Questo protocollo quantifica la metastasi polmonare, che è una causa aggressiva e comune di morte correlata al cancro al seno, con maggiore precisione ed efficienza in un modello di cancro al seno preclinico. Rispetto alla tecnica originale, questo protocollo offre ai ricercatori risultati più rapidi e coerenti. Allevia l'errore di conteggio umano attraverso la tecnologia informatica facile da usare.
Questa tecnica può assolutamente essere estesa alla ricerca preclinica studiando gli effetti delle terapie contro il cancro al seno sulla metastasi polmonare consentendo ai ricercatori di dimostrare una diminuzione del carico metastatico dopo un trattamento di successo. Iniziare etichettando un tubo conico da 15 millilitri per il campione di tessuto. Quindi aggiungere 2,5 millilitri di tipo quattro miscela di collagenasi e 30 unità di elastasi al tubo.
Spostare bene il polmone in un PO 'di HBSS 1X pulito e ruotarlo con le forcep per rimuovere il sangue rimanente, quindi trasferirlo su una piastra di coltura tissutale vuota di 3,5 centimetri. Tritare il polmone con le forbici, quindi sciacquare il piatto con 2,5 millilitri di HBSS e trasferire l'HBSS con i pezzi polmonari in un tubo conico preparato da 15 millilitri con il cocktail di collagenasi ed elastasi. Incubare il tubo per 75 minuti a quattro gradi Celsius su un rocker o una ruota rotante.
Nel frattempo, etichettare un tubo di centrifuga da 50 millilitri e una piastra di coltura tissutale da 10 centimetri per ogni topo. Se si fa una diluizione, etichettare abbastanza piastre di coltura tissutale per le diluizioni. Portare il volume del tubo fino a 10 millilitri con 1X HBSS, quindi versare il contenuto su un filtro a celle da 70 micrometri nel tubo conico da 50 millilitri.
Utilizzare lo stantuffo di una siringa millilitro per macinare delicatamente il campione attraverso il colino. Centrifugare il tubo per cinque minuti a 350 volte G e scartare il supernatante, quindi lavare il pellet due volte con 10 millilitri di 1X HBSS. Rimescolare il pellet in 10 millilitri di 60 micromolari 6-tioguanina mezzi di coltura completi e placcare i campioni nelle piastre di coltura cellulare di 10 centimetri utilizzando uno schema di diluizione, se lo si desidera.
Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per cinque giorni. Versare i mezzi di coltura dalle piastre nel contenitore di rifiuti appropriato. Per fissare le cellule, aggiungere cinque millilitri di metanolo non diluito a ogni piastra e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente, assicurandosi di ruotare il metanolo in modo che copra l'intera piastra.
Versare il metanolo dalle piastre nel contenitore di scarto appropriato, quindi sciacquare ogni piastra con cinque millilitri di acqua distillata. Aggiungere cinque millilitri dello 0,03% di blu di metilene per piastra e incubarlo per cinque minuti a temperatura ambiente, assicurandosi di ruotare la soluzione blu di metilene in modo che copra l'intera piastra. Versare il blu di metilene nell'apposito contenitore di rifiuti e risciacquare nuovamente ogni piastra con cinque millilitri di acqua distillata.
Capovolgere la piastra e tamponarla contro un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Posizionare la piastra sul coperchio e lasciarla asciugare all'aria durante la notte. Le colonie metastatiche saranno blu.
Una volta che i piatti si sono asciugati, possono essere conservati a temperatura ambiente a tempo indeterminato. Rimuovere i coperchi etichettati dalle piastre, facendo attenzione a garantire una chiara identificazione dei campioni. Allinea tutte le piastre polmonari macchiate su una superficie pulita e leggera.
Scatta una foto della collezione di piatti in un'area ben illuminata, assicurandoti di ridurre al minimo i riflessi. I riflessi nelle piastre influenzeranno l'analisi delle immagini e dovrebbero essere evitati. Presta molta attenzione alle fotografie scattate e scatta diverse foto da diverse angolazioni.
Dopo aver fotografato le lastre, ritagliare l'immagine per escludere i coperchi o qualsiasi altra cosa sullo sfondo. Apri l'immagine in Fiji ImageJ e cambiala in bianco e nero facendo clic su immagine, regola e soglia di colore. Selezionare quindi predefinito per il metodo di soglia, bianco e nero per il colore di soglia e lab per lo spazio colore.
Assicurarsi che la casella di sfondo scura non sia selezionata. L'immagine dovrebbe ora essere in bianco e nero. Il nero rappresenta lo sfondo chiaro e il bianco rappresenta le colonie metastatiche blu.
Utilizzate lo strumento cerchio per selezionare l'area da analizzare. Disegnare un cerchio da utilizzare per tutte le piastre per assicurarsi che ogni piastra sia analizzata per la stessa area di dimensioni. Scegli una dimensione che massimizzi l'area analizzata sulle piastre riducendo al minimo il rumore di fondo che appare sul bordo delle piastre.
Le dimensioni vengono visualizzata nella barra degli strumenti man mano che viene disegnata. Analizzare il cerchio selezionato per determinare la percentuale di area bianca. Fare clic su analizza e analizzare le particelle, quindi selezionare da zero a infinito per le dimensioni, da zero a uno per la circolarità e niente per lo spettacolo.
Selezionare la casella riepilogata e premere OK. Spostate il cerchio sulla piastra successiva dell'immagine afferrandola al centro e ripetete l'analisi. Copiare e incollare il risultato in un foglio di calcolo.
L'area percentuale, che rappresenta la percentuale dell'area selezionata bianca, rappresenta il carico metastatico. Una volta analizzate tutte le lastre e le immagini, media i risultati dell'area percentuale tra immagini diverse per ogni piastra per mitigare eventuali incongruenze tra le immagini. L'analisi di Fiji ImageJ è stata confrontata con il conteggio manuale e l'analisi istopatologica.
Quando tre ricercatori separati contavano manualmente le colonie metastatiche, i risultati erano incoerenti tra i contatori. I risultati di Fiji ImageJ erano coerenti tra i contatori per ciascuna delle tre immagini. I risultati delle tre immagini e dei tre contatori sono stati combinati per ogni piastra polmonare.
I risultati sono stati mediati per ogni piastra per tenere conto delle variazioni tra le immagini, che hanno fornito risultati coerenti tra i contatori. Quando si classificano le lastre dalla maggior parte alla meno metastatica, il conteggio manuale concordava sulla piastra più confluente, ma tutti i seguenti ranghi erano incoerenti. I ranghi dei risultati medi di Fiji ImageJ erano molto più coerenti tra i contatori.
Per dimostrare l'importanza di evitare riflessi nelle immagini, viene mostrata un'immagine con il riflesso di una mano e la sua successiva analisi Fiji ImageJ insieme a un'immagine della stessa lastra senza riflessione. Le imperfezioni scure da una superficie di fondo sporca o da un residuo di campione di sangue sulle piastre possono anche influire negativamente sull'analisi ImageJ delle Fiji. Questa piastra sanguigna ha solo due colonie metastatiche, ma il residuo scuro ha fatto sì che Fiji ImageJ la considera 31,6% metastatica.
Quando si tenta questo protocollo, ricordarsi di esaminare attentamente le immagini per la riflessione, utilizzare lo stesso cerchio di dimensioni per ogni piastra nell'immagine e mediare i risultati per ogni lastra tra almeno tre immagini separate.
