Interazioni proteina-proteina FPOP in vivo e cambiamenti nella struttura proteica nei C-elegani. Questi animali sono ampiamente utilizzati come sistema modello per studiare le malattie umane. Accoppiando fpop in vivo alla spettrometria di massa, possiamo sondare le interazioni proteina-proteina all'interno di diversi compartimenti cellulari e corporei in un animale vivo senza la necessità di isolare una particolare proteina.
Iniziare l'assemblaggio del sistema di flusso, tagliando un pezzo di due centimetri di propilene di etilene fluorurato o tubi FPP. Utilizzare un ago di sezionatura pulito per allargare il diametro interno ad un'estremità del tubo, creando un piccolo cratere lungo circa 15 millimetri. Per creare le linee di infusione del sistema di flusso, tagliare a 15 centimetri pezzi di silice fusa di diametro interno di 250 micrometri con una fresa in ceramica.
E rastrema i due capillari insieme al nastro adesivo autoadesivo, assicurandoti che le estremità siano arrossate al 100%. Inserire i due capillari nel cratere dei tubi FPP, spingendoli fino al bordo stesso. Posizionare un piccolo punto di resina epossidica su una superficie pulita e mescolarlo con l'ago di sezionazione.
Utilizzare lo stesso ago per posizionare rapidamente una piccola goccia di resina, alla fine dei capillari infusi, dove si collegano con i tubi FPP, lasciare asciugare la resina per alcuni minuti. Nel frattempo, tagliare un nuovo capillare di diametro interno di 250 micrometri che diventerà il capillare di uscita del sistema di flusso. Una volta asciugata la resina, inserire il nuovo capillare nell'estremità di uscita dei tubi FPP.
Le estremità interne del capillare di uscita e i due capillari infusi devono essere a filo l'uno contro l'altro, creando il tè di miscelazione. Legare ai tubi capillari e FPP con resina epossidica fresca come descritto in precedenza e lasciare asciugare il sistema di flusso durante la notte. Inserire quattro agitatori magnetici, all'interno di una siringa da cinque millilitri che impedirà ai vermi di depositarsi in questa siringa durante l'ossidazione fotochimica rapida in vivo di proteine o FPOP in vivo.
Riempire questa e un'ulteriore siringa da cinque millilitri con M9, assicurandosi di evitare di creare bolle. Collegare un adattatore inferiore a ogni siringa, assicurandosi che siano stretti alle dita e fissati in posizione. Quindi, attaccare ogni siringa alla porta centrale di una singola valvola da tre a due.
Fissare ogni siringa alla pompa a doppia siringa e regolare il colore meccanico per evitare la sovrapressione dal blocco pusher. Utilizzare una lista super flangia non fep sleeve e super flangia list variable per attaccare ogni estremità capillare infusa del sistema microfluidico precedentemente realizzato alla porta superiore di ogni tre-due valvole. Infine, attaccare un capillare di diametro interno di 10 centimetri e 450 micrometri alla porta inferiore della valvola, che fungerà da capillare del campione di ritiro.
Avviare il flusso della pompa e ispezionare visivamente tutte le connessioni alla ricerca di perdite. Flusso di almeno tre volumi di siringhe utilizzando la portata sperimentale. Il percorso di flusso è contrassegnato dalle frecce sulla maniglia di tre-due valvole e ogni siringa può essere ricaricata manualmente spostando la maniglia della valvola dall'espulsione alla posizione di ritiro.
Dopo aver ispezionato il sistema di flusso microfluidico, spostarlo sul banco sperimentale e fissare il capillare di uscita allo stadio radiante con un'unione in acciaio inossidabile. Utilizzare un accendino di lunga portata per bruciare il rivestimento della silice fusa nella finestra di irradiazione laser e pulire il rivestimento bruciato con tessuto di pelucchi e metanolo. Posizionare il blocco dell'agitatore magnetico sopra la siringa con gli agitazioni magnetici e regolare la velocità, in modo che gli agiti ruotano lentamente e costantemente.
Accendi il laser ad eccimeri al fluoruro di Krypton e consenti al trone tiroideo di riscaldarsi. Misurare l'energia laser a una frequenza di 50 hertz per almeno 100 impulsi posizionando il sensore ottico nella finestra di uscita del fascio. Prelevare manualmente circa 10.000 vermi in un volume di 500 microliter nella siringa campione.
Quindi riempirlo con 2,5 millilitri del buffer M9, assicurandosi di evitare bolle d'aria. È importante avere una dimensione del campione di almeno 10.000 vermi. Una dimensione del campione più piccola si tradurrà in una bassa resa proteica per l'analisi proteomica a valle.
Riempire la seconda siringa con tre millilitri di perossido di idrogeno millimolare da 200 millimolare. Alla fine del capillare di uscita, posizionare un tubo conico da 15 millilitri con sei millilitri di DMTU da 40 millimolare, 40 MLD millimolare e ossido di salsa di mele 1%. Avviare il laser ad eccimeri dalla finestra del software, attendere il primo impulso e avviare il flusso del campione dalla doppia siringa.
Raccogliere l'intero campione nel tubo da 15 millilitri, monitorando attivamente il flusso del campione per eventuali perdite visive. Dopo fpop in vivo, pellet i vermi per centrifugazione a 805 volte g per due minuti. Aspirare la soluzione di tempra e aggiungere 250 microlitri di buffer concesso in licenza.
Trasferire il campione in un tubo di micro centrifuga pulito, congelarlo e conservarlo a -80 gradi Celsius fino alla digestione del campione. il recupero del verme è stato confrontato dopo fpop in vivo utilizzando capillari con due diversi diametri interni. Quando è stato utilizzato un capillare di diametro interno di 250 micrometri, è stato ottenuto un recupero totale del campione tra il 63 e l'89% attraverso due repliche biologiche.
L'utilizzo di un capillare di diametro interno di 150 micrometri ha comportato solo un recupero dal 21 al 31%. L'uso di un capillare di diametro interno più grande, porta a un migliore flusso di vermi durante l'FPOP in vivo, il capillare più piccolo non consente un singolo flusso di vermi e si vedono più vermi fluire insieme alla finestra di irradiazione laser, che diminuisce la quantità di esposizione laser per verme. I cromatogrammi di ioni estratti rappresentativi di un peptide modificato e non modificato FPOP hanno mostrato che il radicale idrossile cambia la chimica dei peptidi modificati ossidativamente rendendoli più polari.
Nella cromatografia in fase inversa, i peptidi modificati FPOP in vivo hanno tempi di ritenzione precedenti rispetto ai peptidi non modificati. La frammentazione MS dei peptidi isolati, consente l'identificazione di residui modificati ossidativamente. In vivo FPOP ha modificato ossidativamente un totale di 545 proteine attraverso due repliche biologiche all'interno di C-elegans.
Un vantaggio di questo metodo di footprinting proteico, è la sua capacità di modificare le proteine, in una varietà di sistemi corporei all'interno dei vermi. L'analisi tandem MS conferma l'accessibilità in vivo del solvente della sonda FPOP in vivo. Il modello di ossidazione della proteina shock termico 90 in complesso con la proteina del chaperone di miosina UNC 45, è stato analizzato e sono stati trovati quattro residui modificati ossidativamente.
L'uso di C-elegans per fpop in vivo, offre il potenziale per studiare il ruolo delle interazioni proteina-proteina e della struttura proteica nella patogenesi della malattia.
