Il metodo semplice ed economico che chiamiamo MDR consente di isolare le popolazioni arricchite di spermatociti pachytene, spermatidi rotondi e spermatidi allunganti dai teste di topo. Il principale vantaggio del metodo MDR è la sua semplicità. Sono necessarie solo apparecchiature di laboratorio standard disponibili nella maggior parte dei laboratori di ricerca biomedica.
Il protocollo MDR è ottimo per i ricercatori che fanno studi funzionali sulle cellule germinali maschili. Ad esempio, gruppi che stanno studiando la spermatogenesi, i fattori che influenzano la fertilità maschile e l'ereditarietà epigenetica paterna. Per il metodo MDR è necessario un materiale di partenza minimo.
E infatti, otteniamo regolarmente una buona quantità di cellule usando un solo topo maschio adulto. Iniziare impostando le attrezzature e i reagenti necessari. Impostare un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e un incubatore di coltura cellulare i 34 gradi Celsius, il 5% di anidride carbonica e il 95% di umidità.
Posizionare un rotatore a tubo all'interno dell'incubatore. Preparare ed etichettare la quantità appropriata di vetrini di microscopia, quindi disegnare un anello di circa un centimetro di diametro con una penna di grasso e lasciare asciugare il grasso. Quando sei pronto a sezionare l'animale, spruzzare l'addome ventrale del topo con il 70% di etanolo e utilizzare le forbici per aprire una forma a V nella cavità pelvica addominale.
Tirare sul cuscinetto grasso epididimale con le flessione, individuare i teste e rimuoverli con le forbici, assicurandosi di evitare di disturbare la tunica albuginea. Posizionare i tester su una piastra di Petri di sei centimetri contenente 1X KREBS. Decapsulare i teste e scartare la tunica albuginea, quindi disperdere leggermente i tubuli seminiferi prendendoli delicatamente in giro con le forcette.
Trasferirli in un tubo conico da 50 millilitri contenente due millilitri di soluzione di collagenasi preparata al momento. Incubare i tubuli nel bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per tre minuti, agitandoli delicatamente dondolando. Quindi aggiungere almeno 40 millilitri di KREBS caldo 1X e lasciare che i tubuli sedimentano a temperatura ambiente.
Rimuovere il supernatante e ripetere nuovamente il lavaggio. Aggiungere 25 millilitri di soluzione di triptina preparata al momento. Posizionare il tubo sul rotatore all'interno dell'incubatore di coltura cellulare e lasciarlo lì per 15-20 minuti, ruotando a circa 15 giri/min.
Controllare sporadicamente i tubuli. Una volta che la soluzione diventa torbosa e rimangono solo piccoli pezzi dei tubuli, posizionare il tubo sul ghiaccio e procedere al passaggio successivo. Filtrare la soluzione attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri in un nuovo tubo conico da 50 millilitri su ghiaccio.
Quindi centrifugarlo a 600 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per pellettare le cellule. Versare con cura il supernatante e toccare il pellet cellulare per rimescolare le cellule nel resto del KREBS 1X. Aggiungere almeno 40 millilitri di KREBS freddo 1X alle cellule rimorsi e ripetere la centrifugazione.
Rimospend le cellule toccando il tubo. Quindi montare una punta di pipetta su una pipetta da un millilitro e tagliarla in modo che l'apertura sia di circa tre millimetri di diametro. Aggiungere fino a tre millilitri dello 0,5%BSA in KREBS.
Riutilizzare le celle tubazioni su e giù, assicurandosi di evitare bolle. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 40 micrometri e procedere immediatamente al caricamento delle celle sul gradiente BSA. È necessario ottenere una sospensione omogenea a cella singola prima di caricare le celle sulla sfumatura.
Le cellule raggruppate sedimenteranno più velocemente, interrompendo il gradiente e contaminando le frazioni. Impostare un tubo da 50 millilitri verticalmente sul ghiaccio, assicurandosi che sia possibile vedere un lato del tubo. Quindi tagliare da cinque a dieci millimetri dalla punta di una pipetta sierologica da dieci millilitri e montarla su un controller di pipetta.
Pipetta cinque millilitri della soluzione 5%BSA nella parte inferiore del tubo da 50 millilitri. Toccare delicatamente la superficie della soluzione al 5% con la punta di taglio della pipetta e strato lento cinque millilitri di soluzione 4%BSA sopra la soluzione al 5%.. Ripetere questa procedura con altre soluzioni BSA per ottenere una sfumatura dal 5% all'1%BSA.
Una linea chiara dovrebbe essere visibile tra i livelli. Quindi caricare con cura la sospensione a cella singola sopra la sfumatura senza disturbarla. Lasciare che le cellule sedimentino attraverso il gradiente per un'ora e mezza.
Utilizzando una punta di pipetta tagliata, raccogliere accuratamente le frazioni di un millilitro in tubi separati da 1,5 millilitri e conservarli sul ghiaccio, assicurandosi di numerare i tubi nell'ordine in cui sono stati raccolti. Centrifugare le frazioni delle cellule germinali a 600 x g per dieci minuti a quattro gradi Celsius. Quindi fare attenzione a non disturbare il pellet, scartare la maggior parte del supernatante e rimescolare le cellule facendo scorrere il tubo.
Aggiungere un millilitro di ghiaccio freddo tampone 1X KREBS ad ogni tubo e ripetere la centrifugazione. Scartare la maggior parte del supernatante, lasciando circa 100 microlitri e rimescolare accuratamente il pellet cellulare. Per analizzare le frazioni cellulari, iniziare con pipettando 20 microlitri di paraformaldeide al 4% all'interno di ogni anello della penna grassa su uno scivolo di microscopia numerato.
Aggiungere immediatamente due microlitri delle cellule rimorsi dalla frazione corrispondente. Quindi asciugare gli scivoli a temperatura ambiente per almeno un'ora. Risciacquare le diapositive una volta con PBS e utilizzare un supporto di montaggio con DAPI per montare le diapositive.
Analizzare ogni diapositiva al microscopio a fluorescenza per stimare quale particolare tipo di cellula germinale è arricchito in ogni frazione. Una volta prelevato un campione per ogni frazione per microscopia, aggiungere un millilitro di krebs freddo ghiaccio 1X ad ogni frazione e centrifugare le cellule verso il basso a 600-13000 x g per dieci minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere e scartare il supernatante e continuare con l'analisi downstream preferita.
Questo protocollo funziona particolarmente bene per arricchire gli spermatidi rotondi. L'arricchimento superiore al 90% è stato ottenuto in frazioni due, tre e quattro. Gli spermatidi allunganti tendono a rimanere in cima al gradiente e sono stati raccolti con la prima frazione.
A causa delle loro grandi dimensioni, gli spermatociti pachytene sedimentano più velocemente e sono stati raccolti per ultimi. L'arricchimento è stato di circa il 75% nelle frazioni 14 e 15. L'RNA totale ottenuto dalla maggior parte delle frazioni variava da 0,5 a 2,5 microgrammi, abbastanza per le analisi dell'RNA a valle.
La quantità di proteine ottenute da ogni frazione variava tipicamente da 20 a 140 microgrammi, il che è sufficiente per diverse macchie occidentali. In questo protocollo, il 10% dei llysati proteici derivati da singole frazioni era sufficiente per rilevare chiaramente le proteine DDX4, PIWIL1 e PIWIL2 su una macchia occidentale standard. La quantità di proteine in una frazione era sufficiente anche per l'immunoprecipitazione utilizzando un anticorpo contro PIWIL1 e per il rilevamento di PIWIL2 coimmunoprecipitato.
Anche per un primo timer, questo protocollo funziona molto bene purché ti assicuri che il pre-trattamento delle tue cellule sia buono e nulla disturbi il tuo gradiente durante la sedimentazione. Da un singolo mouse, si ottengono cellule altamente arricchite, che possono essere utilizzate per diverse analisi a valle come RT-PCR, sequenziamento dell'RNA, immunoprecipitazione e gonfiore occidentale. Mentre l'MDR non è l'unico metodo per arricchire le cellule germinali maschili, è uno strumento molto conveniente perché non richiede attrezzature specializzate o un ampio allenamento.
