Questo metodo viene utilizzato per studiare i recettori dei coni che sono essenziali per la visione della luce del giorno. Il vantaggio dei metodi è che utilizza uova di gallina fecondate, che sono facilmente accessibili, e una delle uniche fonti di colture primarie di coni. Il protocollo è stato utilizzato per identificare rod-derived cone viability factor, un futuro trattamento promettente per la degenerazione retinica ereditata.
Inoltre, il protocollo è stato utilizzato per studiare il metabolismo del fotorecettore a cono. Seguendo attentamente il protocollo descritto, un individuo la cui esperienza è nella coltura delle cellule primarie, dovrebbe essere in grado di ottenere una cultura arricchita di cono dopo pochi tentativi. Inizia raccogliendo uova fecondate settimanali da un vivaio industriale.
Mantenere le uova fecondate a 17 gradi Celsius in laboratorio. Per ogni coltura, incubare sette uova fecondate per 24 ore a 20 gradi Celsius, e poi 136 ore a 37 gradi Celsius in una camera umidificata con reversione intermittente dell'inclinazione. Per recuperare gli embrioni di pollo, lavare la superficie delle uova con disinfettante, rompere il guscio d'uovo facendo un buco nella parte superiore del guscio con grandi pinze dritte, quindi tagliare il guscio per rimuovere il cappello dall'uovo.
Estrarre delicatamente ogni embrione dal guscio d'uovo con forcelle curve e trasferirlo in una piastra di Petri contenente PBS sterile precedentemente riscaldato a 37 gradi Celsius. Rimuovere con cura l'involucro che circonda gli embrioni. Verificare lo stadio di sviluppo di ogni embrione mediante confronto visivo con Hamburger e Hamilton e selezionare due embrioni nella 29a fase di sviluppo Enucleare gli occhi di questi embrioni selezionati e trasferirli in mezzo indipendente dall'anidride carbonica.
Lavorando in mezzo indipendente dall'anidride carbonica, posizionare quattro occhi con la cornea rivolta verso il basso e il nervo ottico rivolto verso lo sperimentatore. Praticare un foro nel nervo ottico usando due forcette dritte. Inserire un ramo di ogni forcep tra la retina e l'epitelio pigmentato, quindi tirare e ruotare l'occhio per staccare l'epitelio dalla retina.
Rimuovere la cornea, seguita dalla lente e dal vitreo. Trasferire le quattro retine in una piastra di Petri contenente il mezzo di Ringer a pH 7.2. Tagliare le quattro retine in pezzi molto piccoli usando due pinze dritte e lavare i pezzi due volte con il mezzo di Ringer.
Dopo il secondo lavaggio, lasciare cadere i pezzi di retina sul fondo del tubo e rimuovere il supporto. Trattare i pezzi della retina con una soluzione di triptina per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo 20 minuti, interrompere la reazione aggiungendo mezzi di coltura integrati con siero di vitello fetale inattivato al 10%.
Incubare la sospensione cellulare con 0,05 mg di DNasi 1 Quindi dissociare immediatamente i grappoli cellulari e il DNA tubando su e giù con una pipetta. Lavare la sospensione cellulare retinica due volte con un mezzo di coltura definito chimicamente o CDM. Trattare due piastre di coltura nere da 96 po 'con un fondo trasparente con polilisina per due ore a 37 gradi Celsius.
Al termine, sciacquare i piatti due volte con il mezzo di coltura M199. Aggiungere il blu di Trypan a un'aliquota di 10 microlitri della sospensione cellulare per macchiare le cellule viventi. Quindi aggiungere il campione di sospensione cellulare a un emocitometro.
Dopo aver contato le cellule, portare la sospensione cellulare alle concentrazioni appropriate utilizzando CDM. Aggiungere 50 microlitri della libreria di molecole da migliorare utilizzando un modello predefinito. Semina i 50 microlitri delle sospensioni a due celle nelle due piastre di coltura nere pretrattate da 96 pozzi.
Distribuire le celle nelle piastre con una pipetta multicanale da destra della piastra a sinistra, omogeneizzando tra ogni colonna. Quindi incubare le piastre per sette giorni a 37 gradi Celsius, sotto il 5% di anidride carbonica senza alcun cambiamento di media. Per contare le cellule vitali, aggiungere 2,7 calcein micromolare AM e 0,3 omodimero di etidio millimolare ad ogni pozzo della piastra.
Incubare le piastre per un'ora a temperatura ambiente in assenza di luce. Leggere la fluorescenza su un lettore automatico di lastre composto da un microscopio invertito dotato di una lampada a mercurio con due filtri di eccitazione a 485 e 520 nanometri, due filtri di emissione a 520 e 635 nanometri e una fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica. Questo protocollo è stato utilizzato per schermare una libreria cDNA normalizzata fatta di epitelio pigmentato coroide e retinico da 400 occhi di un ratto long-evans di otto settimane.
Un totale di 2.112 set di 100 cloni corrispondenti a 211.200 singoli cloni sono stati valutati. Tra i 42 pool di cloni con un rapporto maggiore di due, i pool 0080 e 0073 avevano un rapporto di vitalità 16 e 14 volte superiore al controllo negativo dopo sette giorni di coltura. Ognuno selezionato di 100 cloni era suddiviso in 16 set di 10 cloni dal loro stock di glicerolo.
Il sotto pool 0073-09 ha dato il più forte rapporto di vitalità ed è stato suddiviso per produrre 16 cloni individuali che sono stati testati in un terzo ciclo di screening su colture arricchite di coni. Il clone 0073-09-37 si è distingueto con un rapporto di vitalità di 2,5. Ulteriori analisi hanno confermato che questo clone ha un effetto robusto e riproducibile sulla sopravvivenza del cono.
La prova è stata ripetuta in modo indipendente e l'inserto di 1,8 kilobase è stato sequenziato. Un'analisi bioinformatica ha rivelato che il clone 0073-09-37, che è stato chiamato Epithelium Derived Cone Viability Factor, o EdCVF contiene tre fotogrammi di lettura aperti. Se testato in modo indipendente, solo ORF1 ha esercitato un effetto protettivo sui coni.
L'ORF1 è stato prodotto come proteina glutatione S-transferasi. Il fattore di vitalità del cono derivato dall'epitelio è stato purificato e il tag GST è stato rimosso. L'analisi dell'attività trofica ha dimostrato che EdCVF è in grado di prevenire la degenerazione del cono nel sistema di coltura arricchito di coni.
Quando si tenta questa procedura, lo stadio di sviluppo degli embrioni dovrebbe essere attentamente controllato al fine di ottenere le colture arricchite di coni. Seguendo questo protocollo, le cellule possono essere elettroporate con DNA plasmide per studiare i meccanismi molecolari di qualsiasi fattori di sopravvivenza come RdCVF. Questa tecnica apre la strada alla ricerca metabolica, compreso lo sviluppo di modelli matematici di sopravvivenza del cono.
