Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'intervento terapeutico immunosoppressivo per lo studio degli effetti avversi dei farmaci sulla rigenerazione tissutale, in particolare nelle ossa. Il principale vantaggio di questa tecnica è che combina modelli passati di rigenerazione ossea zebrafish con esposizione sistemica al farmaco mediante immersione del pesce zebra ferito in acqua di pesce integrata nel farmaco. Prima di iniziare la procedura, l'autoclave di un foglio di alluminio copriva un bicchiere da 600 millilitri per Zebrafish e un numero appropriato di bottiglie di vetro di acqua di pesce per l'esperimento e preparava il farmaco immunosoppressivo in soluzioni sperimentali di controllo di interesse.
Per una lesione da amputazione, utilizzare forcep smussate per posizionare con cura un zebrafish anestetizzato sul lato laterale sul coperchio inverso di una piastra di Petri di 100 millimetri e utilizzare un bisturi per resect 50% della pinna. Quindi mettere il pesce in un bicchiere autoclavato contenente 300 millilitri di acqua di pesce integrato con un agente sperimentale appropriato e coprire il becher con un foglio per evitare la fuga di Zebrafish. Per indurre una lesione alla frattura della pinna, posizionare un zebrafish anestetizzato sul lato laterale in una piastra di Petri rivestita di agarosio di 100 millimetri sotto un microscopio sezionante e spingere leggermente un ago di iniezione in un segmento di raggi di pinna ossea fino a quando non appare una crepa.
È importante introdurre non troppe fratture nella pinna perché ciò potrebbe compromettere notevolmente la stabilità. Quindi trasferire il pesce in un bicchiere autoclavato contenente 300 millilitri di acqua di pesce integrati con l'agente sperimentale appropriato. Per generare una lesione al cranio calvariale, tenere un zebrafish anestetizzato in posizione verticale in modo che le ossa calvariali siano facilmente visualizzate al microscopio a dissezione.
Posizionare un micro trapano rotante dotato di una punta di perforazione di 500 micrometri sopra il centro dell'osso frontale e toccare delicatamente l'osso per produrre un foro delle dimensioni della bave del micro trapano. È fondamentale non spostare lateralmente il trapano durante la produzione della lesione e fermarsi immediatamente una volta che la resistenza del tessuto cade. Altrimenti, il cervello sarà danneggiato.
Quindi mettere il pesce in un bicchiere autoclavato contenente 300 millilitri di acqua di pesce integrati con l'agente sperimentale appropriato. Cambiare l'acqua nei becher ogni giorno trasferendo il pesce zebra e l'acqua di pesce in un contenitore temporaneo appropriato e riempiendo il becher con acqua di pesce integrata con droghe fresche. Quindi usa una rete di pesce per riportare il pesce zebra al suo becher.
Per trattamenti della durata totale fino a due giorni, non nutrire gli Zebrafish. Durante gli esperimenti più lunghi, dai da mangiare allo Zebrafish con da 0,5 a un millilitro di Artemia SSP tratteggiata ogni secondo giorno. Per l'analisi delle lesioni alla pinna, raccogliere la fine e utilizzare forcep fini per afferrare la pinna su un bordo del ceppo.
Utilizzare un secondo paio di forcelle per afferrare il bordo del ceppo opposto e premere leggermente il tessuto sul fondo del piatto che contiene freddo 4%PFA per 10-20 secondi. Ripetere l'appiattimento delle pinne se necessario. La pinna ora dovrebbe giacere piatta senza arricciarsi.
Per la conservazione a lungo termine del campione dopo la fissazione, lavare il tessuto con tre lavaggi PBS di 20 minuti e una serie crescente di metanolo. I campioni possono quindi essere conservati in metanolo al 100% a meno 20 gradi Celsius. Per la colorazione rossa di Alizarina, il metanolo reidrato ha immagazzinato campioni in una serie di metanolo discendente seguita da due lavaggi di 20 minuti in PBS e un lavaggio di cinque minuti in acqua deionizzata.
Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere la soluzione di Alizarin Red al tessuto campione e incubare il campione a temperatura ambiente con dondolo per l'appropriato periodo di colorazione. Per cancellare i campioni, trattare il tessuto con la diminuzione dell'1% di idrossido di potassio serie di glicerolo. Quindi conservare i campioni in una soluzione di idrossido di potassio da uno a uno allo 0,1% all'80% di glicerolo e montare i tessuti con l'80% di glicerolo per l'immaginazione.
Per la colorazione Calcein, incubare fino a tre Zebrafish contemporaneamente in soluzione di Calcein da 100 millimetri per 20 minuti in un bicchiere ricoperto di foglio di alluminio. Alla fine dell'incubazione, trasferire il pesce zebra in un contenitore di acqua di pesce e lasciare che il pesce nuoti brevemente prima di trasferirli in un nuovo contenitore di acqua di pesce. Dopo 20 minuti nel secondo becher per acquisire immagini dal vivo di rigenerazioni di pinne, posizionare un zebrafish anestetizzato su una piastra di Petri rivestita di agarosio e osservare la pinna tramite microscopia stereo.
Per acquisire immagini delle ossa del cranio rigeneranti, posizionare il pesce zebrato in posizione verticale in una spugna e immagini il cranio mediante microscopia a fluorescenza. Il trattamento con Prednisolone, simile ad altri glucocorticoidi, porta ad un'inibizione generale della rigenerazione delle pinne compresa la formazione ossea come rilevato dalla colorazione rosso alizarina del tessuto delle pinne caudali fisse. Allo stesso modo, il farmaco ha un effetto ritardante sulla chiusura della lesione cranica calvariale.
A causa dell'immunosoppressione, il numero ridotto di macrofagi può anche essere rilevato mediante immunoistochimica su sezioni di tessuto congelato come evidenziato dall'uso di colorazione anticorpale anti-mCherry e anti-GFP e MPEG-1 mCherry transgenico incrociato con Osterix NGFP Zebrafish su campioni di tessuto craschi zebrafish di animali trattati con Prednisolone. Durante il tentativo di queste procedure è importante ridurre al minimo la variabilità della velocità di rigenerazione ossea eseguendo i saggi di lesione in modo altamente riproducibile. È anche fondamentale ospitare singolo Zebrafish in becher autoclavati contenenti acqua di pesce autoclavata al fine di evitare infezioni microbiche.
Questo protocollo contribuirà ad affrontare ulteriormente i meccanismi sottostanti dell'azione glucocorticoide. Ad esempio, nel contesto dell'osteoporosi indotta da glucocorticoidi e può anche essere adattato per l'uso di altri farmaci e di altri ossa di Zebrafish.
