigenerate erano rotonde.
Il citoplasma era macchiato di rosso e un piccolo nucleo o più nuclei si trovavano al centro. Tuttavia, questo tipo di modello infiammatorio non è stato osservato nel GM sinistro. La colorazione degli anticorpi CD31 eseguita per osservare la densità microvascolare, ha indicato che gli arti posteriori ischemici hanno mostrato una densità microvascolare significativamente maggiore rispetto al lato non ischemico. La cosa più importante è la dissezione dell'arteria femorale.
L'operatore deve avere esperienza nelle tecniche microchirurgiche e avere familiarità con l'anatomia degli arti posteriori del topo. In linea di principio, questo metodo potrebbe anche essere utilizzato per studiare la lesione da ischemia-riperfusione nella gamba. In questo modo, l'arteria può essere occlusa con un morsetto morbido prima di consentire la riperfusione.
