Gli xenografti Zebrafish sono ampiamente utilizzati per la ricerca sul cancro. Puoi prendere cellule tumorali umane e iniettarlo in piccole larve zebrafish, o anche negli adulti. Qui, quello che stiamo presentando è un protocollo passo-passo del modello larva, in cui possiamo studiare diversi segni distintivi del cancro umano in un animale vivente.
Si può studiare la proliferazione, si può studiare l'angiogenesi, si può studiare la metastasi, e anche le interazioni all'interno del microambiente tumorale. E un grande vantaggio è che si può studiare questo in un lasso di tempo molto breve. Solo quattro giorni, per esempio.
Un altro grande vantaggio è che puoi studiarlo dal vivo con una risoluzione a cella singola, usando un microscopio confocale o un microscopio a fogli luce. È possibile studiare come le cellule migrano, come le cellule interagiscono tra loro o anche come parlano tra loro. Quindi è un modello davvero potente per studiare la biologia del cancro.
Gli xenograft Zebrafish possono essere utilizzati per studiare la risposta alle terapie anti-cancro, come la chemioterapia, la radioterapia o persino terapie mirate con anticorpi. E infine, anche questo protocollo può essere adattato per usare cellule derivate dal paziente da un campione chirurgico, o anche da biopsie, e quindi generare gli avatar zebrafish. Impostazione per l'iniezione.
Due settimane prima dell'iniezione, espandere le cellule in coltura. Inizia con le cellule in eccesso e il pesce in eccesso fino a diventare abile con la tecnica, poiché molte cellule e pesci andranno persi durante l'allenamento. La tabella uno del PDF di accompagnamento ha una guida dettagliata delle percentuali ottimali di confluenza in vitro per l'iniezione di diverse linee cellulari.
Tre giorni prima dell'iniezione, attraversare il pesce zebra dello sfondo desiderato. 24 ore prima dell'iniezione. Pulire le piastre embrionale zebrafish.
Scartare tutti gli embrioni morti e non sviluppati e rinfrescare il mezzo E3. Nella stanza delle impostazioni cultura delle celle, scartare il mezzo di coltura cellulare. Lavare una volta con PBS 1X per rimuovere le cellule morte e aggiungere mezzo fresco.
Preparare gli strumenti per la procedura di iniezione, come aghi di microiniezione, piastre di agarosio e forcine per allineare gli embrioni per l'iniezione. Per la preparazione del piatto, versare uno strato di 2%agarosio sciolto nel coperchio di una piastra di Petri pulita. Lascia che polimerizzi e con l'aiuto di un righello, crea da tre a quattro linee di agarosio dritte per l'allineamento degli embrioni.
Giorno dell'iniezione. Separare gli embrioni nati dalle uova non odiate. L'aggiunta di Pronasi al mezzo embrione in questa fase può aumentare la schiusa.
Posizionare gli embrioni nell'incubatrice a 28 gradi Celsius fino all'iniezione. Etichettatura cellulare per iniezione. Per facilitare la definizione di una tecnica di etichettatura delle celle riproducibile, controllare le tabelle uno e due del protocollo scritto per la compilazione di un elenco di linee cellulari e di diverse soluzioni di etichettatura.
Rimuovere il mezzo di coltura cellulare e lavare il pallone due volte con PBS 1X. Etichettare le cellule con un colorante lipofilo, evitando l'esposizione alla luce, e incubare il pallone a 37 gradi. È inoltre possibile scegliere di etichettare le celle in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml al momento del distacco.
Rimuovere la soluzione di etichettatura cellulare e lavare le celle con PBS 1X per esezione del colorante in eccesso. Aggiungere l'agente di distacco corrispondente e incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Facilitare il processo di distacco spazzolando il pallone con un raschietto sterile e raccogliere le cellule con una pipetta sierologica.
Trasferire le celle in tubi di microcentrifugo da 1,5 ml e centrifuga. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet con il mezzo di coltura cellulare. Quantificare la vitalità cellulare usando una camera Neubauer con esclusione blu tripano o altro metodo di scelta.
Centrifugare e sospendere di nuovo le cellule nel mezzo di iniezione. Le concentrazioni raccomandate di cellule in mezzo possono essere trovate nella tabella uno del manoscritto. Da questo punto in poi, le cellule devono essere tenute sul ghiaccio.
Procedure di iniezione. Anestetizzare gli embrioni in tricaina 1X per 5 minuti. Quindi, trasferire una piccola quantità di embrioni anestetizzati su una piastra di agarosio e allinearli con l'aiuto di un anello di forcine.
Assicurarsi di mantenere la distanza tra gli embrioni. Soprattutto tra il tuorlo di uno e la testa del prossimo. Per prevenire la mortalità, assicurarsi che gli embrioni allineati non si asciughino nella piastra di agarosio aggiungendo con cura una o tre gocce di soluzione di tricaina 1X alla piastra.
Toccare leggermente il tubo di microcentrifugo per sospendere di nuovo le celle. Ricaricare l'ago di iniezione con una sospensione cellulare utilizzando una punta microloader, evitando bolle d'aria, in quanto possono compromettere l'integrità degli embrioni. Aprire la valvola di pressione dell'aria, impostare il microiniettore e posizionare con cura l'ago di microiniezione nel supporto.
Tagliare l'ago di microiniezione vicino alla punta. Perforare con cura il tuorlo dell'embrione, abbassando l'angolo dell'ago e spingendo cautamente fino a quando la punta dell'ago raggiunge lo spazio perivitellino. Una volta che la punta è nello spazio perivitellino, iniettare le cellule.
Cerca di iniettare un volume di cellule simile alle dimensioni dell'occhio dell'embrione e, per quanto possibile, dal cuore per prevenire l'edema cardiaco. Regolare la pressione del microiniettore, se necessario. Trasferire gli embrioni iniettati in una piastra di Petri pulita con soluzione di tricaina 1X e lasciarli riposare per cinque o 10 minuti.
Questo darà alla ferita il tempo di chiudere. Rimuovere la soluzione di tricaina 1X e aggiungere un mezzo E3 fresco. Quindi, incubare gli embrioni a 34 gradi Celsius.
Questa temperatura consentirà la sopravvivenza sia degli embrioni di zebrafish che delle cellule tumorali umane. Saggio metastatico. Se volete studiare il potenziale metastatico delle vostre linee cellulari, a circa un'ora dopo l'iniezione, vengono proiettati gli embrioni iniettati su uno stereomicroscopio a fluorescenza e ordinarli in due gruppi in base all'assenza o alla presenza di cellule tumorali in circolazione.
Un giorno dopo l'iniezione. Su uno stereomicroscopio a fluorescenza, analizzare attentamente ogni embrione e selezionare quelli con tumori correttamente iniettati. Ordinare gli xenoinnesti selezionati in base alle dimensioni del tumore.
Utilizzare la dimensione dell'occhio per il confronto. Scartare tutti gli embrioni con morfologia anomala, edema cardiaco o tuorlo, xenoinnesti con pochissime cellule tumorali o quelli con cellule tumorali solo all'interno del tuorlo. Distribuire gli xenoinnesti in base al layout sperimentale desiderato e iniziare il test del farmaco.
Sostituire i farmaci e E3 media ogni giorno. Incubare gli xenoinnesti, mantenendo la temperatura di 34 gradi Celsius fino alla fine del saggio. Quattro giorni dopo l'iniezione.
L'ultimo giorno del saggio, anestetizza gli xenoinnesti con la soluzione tricaina 1X e allineali attentamente sulla piastra di agar. Scartare eventuali xenoinnesti morti o gonfi. Questi xenoinnesti non sono considerati per la quantificazione dell'innesto.
Su uno stereomicroscopio a fluorescenza, analizzare attentamente ogni xenograft e valutare l'assenza o la presenza di tumori nello spazio perivitellino. Secondo l'impostazione sperimentale, selezionare gli xenoinnesti di interesse ed eutanasiarli con tricaina 25X. Fissarli in formaldeide al 4% per almeno 4 ore a temperatura ambiente per procedere con l'immunosocienza.
Altrimenti, conservare durante la notte a quattro gradi Celsius e il giorno successivo sostituire la formaldeide con il 100% di metanolo. Gli xenoinnesti fissati al 100% di metanolo possono essere conservati a 20 gradi indefinitamente. Immunostaining a montaggio intero per l'imaging confocale.
L'intera tecnica di immunofluorescenza del supporto richiede tre giorni, così ripartiti. Il primo giorno è per la permeabilizzazione degli xenoinnesti e l'incubazione degli anticorpi primari. Il secondo giorno, per il lavaggio e l'incubazione secondaria degli anticorpi.
E il terzo giorno, per il lavaggio, la fissazione degli xenoinnesti e lo stoccaggio nel mezzo di montaggio. Maggiori dettagli di questa procedura sono disponibili nel PDF di accompagnamento. Montaggio di xenoinnesti.
Sigillare i bordi di un coperchio scivolare con vaselina o grasso siliconico, in modo che il mezzo di montaggio non perda. Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire gli xenoinnesti allo scivolo del coperchio. Allinearli con cura con un tornante.
Aggiungere il supporto di montaggio a un altro coperchio. Unire con cura entrambi i coperchi e posizionarli sopra una diapositiva del microscopio per consentire una manipolazione più semplice. Imaging confocale.
Una lente obiettivo ad immersione 25X apocromatica con correzione dell'acqua è ottimale per l'imaging di tumori con una risoluzione a singola cellula. Acquisire i campioni utilizzando la funzione Z-Stack con un intervallo di cinque micron tra ogni fetta. Aprire i dati grezzi nel software Fiji.
Selezionare tre fette rappresentative del tumore dall'alto, dal centro e dal basso, per z-stack, per xenograft. Aprire il plug-in Contatore celle dal software Fiji. Nello strumento Contatore celle fare clic su Inizializza, selezionare un tipo di contatore e fare clic sull'immagine per avviare manualmente la modalità di conteggio.
Per ogni clic, il contatore chiede quante celle vengono conteggiate. Per ottenere il numero totale di cellule nel tumore, utilizzare la seguente formula. Per valutare il numero totale o la percentuale di marcatori, come cellule immunitarie, figure mitotiche, caspasi attivata, tra gli altri, quantificare manualmente le cellule positive all'etichettatura specifica, al marcatore o al transgene di interesse lungo tutte le fette dello z-stack con il plug-in Contatore di cellule.
Tenere presente che alcune celle si trovano tra due sezioni. Andare avanti e indietro nello stack Z per assicurarsi che nessuna cella venga conteggiata due volte. Risultati rappresentativi.
Gli xenograft della linea di cellule tumorali colorettali HCT 116 sono stati generati come descritto nel protocollo. Gli xenoinnesti sono stati distribuiti casualmente in controlli non trattati e chemioterapia FOLFIRI. L'immunofluorescenza è stata eseguita per rilevare le cellule apoptotiche, utilizzando anticorpi anti-cleaved caspasi-3 e DAPI per la controsottenimento nucleico.
La quantificazione dell'indice mitotico, dell'apoptosi e delle dimensioni del tumore, ha rivelato che FOLFIRI induce una significativa diminuzione della mitosi e una significativa induzione dell'apoptosi, accompagnata da una riduzione del 54% delle dimensioni del tumore. Queste caratteristiche sono utili negli schermi dei farmaci fenotipici ad alta produttività, nonché per testare gli effetti intrinseci e fisiologici cellulari di diversi trattamenti oncologici in un breve lasso di tempo. Un altro grande vantaggio del modello di xenoinnesto zebrafish è che è possibile studiare le interazioni di diverse cellule tumorali e analizzare come ogni tipo di cellula può influenzare il comportamento dell'altra.
Diverse cellule tumorali umane, cloni diversi dallo stesso tumore, o da tumori diversi, possono essere co-iniettati. In questo esempio, due linee cellulari di cancro colorettale derivate dallo stesso paziente sono state etichettate con diversi coloranti lipofili e mescolate in un rapporto uno a uno per iniezione. Speriamo che questo protocollo possa aiutare i ricercatori a diventare veri esperti nella generazione di xenografti zebrafish.
Non è facile. Devi esercitarti, esercitarti. Non arrenderti.
Sono sicuro che ci andrai. Buona Fortuna.
