Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con gli istituti nazionali di salute animale uso orientamenti. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle concessioni dal National Institutes of Health (R01NS093073 e R21AA024873) a C. Gu.

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La procedura di questo test di microbiomechanical è dritto in avanti. Esso produrrà risultati affidabili, se tutti i suoi passaggi sono eseguiti con attenzione. Ci sono diversi passaggi chiave che, se correttamente eseguita, ostacolerà la raccolta dei dati di successo. I passaggi critici cominciano a monte dell'effettiva applicazione dello stimolo puffing. La dissezione attenta, coltura e cura della cultura primaria del neurone sono di primaria importanza. Se i neuroni coltivati non sono sani, non reagiranno in modo coerente, poiché essi potrebbero già state innescate per lo stress. A valle della cultura, la configurazione iniziale e la taratura dell'apparato puffing per fornire una pressione costante, che indurrà varicosities ma non causerà il distacco delle cellule dalla superficie del vetrino coprioggetto, deve essere eseguita con pazienza. Una calibrazione accurata dell'assetto potrebbe richiedere 1 h a causa di problemi di valvola, tubi o pipetta intasamento. È fondamentale per assicurare che il fluido scorre fuori della pipetta con una resistenza minima prima di andare avanti con posizionando le cellule nel piatto e posizionare la punta della pipetta. Per quanto riguardano le modifiche all'assetto, uno può abbinare apparato puffing con aspersione, patch di bloccaggio e qualsiasi altro basati su microscopio strumento, per lo più dipenda sullo spazio fisico libero sui lati del microscopio.
Questo sistema ha due limitazioni intrinseche che richiedono attenzione. Il set-up può costantemente iniziano la formazione di varicosità reversibile in assoni dei neuroni hippocampal coltivati attraverso puffing fluido alle cellule. Tuttavia, è importante notare che i valori di pressione esatta sui neuroni all'interno dello stesso campo puffing non sono identici. La pressione del fluido che urta le cellule, calcolata in base alla misura del carico di pressione da un microfabbricati membrana in silicone4,10, rappresenta la pressione media al centro del campo puffing. Così, l'esatta pressione puffing è il più alto nel centro del campo del puffing e il più basso intorno al bordo del campo. Abbiamo dimostrato che le componenti di forza di pressione con l'insorgenza, la dimensione e il numero di varicosità indotto4. Pressione superiore ha provocato un inizio più veloce, più grande e più abbondante varicosities4. Nei nostri studi recenti, abbiamo usato una pressione minima (190 mmHg sulla punta della pipetta puffing) che possa indurre ancora attendibilmente varicosities nella maggior parte dei assoni4. In questa circostanza, insorgenza di varici per giovani neuroni è normalmente circa 5 s. È importante notare che con l'esatto stesso sbuffando sistema, il valore del tempo di insorgenza può variare, che non solo dipende dal tipo di un neurone, età e compartimento subcellulare, ma può anche essere influenzata dalla posizione del neurone nel campo puffing. Nonostante la variazione di pressione puffing ricevuto dai neuroni, questo sistema di dosaggio ancora fornisce un mezzo affidabile per lo studio di effetti meccanici su neuroni centrali e produce risultati sperimentali altamente coerenti e riproducibili.
La seconda limitazione del sistema è il suo problema di intasamento. Per ottenere la pressione fisiologicamente rilevanti, l'apertura delle pipette è piccolo, circa 45 μm. Tuttavia, la piccola apertura tende ad impastarsi con detriti dalla tubazione di plastica e i detriti nella punta della pipetta possono essere visto chiaramente al microscopio. Questo aumenta la quantità di tempo durante la preparazione il set-up, in caso di uno zoccolo di pipetta. Di conseguenza, tutte le soluzioni sono accuratamente filtrate prima di essere messo nella siringa, tubi e pipetta. Inoltre è importante lavare il sistema puffing con etanolo al 70% all'inizio e alla fine della giornata, seguita da lavaggio con buffer di Hank filtrata. Per risolvere il potenziale problema di intasamento, ti suggeriamo di provare a tirare più pipette. È essenziale per confermare che la soluzione è in realtà soffiata fuori la pipetta attraverso la visualizzazione prima di iniziare gli esperimenti. Una volta stabilito un buon sistema puffing, solitamente può durare per il resto della giornata.
Questa analisi biomeccanica, combinata con la cultura del neurone, presenta un'opportunità unica per lo studio del neurone centrale mechanosensation che imita le condizioni fisiologiche e/o patofisiologiche. Questo sistema permette di esaminare gli effetti di compressione e taglio sui neuroni. Al contrario, altri sistemi sono stati usati per esaminare in piano stretching5,6,7. La pressione media ricevuta dai neuroni nel centro delle zone puffing è 0.25 ± 0,06 nN/µm2 nel nostro sistema4. Questa pressione esercitata sulle cellule è paragonabile al modulo elastico dei neuroni ippocampali come misurato in precedenza utilizzando reologia microscopia e massa scansione di forza, per identificare otticamente indotto deformazione13,14, così come pressioni permette alterare la crescita di neuriti bordi iniziali in vitro, misurata mediante la scansione forza microscopia (0.27 ± 0,04 nN/µm2)16. Questa pressione non superi la pressione che possa essere generata naturalmente dalle cellule mesenchymal in un embrione E11, misurata utilizzando olio di dimensioni delle cellule fluorescenti meccanicamente specifico microgocce (1,6 ± 0,8 nN/µm)2,14.
Questo sistema è già stato utilizzato con successo in combinazione con calcio imaging, patch di bloccaggio, microscopio elettronico e analisi cellulare di un cranio chiuso mTBI mouse modello4. Il dosaggio anche utilizzabile in combinazione con esperimenti basati su microscopio, come recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP), per esaminare la proteina turn over all'interno di varicosità, come pure di FRET per studiare se sono alterate interazioni proteina-proteina durante la formazione di varici. In sostanza, qualsiasi metodo che può essere fatto utilizzando un microscopio e una cellula viva, set-up di imaging può essere accoppiato con questo dosaggio puffing. La versatilità di questo test è molto preziosa a studiare i meccanismi molecolari sottostanti vari effetti sulla morfologia neuronale e funzioni dallo sforzo di micromeccanica.

Formazione del varicosity, o gonfiore/bordatura, lungo gli assoni, è una caratteristica prominente di neurodegenerazione osservata in molti disturbi o lesioni del sistema nervoso centrale, tra cui la sclerosi multipla, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson e traumatica brain injury1,2. Nonostante gli impatti fisiologici significativi dei varicosities axonal sulla propagazione del potenziale d'azione e trasmissione sinaptica3, come vengono generati i varicosities rimane sconosciuto. Recentemente, usando un'analisi di nuova costituzione microbiomechanical su colture di neuroni ippocampali da roditori, abbiamo trovato che stimoli meccanici possono indurre varicosità in questi neuroni con altamente interessanti caratteristiche. In primo luogo, l'induzione del varicosity è rapida (< 10 s) e questo processo è reversibile in modo imprevisto. In secondo luogo, l'inizio del varicosity dipende dalla forza sbuffando pressione: maggiore è la pressione, più veloce all'avvio. In terzo luogo, l'inizio del varicosity dipende dall'età neuronale. Gli assoni dei neuroni più giovani appaiono più reattivi alle sollecitazioni meccaniche, rispetto a quelle dei neuroni più anziani. In quarto luogo, il modulo di varicosità lungo gli assoni dei neuroni ippocampali, mentre i segmenti di assone iniziale di questi neuroni e dendriti non visualizzare nessun cambiamento nella stessa circostanza puffing. Così, il nostro studio ha rivelato una caratteristica novella di polarità di un neurone. Questi risultati con il sistema in vitro sono fisiologicamente rilevanti. Utilizzando un modello in vivo per trauma cranico lieve (mTBI), abbiamo mostrato che varicosities axonal sviluppato in modo multi-focale nella corteccia somatosensoriale dei topi immediatamente dopo l'impatto di Chiudi-cranio, coerenza con il nostro in vitro Risultati4. È importante notare che la nostra colorazione e imaging dei topi mTBI forniscono solo un'istantanea di un neurone cambiamenti morfologici, da eseguire in vivo imaging time-lapse della morfologia neuronale durante un impatto meccanico è ancora non è fattibile.
Questo sistema fluido-sbuffando ci ha permesso non solo di catturare caratteristiche uniche associate alla formazione di varici indotta da stress meccanico, ma anche per determinare il meccanismo di fondo. Provando diverse soluzioni extracellulare, bloccanti e apribottiglie di diversi candidati di canali ionici mechanosensitive ed elettrofisiologia cellulare, abbiamo identificato che il catione potenziale transitorio del ricevitore canale membro subfamily V 4 (TRPV4) canale che è permeabile per Ca2 + e Na+ e attivato da sbuffando è principalmente responsabile per la rilevazione iniziale stress meccanico durante la formazione di varici axonal4. Questo è stato ulteriormente confermato con un approccio di knockout di siRNA. Presi insieme, questo nuovo sistema di dosaggio che abbiamo sviluppato con la cultura di Neurone ippocampale, è altamente utile per studiare le proprietà di micromeccanica dei neuroni centrali, specialmente in combinazione con altre tecniche.
Questo sistema di micromeccanica che abbiamo stabilito è unico e si differenzia dai sistemi già esistenti in diversi aspetti importanti. In primo luogo, in questo sistema, i neuroni esperienza fuori del piano sollecitazioni meccaniche nelle forme di compressione e taglio. Durante l'impatto meccanico, processi neuronali rimangono attaccati alla superficie del vetrino coprioggetto e non si muovono. Questo è diverso da altri sistemi che si occupa principalmente di flessione e stretching in piano sperimentale (o tensione), per esempio, la deflessione degli assoni in bundle come stringhe5,6 in movimento o stretching assoni coltivati su bioerodibili canali e membrane estensibile7,8. Inoltre, sebbene varicosities axonal possono anche essere indotti questi saggi come nel nostro sistema fluido-sbuffando, il processo in queste impostazioni richiede molto più tempo (da 10 minuti a parecchie ore6,7,8) e viene visualizzato irreversibile. Infine, il nostro sistema utilizzando sbuffando fluido locale consente l'esame delle caratteristiche spaziali della formazione del varicosity (ad es., dendriti, spine dendritiche, soma, axonal segmenti iniziali e terminali axonal), oltre alle sue caratteristiche temporali. Utilizzando questo sistema, abbiamo scoperto diverse caratteristiche inaspettate e unici di formazione del varicosity assonale, particolarmente rapida insorgenza, lenta reversibilità e polarità di assone-dendrite.
Il sistema che discutiamo in questa carta è compatibile con molte tecniche di molecolare e biologia cellulare. Per esempio, per studiare gli effetti dello stress meccanico sulla morfologia neuronale e funzione, può essere utilizzato insieme a coculture di mielina, time-lapse di imaging di fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) e di trasferimento di energia di risonanza fluorescente (FRET) formazione immagine del calcio e registrazione di patch clamp. In questa carta, ci concentriamo sui componenti di base del sistema. Cultura di neuroni ippocampali, il fluido-sbuffando installazione, imaging ad alta risoluzione time-lapse per trasporto assonale e calcio imaging sono illustrate passo passo qui di seguito.

<table><tbody><tr><td>12 mm coverslips&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>64-0702</td><td>for 24-well plate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>25 mm coverslips&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-545-102&amp;nbsp;</td><td>for 6-well plate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Rat tail collagen&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>11 179 179 001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS&amp;nbsp;</td><td>National Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>P304-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Protease enzyme&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P4032</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x (P/S)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Earle&#039;s Salts&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Arabinosylcytosine (Ara-C)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>147-94-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM media&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>1854313</td><td>transfection reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate rods&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>PG52151-4</td><td>for puffing pipette&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>rubber tubing&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>10cc plastic syringe and plunger</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish (35 mm x 10 mm)</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Molecular Probes</td><td>F14201</td><td>for calcium imaging&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mito-YFP construct&amp;nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>for cell transfection&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>YFP-N1 construct&amp;nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>for cell transfection&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U Mcroscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor ELWD 20x lens&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>062933</td><td>objective&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Apo TIRF 100x/1.49 oil lens&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>objective&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a microbiomechanical system for studying varicosity formation and recovery in central neuron axons

Varicosities axonal sono allargate strutture lungo i fasci di assoni con un elevato grado di eterogeneità. Sono presenti non solo nei cervelli con malattie neurodegenerative o lesioni, ma anche nel cervello normale. Qui, descriviamo un sistema di nuova costituzione micromeccanici per in modo rapido, affidabile ed reversibilmente indurre varicosities axonal, permettendoci di comprendere i meccanismi che regolano la formazione del varicosity e la proteina eterogenea composizione. Questo sistema rappresenta un mezzo romanzo per valutare gli effetti dello sforzo di compressione e taglio su diversi compartimenti cellulari dei neuroni, diversi da altri sistemi in vitro che si concentrano principalmente sull'effetto di stretching. Cosa importante, a causa delle caratteristiche uniche del nostro sistema, abbiamo recentemente effettuato una scoperta di nuovi risultati che l'applicazione del fluido pressurizzato può indurre rapidamente e reversibilmente varicosities axonal attraverso l'attivazione di un canale potenziale transitorio del ricevitore. Il nostro sistema biomeccanico può essere utilizzato comodamente in combinazione con aspersione di droga, live cell imaging, imaging del calcio e registrazione di patch clamp. Pertanto, questo metodo può essere adottato per lo studio di canali ionici meccanosensibili, regolamento di trasporto assonale, dinamica del citoscheletro assonale, segnalazione calcio e cambiamenti morfologici correlati a traumatico cranico.

Prima sbuffando, assoni normalmente mostrano poca formazione di varici. Seguente sbuffando con la nostra pressione standard (190 mmH2O altezza), l'inizio di assoni di sviluppare molti tallone-come varicosità. La formazione di varicosità è parzialmente reversibile, come mostrato dalle regioni dell'assone tornando al loro stato pre-soffiato in seguito a un periodo di recupero di 10 min (Figura 2A-B). Dopo un periodo di recupero più lungo (> 20 min), alcuni assoni recupero completamente. Posizionamento non ottimale la pipetta puffing nonché accurato posizionamento della siringa a 190 mm sopra il palco non può rapidamente generare varicosità. Condizioni ottimali dovrebbero provocare la formazione di varici negli assoni dei neuroni giovane (circa 7 DIV) in circa 5 s4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57202/57202fig1.jpg"> Figura 1 : Disegno schematico e fotografia di sbuffando apparato. (A) fotografie che mostrano di set-up generale di microscopio. (B) sbuffando apparecchio per mostrare la pipetta di vetro tenuto dal micromanipolatore e collegato alla tubazione di gomma. Contrasto di fase (C) immagini con messa a fuoco nel piano dei neuroni hippocampal primari risultati ombra della pipetta nella parte inferiore destra. (D) fuori della cella aereo focalizzata su sbuffando punta della pipetta. (E) schema delle distanze e delle pressioni calcolate per l'induzione di varicosità. Barra della scala = 50 µm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57202/57202fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57202/57202fig2.jpg"> Figura 2 : Immagini rappresentative di formazione di varici segue sbuffando. (A) formazione immagine di 7DIV, neuroni ippocampali di mouse transfettate GFP mostrando un assone pre- e post-sbuffando oltre a seguire un periodo di recupero di 10 min. (B) Kymograph dell'imaging time-lapse del neurone in (A). Le frecce rosse indicano varicosità che si sono formate a seguito di 150 s di 190 mmH2O sbuffando (inizio alle 30 s). Barra della scala = 15 µm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57202/57202fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Soluzione di rivestimento vetrino coprioggetti</td>
		</tr>
<tr>
<td>Μ L 780</td>
			<td>Acid17 acetico mM calcio: 50 µ l di acido acetico in 50 mL di H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>200 Μ l</td>
			<td>Poli-D-lisina (0,5 mg/mL di brodo)</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 Μ l</td>
			<td>Collagene di coda di ratto (3 mg/mL di brodo)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Il volume totale viene determinato in base al numero di vetrini coprioggetto da rivestire.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: soluzione di rivestimento vetrino coprioggetti. Fornisce la ricetta per preparare la soluzione di rivestimento vetrino coprioggetti usata per aderire le cellule coltivate a lamelle.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">1 x fetta dissezione soluzione (SLD), filtrato, pH = 7,4, conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 L</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>82 mM</td>
			<td>Na2così4
</td>
		</tr>
<tr>
<td>30 mM</td>
			<td>K2così4
</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM</td>
			<td>HEPES (acido libero)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM</td>
			<td>D-glucosio</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM</td>
			<td>MgCl2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.00%</td>
			<td>Rosso fenolo (opzionale)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Placcatura Media (PM, filtrare, conservare a 4 ° C)</td>
		</tr>
<tr>
<td>439 mL</td>
			<td>Sali di MEM Earle</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mL</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
<tr>
<td>11,25 mL</td>
			<td>20% D-glucosio</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mL</td>
			<td>Piruvato di sodio (100 mM),</td>
		</tr>
<tr>
<td>62,5 Μ l</td>
			<td>L-Glutammina (200 mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mL</td>
			<td>Penicillina/streptomicina (P/S, x 100)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mezzi di manutenzione (MM, filtrare, conservare a 4 ° C)</td>
		</tr>
<tr>
<td>484 mL</td>
			<td>Neurobasal</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mL</td>
			<td>Supplemento 50 x B27</td>
		</tr>
<tr>
<td>1,25 mL</td>
			<td>L-Glutammina (200 mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mL</td>
			<td>100 x P/S</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tutte le soluzioni sono sterilizzate con un filtro con pori di 0,2 mm.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Cell ricette di cultura media. Fornisce le ricette per preparare i supporti utilizzati alla coltura delle cellule primarie del neurone hippocampal.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Buffer di Hank (filtro, pH = 7,4, conservare a 4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>150 mM</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 mM</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2 mM</td>
			<td>MgCl2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mM</td>
			<td>CaCl2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mg/mL</td>
			<td>D-glucosio</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mM</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: ricetta di buffer di Hank. Fornisce la ricetta per preparare il buffer utilizzato nel protocollo puffing e durante la formazione immagine di cellule vive.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="6">Pipettare tirando i parametri</td>
		</tr>
<tr>
<td>Calore</td>
			<td>Tirare</td>
			<td>Velocità</td>
			<td>Ritardo</td>
			<td>Pressione</td>
			<td>Rampa</td>
		</tr>
<tr>
<td>501</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>1</td>
			<td>500</td>
			<td>530</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4: Pipettare tirando parametri. Fornisce i parametri da impostare sulla levetta della pipetta per ottenere un'apertura che è circa 45 µm di diametro.

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A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Questo protocollo descrive un approccio fluido pressurizzato, fisiologicamente rilevante per induzione rapida e reversibile di varicosità in neuroni.

Un sistema di Microbiomechanical per lo studio della formazione del Varicosity e del recupero in centrale del neurone assoni

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

a-microbiomechanical-system-for-studying-varicosity-formation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.2K Views.  The Ohio State University. Questo protocollo descrive un approccio fluido pressurizzato, fisiologicamente rilevante per induzione rapida e reversibile di varicosità in neuroni.

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Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the 10-1000 &mu;dyne range1,2. Force measurements are obtained through observation of the Hookean bending of the glass needles, which are calibrated by a direct and empirical method3. Equipment requirements and procedures for fabricating, calibrating, treating, and using the needles on cells are fully described. The force regimes previously used and different cell types to which these techniques have been applied demonstrate the flexibility of the methodology and are given as examples for future investigation4-6. The technical advantages are the continuous 'visualization' of the forces produced by the manipulations and the ability to directly intervene in a variety of cellular events. These include direct stimulation and regulation of axonal growth and retraction7; as well as detachment and mechanical measurements on any type of cultured cell8.

Application and direct measurements of forces on neurons in the 2-1000 microdyne range are achieved with high precision using calibrated glass needles. This methodology can be used to control and measure several aspects of axonal development, including axonal initiation, axonal tension, velocity of axonal elongation, and force vectors.

Manipolazione meccanica di neuroni di controllo per lo sviluppo assonale

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Ricerca

Neuroscienze

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser nanochirurgia di cerebellari Assoni<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Imaging intravitale di assonale Interazioni con Microglia e macrofagi in un mouse Dorsale colonna Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Circuiti neuronali riavvolgenti: un nuovo metodo per l&#39;estensione veloce del neurite e la connessione neuronale funzionale

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

Una semplice metodologia di lesioni meccaniche neuronali da studiare<em&gt; Drosophila</em&gt; Degenerazione dei motori neuronali

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Un modello di ferita Drosophila In Vivo per lo studio della neurorigenerazione la periferica e del sistema nervoso centrale

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Medicina

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

Espansione del toolkit per l'imaging in vivo del trasporto assonale

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Inducing Axonal Varicosities with a Micromechanical Stimulus on Neurons

Source: Servello, D., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/57202">A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the induction of axonal varicosities by applying micromechanical stimulus on neurons. The system comprises a micropipette attached to a syringe containing buffer via tubing. Using a micromanipulator, the micropipette is positioned above the neurons. Fluid pressure is then applied to induce varicosities in axons.

Un sistema di Microbiomechanical per lo studio della formazione del Varicosity e del recupero in centrale del neurone assoni

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Manipolazione meccanica di neuroni di controllo per lo sviluppo assonale

Laser nanochirurgia di cerebellari Assoni

Un

Imaging intravitale di assonale Interazioni con Microglia e macrofagi in un mouse Dorsale colonna Crush Injury

Circuiti neuronali riavvolgenti: un nuovo metodo per l'estensione veloce del neurite e la connessione neuronale funzionale

Una semplice metodologia di lesioni meccaniche neuronali da studiare

Un modello di ferita Drosophila In Vivo per lo studio della neurorigenerazione la periferica e del sistema nervoso centrale

In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

Espansione del toolkit per l'imaging in vivo del trasporto assonale

Induzione di varici assonali con uno stimolo micromeccanico sui neuroni