Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia endoteliale, come perché i vasi sanguigni hanno differenze regionali nello sviluppo dell'aterosclerosi? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente lo studio simultaneo di più condizioni in condizioni di sollecitazione di taglio o più condizioni di sollecitazione di taglio. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la comprensione della regolazione genica endoteliale sia nel sistema arterioso che in quello venoso perché possono essere utilizzate varie portate e modelli.
Bene, qui, dimostriamo un sistema che utilizza un flusso laminare costante. La configurazione può essere adattata per altri modelli di flusso, incluso il flusso disturbato. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo faranno fatica a mantenere un monostrato continuo di cellule per tutta la durata dell'esperimento e ad ottenere risultati coerenti tra gli esperimenti.
24 ore prima dell'analisi, contare le cellule endoteliali umane in un passaggio precoce e seminare circa una volta 10 alla sesta cella in un millilitro di mezzo su uno scivolo di vetro rivestito di fibronectina per pozzo di una piastra di coltura cellulare a quattro pozzetti. Consentire alle celle di aderire alla diapositiva per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi coprire ogni diapositiva con tre millilitri di mezzo e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare di 37 gradi Celsius e 5%CO2 per 24 ore.
Il giorno dell'esperimento, riempire il vassoio dell'acqua di un ambiente grande, riscaldato e integrato con CO2 e calore regolabili, o incubatore da spiaggia, con più ripiani, accesso elettrico interno e porte di vetro, e confermare che è disponibile un'adeguata anidride carbonica per l'esperimento e che il monitor di CO2 è funzionale. Per impostare la camera di flusso, inserire un'esca femminile da 1/8 pollice in un'estremità di un tubo morbido numero 16 e attaccare un fermacock a quattro linee all'esca. Attaccare l'estremità libera del tubo al lato di afflusso della piastra superiore e inserire un'esca maschile da 1/8 di pollice in un'estremità di un secondo tubo morbido numero 16.
Attaccare un fermagante a quattro lati all'esca maschile e attaccare l'estremità libera del tubo al lato di deflusso della piastra superiore. Inserire un'esca maschile da 1/8 di pollice e un'esca femminile da 1/8 di pollice in ogni estremità di un terzo tubo morbido numero 16 e attaccare il tubo a una trappola a bolle tramite l'esca maschile da 1/8 di pollice. Quindi attaccare un fermagante a quattro vie all'altra estremità del tubo tramite l'esca femminile.
Utilizzando pinzette sterili, trasferire uno scivolo di vetro seminato a cella nella rientranza sulla piastra inferiore, lato seminato a celle verso l'alto. Utilizzare una siringa da 10 millilitri per aggiungere 10 millilitri di mezzo caldo alla piastra inferiore all'interno della linea di guarnizione rossa intorno alla piastra. Consentire al mezzo di fluire attraverso lo scivolo e coprire le celle.
Posizionare delicatamente la piastra superiore sulla piastra inferiore facendo attenzione ad allineare i lati e avvitare saldamente le piastre. Per rimuovere le bolle d'aria dalla trappola a bolle, aprire prima i fermagli dell'afflusso e della trappola a bolle e chiudere il punto di arresto del deflusso. Quindi utilizzare una siringa da 30 millilitri per sciacquare delicatamente 20 millilitri di mezzo caldo attraverso la piastra.
Per rimuovere le bolle dalla camera, chiudere il fermagli della trappola a bolle e aprire il pavone di deflusso. Elevare il lato di deflusso della camera a un angolo di 45 gradi e utilizzare la siringa da 30 millilitri per sciacquare delicatamente 20 millilitri di mezzo caldo dal lato di afflusso della camera. È importante sciacquare ad una velocità appropriata nella direzione del flusso e utilizzare il microscopio per confermare che rimane un monostrato confluente di cellule prima di esporre le cellule al flusso laminare.
Quindi chiudere i tappi su entrambi i lati della camera e del cappuccio e confermare che le cellule sono ancora attaccate allo scivolo al microscopio luminoso. Posizionare la camera di flusso e un sistema di loop di flusso precedentemente assemblato in spiaggia e diminuire lentamente la velocità della pompa dell'assieme del loop di flusso prima di mettere in pausa del tutto la pompa. Chiudere i fermanti sul sistema di loop di flusso per evitare perdite e collegare il sistema a camera e loop insieme tramite fermanti.
Quando tutti i loop sono stati collegati, riaprire tutti i fermaglio e aumentare lentamente la velocità della pompa durante il monitoraggio della configurazione per eventuali perdite o blocchi. Posizionare il sensore di flusso sul tubo del ponte della camera del lato di afflusso della camera con il sensore orientato nella direzione del flusso e regolare la velocità della pompa per ottenere la portata per la velocità di sollecitazione di taglio di interesse. Quindi accendere il serbatoio di CO2 per ottenere una concentrazione del 5%C02.
Una volta completato il periodo di flusso sperimentale, ridurre lentamente la velocità della pompa peristaltica a zero e spegnere l'alimentazione. Chiudere rapidamente tutti i fermanti aperti e trasferire la camera e il tubo attaccato con un fermacock su ciascun lato su un piano di panca pulito. Svitare con cura tutte le viti per rimuovere la piastra superiore e utilizzare una pinzetta per il naso dell'ago per trasferire lo scivolo di vetro dalla piastra inferiore a un piatto di 100 millimetri di diametro.
Lavare lo scivolo in 10 millilitri di PBS freddo e controllare le cellule al microscopio per confermare l'aderenza e l'allineamento cellulare nella direzione del flusso. Dopo aver aspirato il PBS, trasferire il vetrino in un piatto pulito da 100 millimetri di diametro e aggiungere 350 microlitri di tampone di lysis integrati con 1/100° di Beta-Mercaptoetanolo da un kit di estrazione dell'RNA allo scivolo. Utilizzare un raschietto per cellule lame di polietilene per raschiare le cellule dal vetrino e inclinare il piatto di coltura tissutale per consentire al tampone di raggrupparsi nella parte inferiore.
Utilizzare le forcep per rimuovere lo scivolo e pipettare la lisciviazione cellulare in un tubo da 1,5 millilitri sul ghiaccio. Quindi aggiungere 10 microlitri di RNA luciferasi diluito al lisato cellulare per l'isolamento e l'analisi dell'RNA a valle secondo protocolli standard. Una corretta linearizzazione del plasmide luciferasi utilizzando enzimi di restrizione può essere confermata eseguendo i prodotti digeriti su un gel di agarosio e le dimensioni del prodotto linearizzato possono essere confermate con scale di DNA e rispetto a un plasmide non tagliato.
I processi di fabbricazione possono portare a piccole variazioni nell'altezza della camera, quindi la portata deve essere calcolata per ogni camera per ottenere la stessa sollecitazione di taglio. Per esperimenti che incorporano stress da taglio laminare nelle cellule endoteliali dei mammiferi, l'RNA della lucciola luciferasi può essere usato come spike-in di RNA esogeno. La normalizzazione del gene di riferimento endogeno, del gene di riferimento esogeno e dei geni di riferimento endogeni ed esogeni insieme produce risultati simili.
Da notare che in questi esperimenti rappresentativi che utilizzano due camere di flusso con corsa simultanea con sollecitazione di taglio ad un Pascal per ogni esperimento, Kruppel come il fattore due knockdown tramite SI-RNA ha prodotto un'efficienza di abbattimento simile tra i campioni biologici testati. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di stabilire un monostrato uniforme di cellule sullo scivolo e di profusire il sistema di loop di flusso prima di attaccare la camera di flusso. Seguendo questa procedura, altri metodi, come il sequenziamento dell'RNA, possono essere utilizzati per valutare l'espressione dell'RNA a livello genomico e altre letture, come DNA e proteine, possono essere utilizzate per ulteriori analisi molecolari.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia endoteliale per esplorare la relazione tra stress da taglio e potenziale angiogenico nelle cellule endoteliali umane.
