La mutagenesi a scambio allelico a cassetta floxed è un metodo importante perché la cancellazione genica è uno strumento prezioso che può essere utilizzato per comprendere la funzione dei prodotti genetici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la deezione genica mirata senza infliggere effetti polari sui geni a valle. Identificare circa tre regioni di kilobase direttamente a monte e a valle del gene destinato alla cancellazione per servire come cinque bracci di omologia primaria e tre primi per la ricombinazione omologa e assegnare primer come indicato nel protocollo di testo.
Amplifica i tre kilobase di cinque bracci di omologia primaria e tre primi del DNA genomico clamidia appena estratto dalla PCR in una o due reazioni per produrre abbastanza frammenti per un successivo assemblaggio del DNA. Dopo aver purificato e concentrato i frammenti PCR come descritto nel protocollo di testo, digerire 500 nanogrammi di vettore pSUmC-4.0 in una reazione di 20 microlitri con un'unità di cella uno e un'unità di SBF uno secondo il protocollo del produttore. Combina il vettore pSUmC-4.0 digerito e purificato e entrambi i cinque prodotti PCR del braccio di omologia primaria e tre primi insieme con un rapporto di 0,01 picomoli vettoriali a 0,09 picomoli di ogni braccio di omologia.
Assemblare i frammenti in una reazione di assemblaggio del DNA secondo il protocollo del produttore. Trasforma 50 microlitri di E.coli elettrocompetente con un microlitro della reazione di assemblaggio del DNA. Placcare l'E.coli trasformato su piastre di agar LB contenenti 100 microgrammi per spectinomicina millilitro.
Incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno dopo, scherma le colonie per la fluorescenza verde e rossa usando un microscopio invertito a epifluorescenza. Si prevede un totale di cinque-30 colonie per piastra di agar.
A seguito di un'incubazione di coltura liquida durante la notte delle colonie selezionate, confermare l'inserimento di ogni braccio di omologia nel vettore utilizzando i primer di screening PCR per amplificare ogni inserimento. Seed McCoy cellule che sono fibroblasti di topo tipicamente utilizzati per coltivare la clamidia in due piastre a sei pozzi come descritto nel protocollo di testo. In un tubo da 1,5 millilitri, aggiungere C.trachomatis corpi elementari serovar L2 di tipo selvatico, o SFERE, ad un volume sufficiente a infettare 12 pozzi di una piastra a sei pozzetti ad un MOI di due.
Pellettare gli EB a più di 20.000 volte g per 30 minuti e scartare il supernatante. Avviare la trasformazione clamidiale riutilizzando delicatamente gli EB in 600 microlitri di tampone di cloruro di calcio. Quindi, aggiungere 12 microgrammi di pSUmC-4.0 più bracci di omologia al tubo e mescolare delicatamente la soluzione sfarfallando.
Incubare il tubo a temperatura ambiente per 30 minuti svolazzando per mescolare ogni 10 minuti. Aggiungere la soluzione di trasformazione a 24 millilitri di HBSS e mescolare mediante pipettazione delicata. Trasferire due millilitri dell'inoculo in ogni pozzo di cellule McCoy confluenti nelle piastre a sei pozzi.
Infettare per centrifugazione a 900 volte g per un'ora a 20 gradi Celsius. Rimuovere l'inoculo e sostituirlo con due millilitri per supporto di crescita RPMI numero due. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.
Dopo un minimo di sette ore ma non più di 12 ore, sostituire il supporto con due millilitri per pozzo di supporto di selezione numero uno. Continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius per 48 ore dal momento dell'infezione. Raccogliere e passare i batteri su un monostrato fresco di cellule McCoy utilizzando un raschietto per raschiare delicatamente il monostrato McCoy per sollevare le cellule nel supporto.
Trasferire il materiale da ogni pozzo in un tubo da due millilitri. Pellettizzare il materiale cellulare a più di 20.000 volte g in un microcentrifugo per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il supernatante, resuspend il pellet cellulare in un millilitro di HBSS pipettando delicatamente.
Pellettizzazione dei detriti cellulari a 200 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il supernatante in un pozzo fresco di cellule McCoy confluenti. Aggiungere un millilitro aggiuntivo di HBSS a ciascun pozzo per un volume totale di due millilitri per pozzo.
Infettare per centrifugazione a 900 volte g per un'ora a 20 gradi Celsius. Sostituire l'inoculo con il supporto di selezione numero uno immediatamente dopo l'infezione. Continuare a passare i batteri su un monostrato fresco di cellule McCoy ogni 48 ore fino a quando non vengono rilevate inclusioni rosse e verdi utilizzando un microscopio invertito a epifluorescenza 24 ore dopo l'infezione.
Una volta rilevate le inclusioni rosse e verdi, continuare a passare il monostrato come prima di utilizzare il supporto di selezione numero due. Continuare a passare il monostrato fino a quando non vengono rilevate inclusioni solo verdi 24 ore dopo l'infezione, il che indica la perdita del vettore pSUmC-4.0 e l'incorporazione della cassetta di selezione loxP nel genoma. Raccogliere e congelare le inclusioni solo verdi in SPG.
Arricchire le inclusioni solo verdi in un MOI compreso tra 0,5 e 1,0 e raccogliere i monostrati in SPG come descritto nel testo. Ottenere aliquote di 50 microlitri in tubi da 1,5 millilitri e congelare a meno 80 gradi Celsius. Sementire una piastra di coltura tissutale a 384 pozzi con cellule McCoy come descritto nel protocollo di testo.
Diluire un'aliquota di batteri solo verdi in HBSS per ottenere circa 50 EB per 20 millilitri. Trasferire l'inoculo diluito in un vassoio del serbatoio. Rimuovere il supporto dalla piastra a 384 pozze di celle McCoy confluenti facendo scorrere saldamente l'intera piastra capovolta in un contenitore di rifiuti.
Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 microlitri di C.trachomatis inoculum ad ogni pozzo. Infettare per centrifugazione a 900 volte g per un'ora a 20 gradi Celsius. Rimuovere l'inoculo sfarfallando e sostituirlo con 50 microlitri per pozzo di mezzi di crescita numero due.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Dopo aver incubato la piastra per cinque o 12 giorni, identificare i singoli pozzi con inclusioni fluorescenti verdi utilizzando un microscopio invertito a epifluorescenza o una piattaforma di screening ad alto contenuto. Raccogliere pozzi con inclusioni solo verdi raschiando il monostrato con punta P10.
Trasferire l'intero contenuto del pozzo in un tubo contenente due millilitri di HBSS. Mescolare delicatamente e applicare i due millilitri di inoculo su un monostrato McCoy confluente fresco in una piastra a sei pozzi per l'infezione. Arricchire, congelare e riordinare le popolazioni clonali.
Confermare la cancellazione di geni mirati da C.trachomatis isolato clonally utilizzando PCR quantitativo. Ripetete il processo di trasformazione utilizzando il mutante C.trachomatis FRAEM isolato clonally, il vettore pSU-Cre e il supporto di selezione numero tre. Passare il monostrato fino a quando non vengono rilevate inclusioni solo rosse che indicano la perdita della cassetta di selezione.
Isolare clonally le inclusioni solo rosse limitando la diluizione in una piastra da 384 po 'come prima. Arricchire le popolazioni clonali passando fino a un MOI di 0,1. Una volta arricchito, sostituire il supporto di selezione con il supporto di crescita numero due per avviare la perdita del vettore pSU-Cre.
Isolare clonally i batteri non fluorescenti come prima. Tuttavia, scansionare manualmente la piastra con un microscopio Brightfield per rilevare le inclusioni. Arricchire e congelare i batteri.
Schermo per il ceppo mutante utilizzando PCR quantitativo in tempo reale, western blotting e sequenziamento del DNA dell'intero genoma come descritto in precedenza. Vengono mostrati dati rappresentativi in cui tmeA è destinato alla cancellazione genica. Il ceppo di eliminazione C.trachomatis tmeaA viene generato utilizzando FRAEM e il ceppo C.trachomatis tmeA-lx viene generato utilizzando FLAEM.
Sono tutti mostrati i numeri relativi di copia del DNA di tmeA e tmeB a valle, gfp contenuti nella cassetta di selezione pSUmC-4.0 e cre contenuti nel vettore pSU-Cre. Entrambi i ceppi mutanti contengono una cancellazione del locus tmeA. Tuttavia, tmeA-lx non contiene la cassetta di selezione come indicato dall'assenza di DNA gfp.
Il ceppo mutante tmeA ha diminuito l'espressione di tmeB come dimostrato dai livelli di mRNA e proteine. Quando il FLAEM viene utilizzato per generare il ceppo mutante tmeA-lx, tale espressione di tmeB viene ripristinata come rilevato dai livelli di mRNA e proteine. Un'attenta costruzione del vettore pSUmC con bracci di omologia è essenziale per la cancellazione mirata dei geni.
È necessario del tempo per garantire un assemblaggio vettoriale accurato prima della trasformazione clamidiale. Flaem ha fornito ai ricercatori uno strumento per studiare geni specifici e fare deduzioni mirate senza aver diminuito l'espressione di geni fuori bersaglio che possono confondere gli studi. I mutanti di cancellazione della C.trachomatis generati dal FLAEM possono essere utilizzati per studiare una varietà di aspetti della biologia clamidia, inclusi i meccanismi di sviluppo e patogeni.
