Questo protocollo fornisce un sistema di visualizzazione batterica altamente efficace per l'isolamento di nuove varianti di BirA che consente una biotinylazione specifica delle proteine native. Il vantaggio principale della tecnica è che seleziona varianti BirA utilizzando la selezione di streptavidina ad alta affinità. Ciò garantisce che i cloni inattivi siano rimossi, creando così un processo di selezione altamente efficiente.
Per iniziare, in un editor plasmide, progettare il primer in avanti per includere gli ultimi 30 nucleotidi del complemento inverso della sequenza di codifica peptidica, e aggiungere la sequenza nucleotidica legante plasmide alla sua estremità a cinque primi. Progettare il primer inverso per includere i primi 30 nucleotidi del complemento inverso della sequenza di codifica peptidica, e aggiungere la sequenza nucleotidica legante plasmide alla sua estremità a cinque primi. Quindi, per impostare una reazione PCR a 20 microliter, aggiungere i reagenti in un tubo PCR a parete sottile.
Trasferire il tubo su un ciclore termico ed eseguire la PCR in base al manoscritto. Successivamente, eseguire cinque microlitri della reazione PCR su un gel di agarosio dell'1% per confermare l'amplificazione di un prodotto PCR da sei kilobase e procedere secondo il manoscritto. Ora, per sintetizzare i megaprimi mutanti con i primer di esaistidina BirA avanti e indietro, in un tubo PCR, aggiungere un nanogrammo di pBAD-BirA-eCPX con la sequenza peptidica bersaglio preparata come modello.
Impostare 35 cicli PCR con una temperatura di ricottura di 60 gradi Celsius secondo le istruzioni del produttore. Quindi, eseguire cinque microlitri della reazione di amplificazione su un gel di agarosio dell'1% per verificare l'amplificazione di un prodotto PCR a coppia di 984 basi. Purificare il prodotto PCR dai restanti 45 microlitri della reazione di amplificazione utilizzando un kit di purificazione PCR commerciale e utilizzare uno spettrofotometro per quantificare la resa del DNA.
In un tubo PCR a parete sottile, aggiungere i reagenti nei megaprimi mutanti preparati per preparare la reazione del campione. Trasferire la miscela di reazione in un ciclore termico ed eseguire la PCR secondo il manoscritto. Conservare la reazione di amplificazione a quattro gradi Celsius o sul ghiaccio.
Quindi, aggiungere un microlitro dell'enzima di restrizione Dpn1 direttamente alla reazione di amplificazione e mescolare delicatamente. Spin giù la miscela di reazione e incubare per due ore a 37 gradi Celsius. Dopo due ore, trasformare le cellule E.coli competenti T7 Express lysY/Iq in un tubo con due microlitri della reazione Dpn1.
In primo luogo, inoculare 100 millilitri di LB contenenti 1%glucosio e 100 microgrammi per millilitro di ampicillina con un millilitro di libreria BirA, e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius con scuotimento a 200 giri/min. Quindi, inoculare cinque millilitri di LB contenenti 1%glucosio e 100 microgrammi per millilitro di ampicillina con 100 microlitri della coltura notturna. Incubare per due ore e 30 minuti o fino a quando la coltura raggiunge un OD600 di circa 0,5.
Successivamente, indurre l'espressione di eCPX e BirA con uno 0,2% di peso in volume L-arabinosi, IPTG 100 micromolare e biotina 100 micromolare. Scuotere la cultura a 200 giri/min per un'ora a 37 gradi Celsius. Centrifugare la coltura per 10 minuti a 5.000 volte g e rimuovere il supernatante.
Rimospendare le cellule in un millilitro di PBS ghiacciato e centrifugare a 5.000 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 400 microlitri di PBS ghiacciato e immagazzinare le cellule sul ghiaccio. Quindi, trasferire 10 microlitri delle celle rimorsi in un ingresso etichettato a tubo da 1,5 millilitri.
Conservare sul ghiaccio. Successivamente, lavare 20 microlitri di perline magnetiche streptavidin in un millilitro di PBS ghiacciato in un tubo e posizionare il tubo in un separatore di particelle magnetiche da banco per due minuti e rimuovere con cura il supernatante. Riprendono le perle magnetiche di streptavidina in 20 microlitri di PBS ghiacciato e trasferiscono la soluzione di perline ai precedenti 390 microlitri preparati di cellule rimorsi.
Mescolare con pipettazione delicata. Quindi, incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Posizionare una colonna con sfere ferromagnetiche in un separatore di particelle magnetiche e lavare con cinque millilitri di PBS ghiacciato.
Trasferire le cellule e le perle magnetiche streptavidin dal tubo nella colonna attaccata nel separatore. Una volta che il serbatoio della colonna è vuoto, lavare la colonna con un volume totale di cinque millilitri di PBS ghiacciato a 500 microlitri ogni volta. Successivamente, rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla in un tubo da 1,5 millilitri.
Pipettare un millilitro del PBS ghiacciato sulla colonna e utilizzare lo stantuffo per elutare le cellule etichettate magneticamente. Quindi, posizionare il tubo da 1,5 millilitri in un separatore da banco e lavare la cella etichettata magneticamente con un millilitro di PBS ghiacciato. Rimorsiva delicatamente le cellule etichettate magneticamente in un millilitro del PBS ghiacciato.
Trasferire 10 microlitri della resopensione in un tubo da 1,5 millilitri etichettato in uscita. Inoculare 100 millilitri di LB contenenti 1%glucosio e 100 microgrammi per millilitro ampicillina con le cellule etichettate magneticamente, e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius con scuotimento a 200 giri/min. Il giorno successivo, combinare 10 millilitri della coltura notturna in LB con glicerolo a una concentrazione finale del 15% e conservare a meno 80 gradi Celsius per fare scorte di congelatori.
Utilizzare 100 microlitri della coltura notturna per il prossimo round di selezione. Ora, aggiungete 990 microlitri di PBS ghiacciato sia ai campioni di ingresso che di uscita, ed etichettate rispettivamente i tubi immessi da 10 a meno due e l'uscita da 10 a meno due. Effettuare diluizioni seriali di 10 volte dei due campioni in PBS ghiacciato fino a raggiungere una diluizione finale da 10 a meno 10 nel campione di ingresso e da 10 a meno quattro nel campione di uscita.
Piastra 100 microlitri di campioni dall'ingresso 10 al meno sei, ingresso 10 a meno otto, ingresso 10 a meno 10, uscita 10 a meno due, uscita 10 a meno tre e uscita 10 a meno quattro su singole piastre LB-ampicillina e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Al mattino, conta il numero di colonie sulle placche con colonie chiaramente separate. Moltiplicare il conteggio delle colonie con il fattore di diluizione per ottenere il conteggio della concentrazione batterica per 100 microlitri.
In questo protocollo, dopo la generazione di una libreria mutata casualmente di varianti BirA, è stata indotta l'espressione BirA ed eCPX-AP. I batteri sono stati incubati con reagente di affinità, i batteri non abbondati sono stati scartati e alcuni batteri sono stati amplificati. La macchia occidentale di batteri che esprimono pBAD-BirA-eCPX-AP ha prodotto una banda di reazione allo streptavidina da 22 kilodalton coerente con il peso molecolare dell'eCPX sia nelle colture non indotte che indutate.
Tuttavia, non erano presenti in esaistidina BirA. La forte biotinylazione superficiale nei batteri che esprimono eCPX-AP ha causato l'aggregazione con l'aggiunta di perline magnetiche streptavidina e la formazione di un pellet nella parte inferiore del tubo, che non è stato osservato con eCPX con lysine ai batteri espressione di mutazione alanina. L'analisi del precipitato dal pulldown di streptavidina ha mostrato una chiara banda di streptavidina e anti-esaistidina a 22 kilodalton nei campioni delle colture eCPX-AP ma non eCPX-AP con lisina e colture di mutazione dell'alanina.
Allo stesso modo, il numero di batteri legati alle perline di streptavidina era significativamente più alto nell'eCPX-AP rispetto alla lisina eCPX-AP alle colture di mutazione dell'alanina. Il passo più importante è un rigoroso lavaggio dei batteri legati alla streptavidina. Un lavaggio rigoroso assicura che vengono selezionati solo i batteri con biotina visualizzata in superficie.
Una volta osservato un chiaro arricchimento dei batteri, i cloni isolati possono essere ulteriormente mutati e quindi sviluppare varianti bira altamente attive che consentono una biotinylazione specifica delle proteine native.
