Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul ruolo diretto del tau nel compartimento nucleare, escludendo al contempo qualsiasi potenziale contaminazione da tau citoplasmatico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è ampiamente applicabile allo studio sulla funzione nucleare del tau in altri tipi di cellule e in diverse condizioni cellulari. A dimostrare la procedura sarà Giacomo Siano, post-doc del mio laboratorio.
Inizia placcando quattro per 10 alle cinque cellule della linea cellulare del neuroblastoma umano SH-SY5Y per essere trasfette con il vettore di controllo vuoto, quattro per 10 alle cinque cellule da trasfette con tau non placcato, quattro volte 10 alle cinque cellule da trasfette con tau-NLS e quattro per 10 alle cinque cellule da trasfette con tau-NES in singoli pozzi di una piastra di sei pozzi. Il giorno dopo la placcatura, incubare separatamente 400 nanogrammi di DNA e il volume appropriato di lipidi cationici in un tubo di 250 microlitri di siero ridotto per pozzo. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, combinare ogni vettore con un volume di lipidi cationici e incubare i complessi lipidici del DNA per 20 minuti a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, sostituire i supernaganti in ogni pozzo con due millilitri di mezzo di coltura fresco completo e trasfettare ogni bene con l'appropriata soluzione complessa lipidica del DNA per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, sostituire i supernatanti con un nuovo mezzo di differenziazione. Per l'analisi western Blot, lavare le cellule trasfette e differenziate in ogni pozzo con PBS e incubare le cellule con 500 microlitri dello 0,1% di tripside per pozzo per quattro minuti a 37 gradi Celsius.
Quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione con un volume uguale di mezzo completo e trasferire la sospensione cellulare da ogni pozzo in singoli tubi per la centrifugazione. Dopo aver rimosso con cura i supernaganti, resostigliere i pellet in un millilitro di PBS per tubo per una seconda centrifugazione e rimuovere nuovamente i supernaganti. Per gli estratti proteici totali, incubare i pellet per 30 minuti sul ghiaccio in 50-100 microlitri di tampone di lisi integrati con proteasi e inibitori della fosfatasi.
Al termine dell'incubazione, centrifugare l'estratto a 16.000 volte g per 15 minuti e quantificare la concentrazione proteica con qualsiasi saggio di quantificazione standard. Quindi mescolare 20 microgrammi di ogni campione proteico con cinque microlitri di tampone Laemmli 4X a un volume totale di 20 microlitri e far bollire i campioni a 100 gradi Celsius per cinque minuti. Per il frazionamento subcellulare, rimorsi le cellule in mezzo completo per il conteggio e lo spin down una per 10 alle sei cellule per campione.
Per isolare la frazione citosolica, incubare i pellet in 100 microlitri di tampone di estrazione citoplasmatico ghiacciato integrato con inibitori della proteasi a quattro gradi Celsius con miscelazione delicata per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, raccogliere i campioni mediante centrifugazione e trasferire i soprintenti in tubi pre-refrigerati. Aggiungere 100 microlitri di tampone di estrazione della membrana ghiacciata integrato con inibitori della proteasi al pellet per un'incubazione di 10 minuti a quattro gradi Celsius con miscelazione delicata.
Quindi centrifugare i pellet per cinque minuti a quattro gradi Celsius e 3.000 volte g e raccogliere i supernatanti in nuovi tubi. Per raccogliere la frazione nucleare solubile, aggiungere 50 microlitri di tampone di estrazione nucleare integrati con inibitori della proteasi al pellet con vortice prima di incubare i campioni a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Alla fine dell'incubazione, centrifugare i campioni e raccogliere i supernaganti.
Per raccogliere la frazione nucleare insolubile, aggiungere 50 microlitri di tampone di estrazione nucleare integrati con inibitori della proteasi, cloruro di calcio e nucleasi micrococcica ai pellet con vortice. Incubare i campioni per cinque minuti a 37 gradi Celsius prima di vortice e centrifugazione. Quindi raccogli i supernatanti.
Per raccogliere la frazione citoscheletricha, aggiungere 50 microlitri di tampone di estrazione citoscheletricha integrati con inibitori della proteasi ai pellet con vortice. Dopo un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, centrifugare i campioni e raccogliere i supernaganti. Per l'analisi SDS-PAGE, aggiungere sette microlitri di tampone Laemmli 4X a 20 microlitri di ciascuno dei campioni di frazione subcellulare raccolti e far bollire i campioni a 100 gradi Celsius per cinque minuti.
Al termine dell'incubazione, caricare i campioni su un gel di acrilammide ed eseguire l'elettroforesi a una tensione costante di 120 volt. Quindi trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa a 250 milliarti per 90 minuti. Incubare la membrana per cinque minuti nella soluzione di colorazione Ponceau per verificare la presenza di una corretta elettroforesi del gel proteico e di un'assorbimento di successo.
Al termine dell'incubazione, sciacquare la membrana in acqua distillata fino a quando lo sfondo non è pulito e rimuovere la macchia con lavaggio continuo con soluzione salina tamponata tris integrata con Tween 20 per 10 minuti su uno shaker. Successivamente, incubare la membrana con soluzione di blocco per un'ora a temperatura ambiente con agitazione prima di lavare tre volte con soluzione salina tamponata Tris più Tween 20 per cinque minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, ibridare la membrana con l'anticorpo primario di interesse a bloccare la soluzione durante la notte a quattro gradi Celsius seguita da tre lavaggi con soluzione salina tamponata tris più Tween 20 per cinque minuti.
Dopo l'ultimo lavaggio, ibridare la membrana con un adeguato anticorpo secondario coniugato di rafano perossidasi in soluzione di blocco per un'ora a temperatura ambiente prima di lavare la membrana con soluzione salina tamponata tris più Tween 20 tre volte per cinque minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, rilevare la banda proteica usando la chemiluminescenza e quantificare l'intensità delle bande Blot occidentali di ImageJ. In assenza di acido retinoico e fattore neurotrofico derivato dal cervello, le cellule SH-SY5Y indifferenziate assumono una morfologia più rotonda e formano grumi cellulari.
Come previsto, dopo cinque giorni di trattamento con acido retinoico, i grumi si rilassano e le cellule si diffondono. Dopo altri tre giorni di trattamento con fattore neurotrofico derivato dal cervello, le cellule appaiono uniformemente distribuite e interconnesse attraverso una rete di neuriti ramificati. Dopo la trasfezione tau-NLS o tau-NES, la localizzazione subcellulare tau può essere rilevata per immunofluorescenza con anticorpi anti-tau.
A seconda dell'efficienza della trasfezione, le cellule mostrano una forte colorazione nucleare che si fonde con il segnale DAPI dopo la trasfezione tau-NLS o una colorazione citoplasmatica con i nuclei vuoti dopo tau-NES. L'analisi western di Blot rivela l'arricchimento dell'actina all'interno della frazione citoscheletricha, della tubulina all'interno delle frazioni citoplasmatiche e citoscheletriche e dell'H2B all'interno delle frazioni nucleari. L'analisi western Blot conferma anche l'espressione di tau taggato e non taggato all'interno del compartimento nucleare e trasportatore di glutammato vescicolare un'espressione nell'estratto totale.
Infatti, il rapporto di tau nelle frazioni nucleari e citoplasmatica solubili evidenzia il fatto che tau-NLS è altamente arricchito nella frazione nucleare solubile mentre tau-NES è diminuito. Inoltre, tau-NLS è arricchito nella frazione legata alla cromatina rispetto alla frazione citoplasmatica mentre tau-NES è diminuito. Assicurarsi di controllare attentamente il numero di cellule utilizzate per il frazionamento di ciascun campione e di verificare l'arricchimento dei geni delle pulizie nelle frazioni corrette.
Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di isolare i compartimenti cellulari e valutare il ruolo funzionale del tau nel nucleo.
