Gli autori vorrebbero dopo impianto di microscopia Jenkins all'Università del Wyoming per il loro aiuto e i membri del laboratorio Bushman, Kelly Roballo, Hayden True, Wupu Osimanjiang e Dhunghana di Subash, per assistenza nella cura degli animali. Questa pubblicazione è stato reso possibile da un premio per lo sviluppo istituzionale (IDeA) dal National Institute of General Medical Sciences, della National Institutes of Health, sotto Grant n. 2P20GM103432.

Questo progetto sono stati utilizzati ratti Sprague Dawley adulti e tutte le procedure sono state approvate dal comitato di uso e cura degli animali istituzionali di Università del Wyoming.
1. chirurgia e nel Vivo del nervo fissazione
Nota: Informazioni sul fornitore per tutti i materiali e le attrezzature utilizzate in questo protocollo sono elencati nella Tabella materiali.
Nota: In vivo la fissazione del nervo viene utilizzata per conservare i tessuti e ridurre il degrado strutturale che può verificarsi tra il momento della morte e raccolta dei nervi. Fissazione del tessuto in vivo è una pratica standard per la preparazione del tessuto del sistema nervoso per l'istologia, dove la perfusione è spesso un precursore di questo. Il posizionamento e le dimensioni dei nervi periferici ha permesso per la fissazione in situ. Si sconsiglia di accumulazione e fissazione del tessuto dopo l'eutanasia a causa della possibilità di degradazione del tessuto.
<ol><li>Preparare il ratto per anestesia generale collocandolo in una camera di induzione con 2-3% isoflurane, poi posizionare il ratto anestetizzato in posizione prona sulla cima di una stuoia di dissezione e mantenere a 1-2% di isoflurane via anestetica cono di naso. Per garantire un'adeguata profondità dell'anestesia, test animali per pedale ritiro alle zampe posteriori e verificare l'assenza di riflessi palpebrali agli occhi toccando il canthus mediale dell'occhio. Nota: L'iniezione intraperitoneale di ketamina è un'alternativa comunemente usata per via inalatoria isoflurano.</li>
	<li>Per esporre il nervo sciatico, radersi i capelli dell'hind limb(s) e pulire le zone rasate con etanolo al 70%. Con un bisturi o forbici, praticare un'incisione di 2-3 cm in pelle lungo l'arto dal ginocchio fino al grande trocantere, dove palpazione del femore utilizzando il bisturi sterile per accertare la corretta posizione dell'incisione. Il femore si trova appena prossimale rispetto al segmento più accessibile del nervo sciatico. Anche se si tratta di un intervento chirurgico non-sopravvivenza, mantenere tecniche sterili.</li>
	<li>Dopo aver effettuato l'incisione cutanea, individuare l'aereo tra il muscolo bicipite femorale e del muscolo di maximus del gluteus e usando le forbici microdissection separare la fascia sottostante ed esporre 2-3 cm del nervo sciatico sottolineatura. Per esporre una sezione trasparente del nervo sciatico, è necessario utilizzare un riavvolgitore per ampliare il divario tra i due muscoli (Figura 1A). Con una pinzetta e forbici iris, separare con cura il nervo dal tessuto connettivo, ponendo la massima cura di non comprimere o tagliare il nervo circostante.</li>
	<li>Aggiungere fissativo sufficiente Trump (4% formaldeide, glutaraldeide al 1% in PBS 1X (tamponato fosfato salino) con 1,16 g di NaH2PO4· H2O / 100 mL) nella cavità contenente il nervo per coprire il nervo e lasciate riposare per 10 min. Se necessario, garza posto sotto la cerva gamba per migliorare l'angolo in modo che altro fissativo può essere aggiunto nella cavità. Rimuovere il fissativo dopo 10 min e ripetere questo passaggio altre due volte.</li>
	<li>Usando un microscopio per dissezione, tagliare il nervo da entrambi i lati utilizzando forbici dissezione bene, facendo attenzione a non allungare o pizzicare il nervo sciatico e subito messo le sezioni del nervo in provette da 15 mL contenenti fissativo di briscola a 4 ° C per una settimana, cambiando il fissativo ogni 48 h.</li>
	<li>Non lasciare gli animali incustoditi durante qualsiasi parte della procedura chirurgica. Dopo la rimozione del nervo, eutanasia animali di dislocazione cervicale mentre sotto anestesia.</li>
</ol>2. trattamento tetrossido di osmio e l'incorporamento di resina
<ol><li>Post di fissazione, attentamente rimuovere qualsiasi residuo grasso e tessuti connettivi dal nervo e utilizzare un bisturi affilato per tagliare il nervo in segmenti di circa 5 mm di lunghezza (nervo segmenti possono essere separati e identificati in diversi tubi). Preparare fresco tetrossido di osmio 2% diluito in soluzione fissante di Trump e tenere in un tubo di vetro. Immergere i segmenti del nervo in tetrossido di osmio 2% per 2 h, che può essere in tubi di plastica per questo breve periodo di tempo. Nota: Alcuni tubi di plastica reagiscono con tetrossido di osmio, causando un oscuramento della soluzione, in modo prolungato stoccaggio di tetrossido di osmio in tubi di plastica non è raccomandato.</li>
	<li>Utilizzando una resina epossidica embedding kit medium, preparare la formula finale di incorporamento:<ol>
<li>Mescolare la resina epossidica mezzo di inclusione con soluzione DDSA (anidride dodecenylsuccinic; miscela A) e mescolare la resina epossidica mezzo di inclusione con soluzione NMA (anidride methylnadic; miscela B). Lasciare entrambe le miscele A e B mescolare per almeno 20 minuti agitando con un agitatore magnetico.</li>
		<li>Immediatamente prima dell'uso mescolare la miscela A e B e aggiungere l'acceleratore DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) nella proporzione di 1.5-2.0% del volume totale della miscela. Si noti che la soluzione DPM-30 dovrebbe essere misurata proprio per evitare il blocco da diventando di colore scuro e fragili. Tutti i prodotti chimici resina sono tossici; prestare particolare attenzione per evitare il contatto con la pelle o per inalazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzando provette da 1,5 mL, lavare segmenti del nervo con PBS e iniziare il processo di disidratazione collocando i segmenti del nervo in acetone/distillata diversi passaggi dell'acqua: 30%, 60%, 90%, concentrazioni per 10 minuti ciascuno, quindi in 100% di acetone 3 volte per 10 minuti ciascuno.  Si noti che l'etanolo può essere utilizzato al posto di acetone.</li>
	<li>Per l'infiltrazione di resina, posizionare i segmenti del nervo in una miscela di 1 parte della miscela finale di incorporamento e 1 parte 100% acetone per 30 min, poi in una miscela di 2 parti della miscela finale di incorporamento e 1 parte 100% acetone per 30 min , e infine posto il nervo segmenti in finale l'incorporamento di miscela per 30 min.</li>
	<li>Mettere i segmenti del nervo in incorporamento stampi in gomma siliconica (ci hanno usato Lunghezza 106 mm x 71 mm di larghezza x profondità mm 7; bloccare Dimensione Lunghezza 11 mm x 6 mm di larghezza x 3 mm di profondità). Aggiungere delicatamente la resina sopra i nervi, facendo attenzione a coprire i segmenti di intero nervo evitando bolle d'aria. Lasciare lo stampo contenente segmenti di nervo con la resina per polimerizzare a 60 ° C durante la notte.</li>
</ol>3. sezionamento di ultramicrotomo
<ol><li>Preparare la lama di vetro usando un coltellinaio di vetro (Figura 1B) e fare vetro coltelli con barche (Figura 1), che vengono utilizzati per raccogliere le sezioni del nervo che galleggia sull'acqua distillata.</li>
	<li>Posizionare blocchi nervosi resina incorporato nel supporto ultramicrotomo con il trapezio lato rivolto verso l'alto. Utilizzando l'ambito di ultramicrotomo, tagliare qualsiasi eccesso di resina che circonda il tessuto nervoso e rendere il blocco di affrontare una forma trapezoidale e come vicino alla superficie longitudinale del nervo possibile usando una lama di taglio singolo, come una lama di rasoio. Non penetrano la superficie longitudinale del segmento del nervo, che è riconoscibile per la sua colorazione scura di tetrossido di osmio. Nota: Rimozione della resina in eccesso riduce l'area della resina essere sezionato e migliorare le prestazioni di lama e taglio nei passaggi successivi.</li>
	<li>Utilizzando l'ultramicrotomo, rendere più sezioni trasversali sufficiente esporre una superficie di sezione trasversale uniforme del tessuto del nervo usando un coltello di vetro normale. Una volta fatto questo, passare a un coltello di vetro cui barca è riempito con acqua distillata a temperatura ambiente e regolare l'ultramicrotomo a 1-2 μm per tagliare sezioni sottili.</li>
	<li>Trasferimento sezioni sottili galleggiante dalla barca di coltello di vetro a una goccia d'acqua deionizzata su vetrino con anello in metallo (Figura 1). A secco diapositive contenente sezioni passando più volte sopra una fiamma per pochi secondi, facendo attenzione a non surriscaldare le sezioni. Macchia secche sezioni immediatamente con toluidina blu o conservare a temperatura ambiente per diversi giorni prima della colorazione. Nota: Sezioni possono essere asciugati anche utilizzando una piastra scalda a 60 ° C per 15 min. Un lento processo di essiccazione rende liscia le sezioni.</li>
</ol>4. blu di toluidina colorazione
<ol><li>Preparare la soluzione di 1% di blu di toluidina sciogliendo 2 g di borato di sodio in 100 mL di acqua deionizzata, quindi aggiungere 1 g di blu di toluidina e mescolare fino a scioglimento. Filtrare la soluzione utilizzando carta da filtro (dimensione dei pori: 11 µm) e mantenere la soluzione in un flacone opaco a temperatura ambiente fino a due settimane.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta di plastica o micro pipetta, aggiungere una goccia di soluzione di blu di toluidina nella parte superiore le sezioni del nervo e lasciare per 20-30 s.</li>
	<li>Lavare via tutte le soluzione di blu di toluidina in eccesso delicatamente immergendo i vetrini in acqua deionizzata vaschetta e ripetere 3 - 4 volte fino a quando le sezioni sono chiare. Asciugare i vetrini almeno 15 min a 60 ° C o una notte a temperatura ambiente e poi coprire le sezioni con un vetrino coprioggetto utilizzando il mezzo di montaggio regolare. Esaminare le diapositive montate immediatamente o conservare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Esaminare sotto un microscopio chiaro. Un obiettivo ad immersione X 100 è consigliato per immagini dettagliate utilizzate per calcolare i rapporti di g.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+between+angiogenesis+and+neural+development:+What+small+animal+models+can+tell+us.">Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us.</a> Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).</li><li>Grinsell, D., Keating, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+reconstruction+after+injury:+A+review+of+clinical+and+experimental+therapies.">Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies.</a> BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).</li><li>Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+fillers+in+nerve+conduits+for+peripheral+nerve+repair.">Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair.</a> Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).</li><li>Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+paraffin-embedded+myelin+sheath+staining+with+osmium+tetroxide+for+light+microscope+observation.">A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+part+II-morphological+techniques.">Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques.</a> International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+myelin+sheath+and+collagen+reorganization+pattern+in+a+model+of+peripheral+nerve+regeneration+using+an+integrated+histochemical+approach.">Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach.</a> Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).</li><li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue:+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility.">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).</li><li>Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue+and+Lugol's+iodine+application+in+the+assessment+of+oral+malignant+disease+and+lesions+at+risk+of+malignancy.">Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 21, 160-163 (1992).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+assessment+in+peripheral+nerve+tissue+engineering.">Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering.</a> Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).</li><li>Dykstra, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , 257 (1993).</li><li>Vleggeert-Lankamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+evaluation+methods+in+the+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration+through+synthetic+conduits:+A+systematic+review.">The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).</li><li>Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+uses+and+methods+of+processing+of+fresh+frozen+sections+of+peripheral+nerve.">Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve.</a> Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).</li><li>Castro, J., Negredo, P., Avenda&#241;o, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve+and+its+modification+during+regeneration+through+a+sieve+electrode.">Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode.</a> Brain research. , 65-77 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+Part+II-morphological+techniques.">Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques.</a> International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).</li><li>Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., B&#246;cker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microstructured+and+interconnected+pore+channels+in+a+collagen-based+nerve+guide+on+axonal+regeneration+in+peripheral+nerves.">The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves.</a> Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).</li><li>Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+nerve+biopsies:+A+practical+guide+for+neuropathologists.">Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists.</a> Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).</li><li>Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+repair+by+means+of+vein+filled+with+muscle+grafts.+II.+Morphological+analysis+of+regeneration.">Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration.</a> Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).</li><li>Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+staining+methods+for+resin-embedded+peripheral+nerve.">Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve.</a> Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).</li><li>Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+immunohistochemistry+on+improved+glycol+methacrylate-resin+sections.">High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections.</a> Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).</li><li>Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+stains:+A+literature+review+and+case+study.">Histological stains: A literature review and case study.</a> Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).</li><li>Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+and+nonporous+nerve+conduits:+the+effects+of+a+hydrogel+luminal+filler+with+and+without+a+neurite-promoting+moiety.">Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety.</a> Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).</li><li>Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+glue+as+a+stabilization+strategy+in+peripheral+nerve+repair+when+using+porous+nerve+guidance+conduits.">Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun conflitto di interessi.

Gli esami delle strutture morfologiche della lesione del nervo periferico e la rigenerazione sono soggetti frequenti di Studio13. In questo protocollo, descriviamo la procedura per ottenere immagini di alta qualità per quantificazioni di dati istologici utilizzando tessuto di nervo sciatico del ratto incorporato in blocchi in resina e colorato con blu di toluidina. Questa tecnica fornisce un'immagine della morfologia del nervo in cui la rigenerazione del nervo può essere quantificata misurando il numero di assoni, grado di mielinizzazione, presenza di tessuto fibrotico infiltrativo e i nervi di salute. Mentre le immagini mostrano sezionamento e lavorazione dei nervi illesi come campioni, gli stessi passaggi e materiali sono applicabili ai nervi feriti e nervi rigenerati con canalette o tessuto innesti, fornito tale fissazione del tessuto è adeguata20, 21.
Mentre tutti i passaggi del protocollo sono essenziali, alcuni di questi passaggi sono più probabilità di portare a sezioni di scarsa qualità o immagini. Disidratazione del tessuto insufficiente può condurre ai fori nelle sezioni del nervo (figura 5B). Una possibile spiegazione è l'immiscibilità di resina con acqua, e l'acqua in eccesso nel tessuto impedisce l'infiltrazione del tessuto di resina. Di conseguenza, permettendo un tempo sufficiente e l'uso di acetone assoluto è essenziale per garantire il passaggio di disidratazione corretta. Anche se abbiamo usato acetone in questo protocollo, etanolo può anche essere utilizzato. Molte resine, tuttavia, non sono reattive con etanolo, così il tessuto dovrà essere trattato con ossido di propilene per servire come una transizione tra la disidratazione di etanolo e l'incorporamento di resina.
A causa della magrezza delle sezioni, trasferimento sezioni del nervo del coltello di vetro sul vetrino deve essere effettuato con grande cura (Figura 5). 1-2 μm sezioni sono molto fragili, e improprio trasferimento della sezione potrebbe causare la sezione di rompere. Se la sezione è raccolto nella parte centrale della sezione con un ago, la sezione è incline a piegare su se stesso e spesso sarà difficile da spiegare quando trasferito alla diapositiva. Diversi strumenti possono essere utilizzati per il trasferimento della sezione sul vetrino, compresi aghi e loop, e ciascuno deve essere testato per l'utente specifico determinare che produrrà la migliore trasferimento di risultati. Per i nostri scopi, utilizzando un ciclo che potrebbe comprendere l'intera sezione notevolmente ridotto la piegatura delle sezioni quando sono stati trasferiti dal coltello di vetro per il vetrino da microscopio (Figura 1).
In generale, la gestione corretta dei nervi è essenziale come compressione dei nervi possa causare crepe si verificano nelle sezioni del nervo (Figura 5A). Compressione del tessuto di nervo può accadere durante il trasferimento di segmenti del nervo nei processi di esposizione in animale, fissazione, disidratazione e l'incorporamento di resina. Per evitare la compressione del nervo del tessuto, segmenti del nervo dovrebbero essere trasferiti da una pinzetta e raccolto su un'estremità del segmento idealmente da solo lo strato epineurial, così l'intero nervo non ne risentiranno. La presenza di crepe e linee (segni di coltello) nelle sezioni del nervo può verificarsi anche a causa di vetro opaco o abusato coltelli. Per garantire il sezionamento ottimali, si consiglia di making coltelli bicchiere fresco e cambiando il coltello di vetro che ogni 25-30 tagli, meno se sezionamento tramite nervo racchiuso all'interno di un condotto.
Le resine può essere relativamente costose, sono inadeguate quando sezioni longitudinali del nervo sono necessari e possono richiedere costosi strumenti quali un ultramicrotomo e un coltellinaio di vetro. Nonostante queste limitazioni, sezioni di toluidina blu macchiatura della resina incorporata periferico del nervo è ancora considerato il gold standard per la visualizzazione di sezioni trasversali di nervo periferico morfometria4,5. Sezioni longitudinali può anche rivelare caratteristiche importanti dei nervi periferici, come continuità assonale e nodi di Ranvier, ma è più utile con immunohistochemistry. In questi casi è la prassi generale per elaborare differenzialmente due sezioni del nervo stesso, uno per toluidina blu sezioni trasversali e l'altro per l'immunoistochimica longitudinale. A causa della maggiore incidenza del trauma periferico del nervo e le lesioni e le esigenze di un modo migliore di valutare strutture morfologiche del nervo, questo metodo può continuare ad essere applicata come strumento essenziale per ottenere dati istologici di danno del nervo e di rigenerazione.

Nervi periferici si estendono in tutto il corpo, che innervano tessuti bersaglio con assoni sensoriali o motori1. Nervo periferico difetti causati da patologie mediche e trauma rappresentano un problema importante di sanità pubblica e avere grande impatto economico2,3. Nonostante i progressi nel valutare gli esiti delle lesioni del nervo periferico e comprensione di rigenerazione del nervo, metodi tradizionali come l'istologia del nervo e tecniche di colorazione sono strumenti essenziali per qualitativamente e quantitativamente valutare la salute del nervo come una misura di esito terminale in modelli animali o asportato tessuto umano. Questo è spesso accoppiato con misurazioni elettrofisiologiche della funzione di nervo periferico, dove morfometria può rivelare perché rigenerazione funzionale del nervo ha fatto o non si è verificato.
Blu di toluidina colorazione di sezioni semi-sottile nervo periferico resina incorporata è un metodo specializzato per l'imaging di fibre di nervo myelinated, fornendo l'alta qualità e immagini dettagliate di strutture nervose4,,5,6 chiare . Blu di toluidina è una macchia di leucodistrofia acidofile, scoperta da William Henry Perkin nel 18567ed è stato utilizzato in diverse applicazioni mediche8. Sezioni blu-macchiato del nervo periferico di toluidina ottenute da segmenti di resina-incastonato del nervo consente una visualizzazione chiara delle strutture nervose. Visualizzazione della struttura della guaina di mielina può essere migliorata mediante l'uso di osmio tetrossido di post-fissazione4,9. Tetrossido di osmio è un ossidante e del lipido fissativo agente tossico che interagisce con i legami doppi in lipidi, con conseguente crudamente definito foderi di myelin ricca di lipidi10. Tuttavia, tetrossido di osmio è tossico, costoso, richiede un'incubazione più lungo dei segmenti del nervo e non viene sempre utilizzato.
Metodi alternativi di lavorazione e colorazione sono stati sviluppati per la visualizzazione della morfologia del nervo periferico; Paraffina, sezionamento criogenico e resina epossidica resina-incastonato del nervo sezionamento seguita mediante colorazione con blu di toluidina o soluzione fenilendiamina è stato utilizzato per quantificare i cambiamenti morfologici del nervo periferico rigenerazione 11,12 . Questi metodi ogni hanno vantaggi e resa essenziale dati sul numero di assoni, mielina spessore, diametro dell'assone e diametro dell'assone a fibra myelinated diametro (g-ratio) 11,13,14,15 .
La distinzione principale di resina-incorporare in questo protocollo è che facilita ottenere sezioni di spessore 1-2 μm a causa della durezza della resina pur mantenendo le qualità istologiche del nervo. Queste sezioni sottili, in contrasto con le sezioni di spessore di 4-5 μm ottenute da paraffina incorporamento, forniscono sezioni periferiche del nervo con risoluzione superiore, consentendo una più accurata quantificazione del myelination assone, come il rapporto di g, che non può essere ottenuti da più spesso sezioni16. Mentre criogenico di sezionamento può essere utilizzato per ottenere le sezioni 1-2 µm, è stato la nostra esperienza che è più difficile da ottenere sezioni senza numerose fessure di grandi dimensioni. Tali sezioni fessurate possono causare imprecisi conteggio del numero degli assoni e aspetti di mielinizzazione.
Oltre alla macchiatura17blu di toluidina, un argento che macchia il metodo18 e di colorazione tricromica di Masson4 utilizzabile anche per mostrare gli assoni del nervo. Tuttavia, utilizzando resina l'incorporamento delle sezioni del nervo mediano di ratto macchiato con ematossilina ed eosina o di Masson tricromica ha mostrati deboli foderi di myelin e strutture non riconosciuti, considerando che la macchiatura blu della toluidina ha mostrato la guaina mielinica chiara immagine e può facilmente essere quantificati4. Nonostante alcune limitazioni, i nervi che macchia di resina incorporata periferico blu di toluidina è una tecnica importante che può essere utilizzata quando sono necessarie immagini ad alta risoluzione della morfologia del nervo.
Lo svantaggio principale per l'incorporamento di resina è che richiede tempo e non consente di immunostaining del tessuto stesso a causa della difficoltà di ricupero dell'antigene rispetto alla paraffina e tecniche di sezioni congelate incorporato. Così, non è generalmente possibile utilizzare lo stesso tessuto per immunostaining che viene elaborato tramite l'incorporamento di resina per la macchiatura blu della toluidina. Anche se non usato qui, se non si desidera immunohistochemistry in resina sezioni embedded, l'utilizzo di incorporamento resine di metacrilato di glicole consente immunohistochemistry essere eseguita su sezioni di tessuto, ma è relativamente costoso19. Questo può essere un po' mitigato tagliando il nervo periferico in segmenti separati, alcuni per l'incorporamento di resina ed altri per l'immunocolorazione direttamente dopo la fissazione.
Il processo di macchiatura blu della toluidina di resina incorporati i nervi periferici, come con l'analisi istopatologica più, può essere suddiviso in cinque fasi, tra cui la fissazione, la disidratazione, l'incorporamento, sezionamento e macchiatura20. Qui ci proponiamo di fornire un protocollo e una guida pratica per l'utilizzo di resina incorporati ratto nervo sciatico sezioni macchiate con immagini di alta qualità per acquisire blu di toluidina.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1092">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:216px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">14200-075</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Glutaraldehyde Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Toluidine Blue O</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:216px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:137px;">205950010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:216px;">Piramal</td>
			<td style="width:137px;">NDC 66794-013-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Epoxy Embedding Medium Kit</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Hydroxide Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">72068</td>
			<td>To adjust Trump&#39;s fixative pH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Acetone</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:137px;">170942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Osmium Tetroxide Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">VWR Micro Slides, Superfrost Plus</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12545102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Pelco Embedding Cast</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC9671811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Glass Knife Maker</td>
			<td style="width:216px;">RMC Products</td>
			<td style="width:137px;">GKM-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:216px;">RMC Products</td>
			<td style="width:137px;">MT-XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">15 mL Conical Tube</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td>ISO 9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">4 mL Glass Vial</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>854190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">55411-050</td>
			<td>For trimming resin block</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">Perfect Loop</td>
			<td style="width:216px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:137px;">70944</td>
			<td>For picking up thin resin sections</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm</td>
			<td style="width:216px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:137px;">71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">100 Watt Oven</td>
			<td style="width:216px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:137px;">6350115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Whatman Filter Paper</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">3 mL plastic pipette</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">Z331740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Micro-surgical Kit</td>
			<td style="width:216px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Olympus fluorescence microscope</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology

Nervi periferici si estendono in tutto il corpo, che innervano tessuti bersaglio con gli assoni motori o sensoriali. Grazie alla distribuzione capillare, i nervi periferici sono spesso danneggiati a causa di trauma o della malattia. Come sono state sviluppate metodi e strategie per valutare la lesione periferica del nervo in modelli animali, funzione e rigenerazione, analizzando la morfometria del nervo periferico è diventata una misura essenziale risultato terminale. Sezioni di macchiatura del nervo trasversale blu di toluidina ottenute da sezioni del nervo resina incorporata è un metodo riproducibile per le valutazioni qualitative e quantitative dei nervi periferici, consentendo la visualizzazione del numero di morfologia degli assoni e grado di mielinizzazione. Questa tecnica, come con molti altri metodi istologici, può essere difficile da imparare e padroneggiare utilizzando protocolli standard scritte. L'intento di questa pubblicazione è pertanto per accentuare i protocolli scritti per la macchiatura dei nervi periferici con videografia del metodo, utilizzando i nervi sciatici raccolti dai ratti blu di toluidina. In questo protocollo, descriviamo in vivo fissazione del nervo periferico e raccolta del tessuto e la post-fissazione con 2% tetrossido di osmio, l'incorporamento dei nervi in resina epossidica e ultramicrotomo sezionamento dei nervi allo spessore di 1-2μm. Sezioni del nervo poi trasferito ad un vetrino e colorato con blu di toluidina, dopo che essi sono quantitativamente e qualitativamente valutati. Esempi dei problemi più comuni sono indicati, così come passaggi per attenuare questi problemi.

Resina incorporati nervo periferico sezioni colorate con toluidina blu consentono quantificazioni di accurati dati istologici. Una panoramica della procedura è illustrata nella (Figura 2). Nervo sciatico sezioni incorporato nel terreno di resina e colorato con blu di toluidina ha mostrato chiare immagini con risoluzione ottimale (figure 3). Danno del nervo può causare molti cambiamenti nel nervo strutture morfologiche, ad esempio, cambiamenti nelle fibre nervose, diametro dell'assone e spessore della guaina mielinica. Questo metodo può preservare la struttura nervosa nella sua forma naturale, che facilita la misura di diversi parametri come il rapporto del diametro dell'assone al diametro della fibra totale (g-rapporto; Figura 4). Una varietà di fattori può portare a sezioni meno ottimale del nervo periferico, tra cui la presenza di cricche (Figura 5A) nella sezione a causa di uso improprio del nervo. Fori possono verificarsi anche nella sezione (figura 5B) a causa di insufficiente disidratazione. Un altro possibile errore nella procedura è pieghevole delle sezioni (Figura 5), che possono essere risolto utilizzando loop da inoculo per sezione trasferimento su lastra di vetro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig1.jpg"> Figura 1: chirurgia e sezionamento. (A) del nervo sciatico del ratto durante la fissazione in vivo . (B) vetro coltello maker (C) vetro coltelli con la barca. (D) Anelli di metallo utilizzati per trasferire galleggiavano sezioni sottili dai coltelli di vetro per una goccia di acqua deionizzata su vetrino. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58031/58031fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig2.jpg"> Figura 2: schema del metodo utilizzato in questo protocollo. (A) adulti Sprague Dawley, ratto è anestetizzato, seguita da in vivo del nervo fissazione del nervo e (B) raccolta (C). Il passo successivo è post-fissazione con 2% tetrossido di osmio (D) e resina incorporamento (E). Incorporato del nervo sezioni sono poi tagliati (F) e sezionato (G) utilizzando un ultramicrotomo in resina. Infine, nervo sezioni su vetrino sono macchiati con toluidina blu (H). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58031/58031fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig3.jpg"> Figura 3: sezione trasversale di un nervo sciatico di ratto tinto con toluidina blu. Mostra sezioni sotto diversi ingrandimenti (10x, 20x, 40x e 60 X) di chiara immagine con risoluzione ottimale. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58031/58031fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig4.jpg"> Figura 4: sezione trasversale di un nervo sciatico di ratto tinto con toluidina blu. Questa immagine ad alta risoluzione (100 X) può essere utilizzata per misurare il rapporto del diametro dell'assone al diametro della fibra totale (g-rapporto). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58031/58031fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig5.jpg"> Figura 5: sezioni trasversali di un nervo sciatico di ratto tinto con toluidina blu sotto diversi ingrandimenti. Mostrato sonoaltri dei problemi che possono verificarsi durante l'esecuzione del presente protocollo. (A) e (B). La presenza di crepe e buchi all'interno della sezione del nervo causata da manipolazione impropria della sezione e insufficiente disidratazione del tessuto, rispettivamente. (C). Folding delle sezioni, che può accadere durante il trasferimento delle sezioni dai coltelli di vetro alla diapositiva. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58031/58031fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Qui presentiamo un protocollo per visualizzare strutture fini dei nervi periferici ottenendo e macchiatura blu 1-2 µm sezioni con toluidina

Blu di toluidina macchiatura delle sezioni incastonate in resina per la valutazione della morfologia del nervo periferico

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

toluidine-blue-staining-resin-embedded-sections-for-evaluation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.7K Views.  University of Wyoming. Qui presentiamo un protocollo per visualizzare strutture fini dei nervi periferici ottenendo e macchiatura blu 1-2 µm sezioni con toluidina

Video: Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Ricerca

Neuroscienze

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

Slice Cultura organotipica di GFP che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile stimulation is a positive early experience that mimics maternal licking and grooming in the rat. Exposing rat pups to this positive experience can be completed easily and cost-effectively by using highly accessible materials such as a household duster. Using a cross-litter design, pups are either stroked or left undisturbed, for 15 min, three times per day throughout the perinatal period. To measure the neuroplastic changes related to this positive early experience, Golgi-Cox staining of brain tissue is utilized. Owing to the fact that Golgi-Cox impregnation stains a discrete number of neurons rather than all of the cells, staining of the rodent brain with Golgi-Cox solution permits the visualization of entire neuronal elements, including the cell body, dendrites, axons, and dendritic spines. The staining procedure is carried out over several days and requires that the researcher pay close attention to detail. However, once staining is completed, the entire brain has been impregnated and can be preserved indefinitely for ongoing analysis. Therefore, Golgi-Cox staining is a valuable resource for studying experience-dependent plasticity.

This paper describes the procedures for tactile stimulation of rat pups and subsequent Golgi-Cox staining of neuronal morphology. Tactile stimulation is a positive experience that is administered in the perinatal period by stroking pups with a household duster. Golgi-cox staining is a reliable procedure permitting the visualization of entire neurons.

Visualizzare gli effetti di una prima esperienza positiva, tattile stimolazione, su dendritiche Morfologia e Synaptic connettività con Golgi-Cox colorazione

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up per l&#39;indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the diagnosis still relies only on clinical signs of motor involvement that appear later on in the disease course, when most of the dopaminergic neurons are already lost. Hence, there is a strong need for a biomarker that can identify patients at the beginning of disease or at the risk of developing it. Over the last few years, skin biopsy has proved to be an excellent research and diagnostic tool for peripheral nerve diseases such as small fiber neuropathy. Interestingly, a small fiber neuropathy and alpha synuclein (&#945;Syn) neural deposits have been shown by skin biopsy in PD patients. Indeed, skin biopsy has the great advantage of being an easily accessible, minimally invasive and painless procedure that allows the analysis of peripheral nervous tissue prone to the pathology. Moreover, the possibility of repeating the skin biopsy in the course of the follow-up of the same patient allows studying the longitudinal correlation with the disease progression. We set up a standardized reliable protocol to investigate the presence of &#945;Syn aggregates in skin nerve fibers of the PD patient. This protocol involves few short fixation steps, a cryotome sectioning and then a free-floating immunofluorescence double-staining with two specific antibodies: anti Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) to mark the cutaneous nerve fibers and anti 5G4 for detecting &#945;Syn aggregates. It is a versatile, sensitive and easy to perform protocol that can also be applied for targeting other proteins of interest in skin nerves. The ability to mark &#945;Syn aggregates is another step forward to the use of skin biopsy as a tool for establishing a pre-mortem histopathological diagnosis of PD.

Here, we present a protocol for a free-floating indirect immunofluorescence assay on skin biopsy sections that allows for the identification of disease specific conformation variants of alpha synuclein involved in Parkinson disease and multiple proteins of the peripheral nervous system.

Targeting Alpha Synuclein Aggregati in cutaneous periferici nervose fibre nervose da Pro(Enunciante autofluorescenza libera)

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Analisi kinematica 3D per la valutazione funzionale nel modello di ratto di lesioni da schiacciamento del nervo sciatico

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. Several recent studies have demonstrated the effectiveness of chronic VNS in enhancing central nervous system plasticity to improve motor rehabilitation, extinction learning, and sensory discrimination. Construction of chronically implantable devices for use in such studies is challenging due to rats&#8217; small size, and typical protocols require extensive training of personnel and time-consuming microfabrication methods. Alternatively, commercially available implantable cuff electrodes can be purchased at a significantly higher cost. In this protocol, we present a simple, low-cost method for construction of small, chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in rats. We validate the short and long-term reliability of our cuff electrodes by demonstrating that VNS in ketamine/xylazine anesthetized rats produces decreases in breathing rate consistent with activation of the Hering-Breuer reflex, both at the time of implantation and up to 10 weeks after device implantation. We further demonstrate the suitability of the cuff electrodes for use in chronic stimulation studies by pairing VNS with skilled lever press performance to induce motor cortical map plasticity.

Existing approaches for constructing chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in small rodents often require specialized equipment and/or highly trained personnel. In this protocol we demonstrate a simple, low-cost approach for fabricating chronically implantable cuff electrodes, and demonstrate their effectiveness for vagus nerve stimulation (VNS) in rats.

Preparazione degli elettrodi di stimolazione nervosa periferica per l'impianto cronico nei ratti

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and a lot of comparative data has been published in the literature. This includes a multitude of assessment methods to study functional recovery following nerve injury and repair. Besides evaluation of nerve regeneration by means of histology, electrophysiology, and other in vivo and in vitro assessment techniques, functional recovery is the most important criterion to determine the degree of neural regeneration. Automated gait analysis allows recording of a vast quantity of gait-related parameters such as Paw Print Area and Paw Swing Speed as well as measures of inter-limb coordination. Additionally, the method provides digital data of the rats&#8217; paws after neuronal damage and during nerve regeneration, adding to our understanding of how peripheral and central nervous injuries affect their locomotor behavior. Besides the predominantly used sciatic nerve injury model, other models of peripheral nerve injury such as the femoral nerve can be studied by means of this method. In addition to injuries of the peripheral nervous systems, lesions of the central nervous system, e.g., spinal cord contusion can be evaluated. Valid and reproducible data assessment is strongly dependent on meticulous adjustment of the hard- and software settings prior to data acquisition. Additionally, proper training of the experimental animals is of crucial importance. This work aims to illustrate the use of computerized automated gait analysis to assess functional recovery in different animal models of peripheral nerve injury as well as spinal cord contusion injury. It also emphasizes the method&#8217;s limitations, e.g., evaluation of nerve regeneration in rats with sciatic nerve neurotmesis due to limited functional recovery. Therefore, this protocol is thought to help researchers interested in peripheral and central nervous injuries to assess functional recovery in rodent models.

Automated gait analysis is a feasible tool to evaluate functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury and spinal cord contusion injury. While it requires only one setup to assess locomotor function in various experimental models, meticulous hard- and soft-ware adjustment and training of the animals is highly important.

Analisi automatizzata dell'andatura per valutare il recupero funzionale nei roditori con lesione da contusione del nervo periferico o del midollo spinale

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...