Questo lavoro è stato supportato dal Christopher e Dana Reeve Foundation International Research Consortium sulla ferita del midollo spinale, il Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, la Fondazione di JPB, la Novartis Istituto di ricerca di base, generosi contributi da Vincent e Stella Coates e il Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).

Tutte le procedure che coinvolgono roditori conformano alle linee guida della Stanford University, conformi alle politiche e nazionali e le leggi dello stato. Tutte le procedure di animali sono state approvate dal pannello di amministrazione dell'Università di Stanford sulla cura degli animali di laboratorio.
Nota: Tutte le composizioni di soluzione e buffer sono fornite nella Tabella materiali.
1. preparare una piastra di Petri per CD11b Immunopanning (giorno 0)
Nota: Preparare 1 immunopanning piatto per ogni cervello di ratto giovanile di 1-2.
<ol><li>Aggiungere 25 mL di 50 mM Tris soluzione pH 9.5 a una capsula di Petri 15 cm.</li>
	<li>Aggiungere anti-topo di capra IgG (catene di H + L) al piatto per una concentrazione finale di 6 µ g/mL. Turbinio piastra per distribuire uniformemente.</li>
	<li>Incubare il piatto per 1-3 h a 37 ° C.</li>
	<li>Piatti di lavare tre volte con DPBS ++ (tampone fosfato salino (PBS) con Ca2 + e Mg2 +), quindi sostituire con una soluzione di panning tampone contenente 1 µ g/mL OX42 anticorpo. Lasciare i piatti durante la notte a temperatura ambiente su una superficie piana.</li>
</ol>2. tessuto collezione (giorno 1)
Nota: Questo protocollo dovrebbe prendere circa 3-4 h.
<ol><li>Prima di iniziare, verificare che tutte le soluzioni sono sterili e refrigerati sul ghiaccio. Tutti gli strumenti sul ghiaccio di chill e sterilizzare con etanolo prima dell'uso.</li>
	<li>Seguenti procedure regolamentari appropriate, sacrificare un topo di laboratorio giovanile da asfissia di anidride carbonica. Nota: In alternativa, gli animali più giovani possono essere sacrificati con una dose letale di chetamina/xilazina (100-200 µ l di 24 mg/mL di ketamina, xilazina 2,4 mg/mL). Chetamina/xilazina deve essere utilizzato se gli animali sono meno di 14 giorni di età. Se si utilizza più animali, estrarre il tessuto da un animale e inserirlo pre-refrigerati DPBS ++ sul ghiaccio prima di procedere alla successivi animali.</li>
	<li>Pizzicare un hindpaw e garantire l'apatia completa dall'animale prima di procedere.</li>
	<li>Via irrorare l'animale con 10-30 mL di buffer di aspersione ghiacciata utilizzando un ago 27½-G fino a quando il buffer viene eseguito chiaro. Nota: Il Volume di tampone di aspersione variano a seconda la dimensione/età dell'animale.</li>
	<li>Subito dopo aspersione rimuovere la testa dell'animale. Provenienti dal midollo spinale tagliato il condilo occipitale su ogni lato con le forbici di dissezione, fare attenzione a non danneggiare il cervello. Dopo aver tagliato attentamente ogni lato, tagliare un lato lungo parietali e osso frontale verso l'osso nasale. Con il forcipe attentamente tirare indietro la parte superiore del cranio, rimuovere rapidamente il cervello (o strutture CNS di interesse) e mettere in pre-refrigerati DPBS ++ sul ghiaccio.</li>
	<li>Ripetere per tutti gli animali restanti. Nota: Tutte le fasi del procedimento dovrebbero essere eseguite in una cappa a flusso laminare in adeguate condizioni di sterilità.</li>
</ol>3. meccanica dissociazione (giorno 1)
<ol><li>Dopo tutti i cervelli sono stati raccolti, tritare un cervello tocchetti3 a 1 mm in una capsula Petri sul ghiaccio con un bisturi freddo e trasferire a un omogeneizzatore lisata ghiacciata con 5-7 mL di tampone douncing ghiacciata. Dissociare un cervello alla volta.</li>
	<li>Dissociare il tessuto usando tratti di dolce e incomplete di 10-20 con un omogeneizzatore lisata larghi. Fare attenzione a non schiacciare direttamente il tessuto nella parte inferiore dell'omogeneizzatore, ma invece spingono il tessuto attraverso lo spazio tra i lati del pistone e l'omogeneizzatore.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente il pistone per evitare l'introduzione di bolle d'aria. Consenti blocchi di tessuto scarsamente dissociato a stabilirsi a fondo l'omogeneizzatore e trasferire il surnatante in una nuova provetta conica da refrigerata 50 mL.</li>
	<li>Sostituire il volume rimosso con buffer di douncing fresco e ripetere i passaggi 3.2 e 3.3 per un totale di 3-4 giri, o fino a quando tutto il tessuto è stato dissociato. Ripetere la procedura per ogni cervello.</li>
</ol>4. mielina rimozione (giorno 1)
Nota: Rimozione di mielina è utilizzato per l'isolamento di microglia da animali più vecchi di P12.
<ol><li>Misurare il volume della sospensione cellulare in tubo conico da 50 mL utilizzando una pipetta 25 mL, quindi aggiungere tampone douncing ghiacciata per regolare il volume totale di 33,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di tampone di separazione della mielina (MSB) sospensione cellulare e mescolare accuratamente capovolgendo la provetta diverse volte. Questo si tradurrà in una concentrazione finale di 23% di MSB in un volume di 43,5 mL.</li>
	<li>Centrifugare le cellule per 15 min a 500 x g a 4 ° C con frenata lenta. Nota: La centrifuga dovrebbe prendere circa 1.5-2 min per decelerare. Questo genererà uno strato superiore di mielina e detriti cellulari morti, un surnatante un po' torbida e una più piccola a pellet che si arricchisce di cellule vive.</li>
	<li>Rimuovere lo strato superiore di residui del myelin e il surnatante con una pipetta. Fare attenzione quando si rimuove lo strato superiore per garantire come gran parte di essa viene rimosso come possibile.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 12 mL di tampone di panning. Delicatamente e triturare la sospensione cellulare per rompere eventuali grumi di cellule che potrebbero rimanere.</li>
</ol>5. Immunopanning (giorno 1)
<ol><li>Passare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella 70 µm per rimuovere detriti di grandi dimensioni o grumi di cellule.</li>
	<li>Risciacquare il piatto panning rivestite con OX42 tre volte con DPBS ++. Non fate la piastra completamente asciutto tra i lavaggi.</li>
	<li>Versare fuori l'ultimo lavaggio DPBS ++ e applicare la sospensione cellulare filtrata al piatto panning. Delicatamente la piastra per distribuire le cellule di turbinio, quindi incubare la piastra su una superficie piana a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire alle cellule di aderire. Incubare per non più di 20 min o cellule diventerà molto difficile recuperare dal piatto.</li>
	<li>Risciacquare il piatto panning con DPBS ++ 10 volte per rimuovere le cellule non-aderenti. Microglia sarà così saldamente fissato alla piastra, agitare la piastra con ogni risciacquo per garantire la rimozione di altre cellule non aderenti.</li>
	<li>Versare fuori l'ultimo lavaggio DPBS ++ e sostituire con 15 mL DPBS ++ e 200 μL tripsina (1,25% soluzione di riserva).</li>
	<li>Incubare il piatto per ≤ 10 min a 37 ° C con 10% CO2 per tripsinizzano. Nota: Non continuare più di 10 min o microglia diventerà difficile da rimuovere.</li>
	<li>Dopo 10 min di trypsinization, microglia sarà ancora bloccata alla piastra. Versare fuori tripsina/DPBS ++ e lavare delicatamente 2x con DPBS ++ per rimuovere la tripsina, sostituire con 12 mL di terreno di coltura di microglia ghiacciata (MGM).</li>
	<li>Posto panning piatto sul ghiaccio per 2 min per indebolire l'interazione cellula/substrato e assicurarsi che il piatto è piatto per evitare zone del panning piatto dall'asciugarsi.</li>
	<li>Pipettare vigorosamente con un controller di pipetta e dispensare 10 mL ad alta velocità per recuperare le cellule dal piatto panning. Disegnare una 16x16 griglia con il flusso di liquido dalla pipetta per cercare di rimuovere tutte le cellule.</li>
	<li>Controllare le cellule al microscopio a 20 ingrandimenti per assicurarsi che le cellule siano staccate dalla piastra. Mark macchie sulla parte superiore del piatto dove le cellule sono ancora bloccate e ripetere il pipettaggio in quelle zone.</li>
	<li>Raccogliere la sospensione cellulare e aliquota 3-4 mL di surnatante per provetta conica da 15 mL. Spin per 15 min a 500 x g a 4 ° C con frenata lenta. Nota: Microglia attraverso un piccolo volume di filatura consente il massimo recupero delle cellule.</li>
	<li>Aspirare il supernatante, lasciando 0,5 mL di MGM con il pellet cellulare.</li>
	<li>Ogni risospendere in MGM rimanenti e le cellule da tutti i tubi della piscina.</li>
	<li>Contare le celle con un emocitometro.</li>
	<li>Cellule di piastra come descritto nei passaggi 6 - 7 a seconda dell'applicazione.</li>
	<li>Cellule di coltura a 37 ° C con 10% CO2. Nota: Le cellule possono essere cultura per fino a 3-4 settimane con le modifiche di supporto regolare o una settimana senza modifiche di media.</li>
</ol>6. posto rivestimento piastre/lamelle di coltura tissutale (giorno 1)
<ol><li>Piastra 15 µ l di rivestimento di collagene IV direttamente nel centro di una piastra di coltura del tessuto rivestito 24 pozzetti anionici/cationici (per dettagli, vedere Tabella materiali ) e incubare per 15 min a 37 ° C con 10% CO2.</li>
	<li>Dopo il conteggio di cellule con un emocitometro diluire le cellule a 2.3 x 105/ml in MGM. Aspirare il collagene IV spot e immediatamente piastra 15 µ l di sospensione cellulare fino a questo punto; Questo vi darà 3,5 x 10 cellule/spot3 . Incubare per 5-10 min a 37 ° C con 10% CO2 per consentire alle cellule di aderire, aggiungere 500 µ l di CO2 -equilibrata contenente il mezzo di crescita TGF-β2/IL-34/colesterolo (TIC) delicatamente al pozzo.</li>
	<li>Se placcatura sulle lamelle, primo cappotto sterile vetrini coprioggetti con 10 µ g/mL stratagemma-D-lisina (PDL) in H2O per 1h a RT, lavare 3 volte con H2O e lasciare asciugare in una cappa sotto luce UV. Una volta che le lamelle sono asciutte, procedere con spot placcatura su lamelle come descritto al punto 6.2.</li>
</ol>7. placcatura per isolamento di RNA/proteine
<ol><li>Il giorno 1, cappotto l'intera area di un 24 pozzetti anionici/cationici rivestite in lamiera di coltura del tessuto con rivestimento in collagene IV e incubare per 10 min - 1 h a 37 ° C con 10% CO2, quindi rimuovere e immediatamente piastra 3-5 x 104 cellule/pozzetto in CO2 equilibrato Media TIC.</li>
	<li>Il giorno 2, eseguire una variazione media del 50% per ogni bene il giorno dopo la preparazione. Le cellule morte tendono a cluster al centro del pozzo, così prendono i media da lì.</li>
	<li>Eseguire una modifica di media 50% ogni 2-3 giorni per mantenere le culture. Se le modifiche di supporto introducano una variabile di indesiderate per le culture, le cellule possono sopravvivere per circa una settimana, senza alcuna modifica di media, al contrario di oltre 3 settimane con una manutenzione regolare.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Poiché microglia fungono da cellule immunitarie sentinella del SNC, sono altamente sensible a reagire ai cambiamenti ambientali; di conseguenza, molta cura è necessaria per ridurre le risposte infiammatorie all'interno delle cellule durante il loro isolamento e cultura8. Questa operazione viene eseguita in questo protocollo attraverso velocità e temperatura. Ogni qualvolta possibile riduce notevolmente l'attivazione, quindi tutte le fasi di centrifugazione prendere posto a 4 ° C, mantenendo le cellule in ghiaccio o a 4 ° C, gli animali sono perfusi con buffer di aspersione ghiacciata, e il protocollo è stato ottimizzato per ridurre al minimo il tempo fra il tessuto estrazione e coltura delle cellule. Se valutare il pattern di espressione genica delle cellule appena isolato, raccolto lisati cellulari direttamente dal piatto immunopanning CD11b prima del trypsinization per mantenere i cambiamenti indotti da isolamento minimo. Dovrebbe essere notato che anche accuratamente isolato microglia eseguire una risposta infiammatoria immediatamente dopo essere poste nelle temperature calde, presumibilmente a causa di riconoscimento di segnali di danno-collegata intrinsecamente connesso con la procedura di isolamento. Se il protocollo è stato effettuato con successo, 2,5-5 x 10 il ratto5 cellule/giovanile sono attesi.
Il protocollo di isolamento cellulare fornito qui è altamente specifico per l'isolamento di cellule CD11b + dal CNS irrorato9. Nonostante questa popolazione cellulare è composto prevalentemente da microglia, custodisce anche bassi livelli di altre popolazioni mieloide quali i macrofagi perivascolari, macrofagi meningei, plesso coroideo macrofagi, monociti e neutrofili10. Cellule mieloidi coroide-collegato possono eliminarsi essenzialmente dal riconoscimento e rimozione del plesso coroidico prima della dissociazione del tessuto. Meningi possono anche essere rimossa in una certa misura, ma l'eliminazione completa di tutto il tessuto meningeo non è pratico nei tempi mirati per isolamento rapido descritto qui. Di conseguenza, per limitare la variabilità a causa di una rimozione incompleta dei meninges, non rimuoviamo meningi. Per ridurre al minimo il numero di monociti/neutrofili nel materiale isolato di circolazione, è anche importante avere un'aspersione pulita e scartiamo in genere del tessuto che è scarsamente irrorato. Anche con aspersione eccellente, clearance del sangue non è assoluta, come sarà evidente dalla presenza di una piccola quantità di eritrociti in palline delle cellule durante la purificazione. Così, piccoli livelli di monociti e neutrofili sono co-purificati e contribuire con una firma distinta nei profili di trascrittomica delle cellule appena isolato. Tuttavia, fare circolare le cellule moriranno rapidamente in media TIC senza siero e non rappresentano contaminanti persistenti, anche se possono continuare a sopravvivere e proliferare in siero contenente culture.
Un altro punto importante per raggiungere una sana, vitale cultura è prendersi cura durante le fasi di dissociazione meccanica. Mentre douncing uccide molti neuroni, glia e altre cellule di CNS, microglia sopravvivono questa dissociazione relativamente illesa (sebbene microglia possono anche essere uccisi da over-douncing). Se fatto correttamente, questo protocollo si traduce in cella rendimenti comparabili a quelli ottenuti utilizzando proteolitici dissociazione, mentre potenzialmente variabili dal tessuto infiammatorio di confusione sono evitate risposte alle temperature elevate. Eseguendo giri consecutivi incompleti di dissociazione meccanica del tessuto, singole cellule possono essere raccolte dalla sospensione, riducendo al minimo la quantità di stress meccanico sulla cultura generale.
Il protocollo di immunopanning descritto qui è un modo affidabile e riproducibile per isolare la microglia, ma sono disponibili altri metodi comparabili. Abbiamo ottenuto risultati simili con isolamento magnetico magnetico attivato cella ordinamento lo svuotamento della mielina e CD11b selezione. Qui ci siamo concentrati sul metodo immunopanning perché ha fornito le culture di qualità più elevata fino ad oggi, richiede attrezzature meno specializzate e non richiede l'introduzione di anticorpi coniugati di ossido di ferro alle cellule immediatamente prima della coltura. Un altro approccio comunemente usato per l'isolamento di microglia è citometria a flusso, che ha un grande vantaggio rispetto all'attuale approccio in quanto esistono protocolli di purificazione di bona fide microglia da altri contaminanti CD11b + mieloide con superficie anticorpi contro i marcatori di firma come TEMEM1198. Anche se l'ordinamento fluorescenza-attivato delle cellule si traduce in una popolazione delle cellule estremamente puro, inoltre impone ulteriori sollecitazioni alle cellule e può provocare bassa redditività culture o diminuzione della resa. Nel complesso, ci concentriamo sui metodi basati su anticorpi nei preparativi di centrifugazione e shake-off di densità privo di etichetta per ottimizzare la riproducibilità e la purezza della popolazione cellulare.
Mentre questo protocollo è ottimizzato per la cultura della microglia ratto giovanile, può essere utilizzato alla cultura microglia di diverse epoche; cellulare totale rendimenti sono massimi da 1 - 2-settimana-vecchi ratti, dopo il picco dell'espansione microglial è passato e prima di riarrangiamenti strutturali che interferiscono con il recupero delle cellule dal tessuto più anziane. Microglia può anche essere isolata e coltivata dal mouse e tessuto umano, sostituendo l'anticorpo di CD11b con un appropriato anticorpo monoclonale specifico per mouse o epitopi umani. Mentre sia il mouse che il microglia umana sopravvivere in queste condizioni di coltura, mostrano differenze morfologiche rispetto alle cellule del ratto. Cellule di topo mantengono una morfologia ramificata ma meno elaborare processi, mentre le cellule umane hanno una morfologia ameboide quasi uniforme quando isolato e coltivato secondo questa procedura.
Microglia isolata può essere placcata in modi diversi a seconda le analisi necessarie. Per risultati ottimali (come illustrato nel live/dead saggi e morfologici filmati mostrati qui), 3,5 x 103 celle erano «spot» placcato al centro del pozzetto di una piastra di coltura del tessuto rivestito 24 pozzetti anionici/cationici dopo un rivestimento di 10 min di collagene IV come descritto nel protocollo di cui sopra. In alternativa, per gli esperimenti che richiedono un numero elevato di cellule, come isolamento del RNA, 3-5 x 104 celle può essere placcato per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti dopo 10 min a 1 h di rivestimento di collagene IV. Cellule placcato a densità superiori ha mostrata vitalità leggermente inferiore e meno complessa morfologia rispetto alle cellule che erano esatte trattato, possibilmente a causa dell'impatto dei segnali infiammatori secernuta in risposta all'isolamento. Per immunoistochimica o imaging che richiedono di vetrini coprioggetti, le cellule presentano la migliore sopravvivenza e morfologia quando le lamelle sono stati prime rivestito con PDL quindi rivestito in collagene IV come descritto sopra. Per i dosaggi che richiedono un gran numero di condizioni, la vitalità cellulare è inoltre alta in 96 pozzetti o 384 pozzetti piastre rivestite con collagene. In tutte le condizioni, le cellule iniziano rotondo o bipolare, cominciano ad acquisire processi intorno giorno 3-4 e 5-10 giorni ad esporre la morfologia al massimo ramificata illustrata nella Figura 1 e 1 film.
Mentre questo protocollo si traduce in una cultura che esibisce comportamento dinamico sorveglianza e morfologia simile al riposo microglia in vivo, queste cellule non riescono a mantenere completamente la firma di espressione genica specializzati di microglia in vivo. Molti dei cambiamenti persistenti genica osservati in cellule coltivate riflettono alterazioni tipicamente osservate nel CNS9embrionali o infiammata. Come tale, questo protocollo rappresenta un passo avanti nella comprensione delle condizioni microglia richiedono per sopravvivere in cultura e modifiche del siero-evocato, ma ulteriore studio è necessario capire i segnali estrinseci forniti dal sistema nervoso centrale che perfezionare microglial Proprietà e l'espressione genica.

Come i macrofagi del parenchima CNS, microglia interagire con una vasta gamma di circuiti neuronali e gliali reti di segnalazione. Essi svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo e nella omeostasi del cervello attraverso potatura sinaptica, liquidazione delle cellule apoptotiche e transitorie interazioni con processi neuronali1,2. Le microglia sono primi radar-risponditore a lesioni neurologiche, estendendo le proprie procedure lunghe e sottili ai siti di lesione per coordinare le risposte infiammatorie e limitare il sanguinamento3,4. Cambiamenti nella morfologia microglial e funzione sono onnipresenti nelle lesioni di CNS sia acute che croniche, e microglia espositivo alterata morfologia, localizzazione ed espressione dei mediatori infiammatori in una vasta gamma di Stati di malattia1. Gli studi genetici umani indicano che le mutazioni che alterano il rischio per le malattie neurodegenerative sono espressi spesso prevalentemente o esclusivamente da microglia nel SNC intatto, che punta a un ruolo critico di microglia nella patogenesi della malattia o la progressione5 . Dato loro risalto nella ferita e nella malattia, favorire la comprensione della biologia microglial è una priorità per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici.
Molti avanzamenti critici per la comprensione della biologia microglial sono sorti estrapolando meccanismi scoperti negli studi di altre popolazioni del macrofago, inclusi i metodi di coltura, profili di espressione genica e definizioni di funzionali e tecniche / morfologica degli Stati. Anche se generalizzato del macrofago funzioni spesso giocano fuori in modo sorprendente all'interno del paesaggio di CNS, microglia sono essi stessi altamente specializzata, che esibiscono una morfologia ramificata e una firma di espressione genetica unica che li distingue da altri tessuti macrofagi6. Microglia hanno un lignaggio che è distinto dalla maggior parte degli altri macrofagi dei tessuti; Essi colonizzano SNC durante un'ondata di embrionale precoce dell'emopoiesi primitivo e auto-rinnovarsi per tutta la vita, indipendente di contributi da ematopoiesi definitivo7. La firma di espressione genica pienamente matura di microglia adulta non viene raggiunta fino alla seconda settimana postnatale8. Stimoli ambientali dal tessuto circostante ha un ruolo importante nel dettare tessuto-specifica del macrofago caratteristiche6, che nel SNC comprende limitata esposizione ai fattori ematica concesso dalla barriera emato - encefalica9.
Un ostacolo alla piena comprensione microglial contributi al CNS omeostasi e malattia è la difficoltà di ricapitolare le proprietà specializzate di microglia maturo visto nel vivo con le cellule purificate in vitro. Sono stati sviluppati molti metodi per isolare e cultura intatta microglia, ma la maggior parte degli approcci si basano su siero per sostenere la sopravvivenza delle cellule. Abbiamo dimostrato che l'aggiunta di siero, che è un reagente intrinsecamente variabile contenente una vasta gamma di molecole bioattive, è particolarmente problematico quando lavoro con microglia perché promuove una morfologia ameboide, aumento della proliferazione, e fagocitosi aumentata9 spesso visto in vivo quando microglia sono esposti a fattori di ematica dopo l'interruzione della barriera sangue - cervello. Di queste metriche, le cellule esposte al siero assomigliano microglia in lesioni o Stati di malattia, ma tali alterazioni sono ridotti quando microglia sono coltivate in mezzo di sviluppo definito contenente CSF-1 (o IL-34), TGF-β, colesterolo e selenite.
Questo protocollo fornisce dettagli per la coltura di microglia giovanile del ratto nelle circostanze senza siero, relazionati al lavoro recentemente pubblicato9. Questo protocollo è stato ottimizzato per i ratti da giorno postnatale 21-30 (P21 - P30), ma può essere adattato per isolare microglia da ratti e topi di qualsiasi età, anche se resa e redditività complessiva varia a seconda della specie e l'età dell'animale. Maximal cede e redditività ottimale è raggiunta quando si utilizza un po' immatura microglia (~ P9), con rendimenti e vitalità si assottiglia gradualmente per un po ' i livelli più bassi negli animali adulti. Microglia può anche essere isolata dai topi, ma abbiamo trovato che le cellule del ratto mostrano significativamente più alti rendimenti, attuabilità e la complessità delle morfologie ramificate, rispetto alle cellule di topo in culture senza siero. Gli animali di età compresa tra maggiore di P50 non sono state valutate con questo protocollo. Questa procedura di isolamento di immunopanning è stata ottimizzata per minimizzare i cambiamenti nei profili trascrizionali microglial durante l'isolamento e per massimizzare a valle vitalità delle cellule. Utilizzando queste tecniche e formulazioni di media, alta redditività colture primarie possono essere sostenuti per settimane. Microglia in coltura in queste condizioni presentano una morfologia altamente ramificata che coinvolgono rapida estensione e retrazione dei processi e relativamente basso tasso di proliferazione. Evidenziamo il significato di siero-esposizione su queste proprietà e discutere i punti di forza e di debolezza di questo metodo rispetto altri approcci.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rat: Sprague-Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Cat# 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# MCA275R</td>
			<td>Panning: 1:1,000; Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polycolonal anti-Iba1&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# AB5076</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Ki67&#160;</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>Cat# AB15580</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11055</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-goat 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# A-21203</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# A-31573</td>
			<td>Staining: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X (detergent in ICC staining)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 28313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparan sulfate</td>
			<td>Galen Laboratory Supplies</td>
			<td>Cat# GAG-HS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Cat# M3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from milk solids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# P6838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 100-35B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IL-34</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>Cat# 5195-ML/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine wool cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>Cat# 700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>Cat# 354233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>Cat# 90260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>Cat# 20606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# E1169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# DPRFS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat# 17-5445-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T9935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 21041-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# 16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# S-5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>Cat# 0100-20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria Plates&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat# 62406-456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 10 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 5 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:25,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 200 &#956;g/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 2 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-34</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 200 &#956;g/mL in PBS 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine wool cholesterol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparan sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 1 mg/mL in H2O 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid/Gondoic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol 
			Concentration used: 1:1,000 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution: 50 mg/mL in PBS 
			Concentration used: 1:100 
			Storage: -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 50 &#956;g/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) 
			Comments: Use when ice-cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Douncing Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 200 &#956;L of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ 
			Comments: Use when ice-cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panning Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microglia Growth Medium (MGM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 &#956;g/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 &#956;g/mL N-acetyl cysteine, 5 &#956;g/mL insulin, 100 &#956;g/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite 
			Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV Coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: MGM containing 2 &#956;g/mL collagen IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Seperation Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 &#956;L 1 M CaCl2, 5 &#956;L 1 M MgCl2 
			Comments: Mix well after the addition of&#160; CaCl2 and MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 &#956;g/mL ovine wool cholesterol, 10 &#956;g/mL heparan sulfate, 0.1 &#956;g/ml oleic acid, and 0.001 &#956;g/ml gondoic acid 
			Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 &#176;C and do not add more than 1.5 &#956;g/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium

Microglia rappresentano il 5-10% di tutte le cellule del sistema nervoso centrale (SNC) e sono di disegno sempre più attenzione grazie al loro contributo durante lo sviluppo, l'omeostasi e la malattia. I macrofagi sono stati studiati in dettaglio per decenni, caratteristiche specializzate di microglia, i macrofagi residenti in tessuto del SNC, sono rimaste in gran parte misterioso, in parte a causa di limitazioni nella capacità di ricapitolare microglial maturo Proprietà nella cultura. Qui, vi illustriamo una procedura semplice per l'isolamento rapido di microglia pura da roditore cervello maturo. Descriviamo anche condizioni di coltura privo di siero che supportano alti livelli di redditività microglial nel corso del tempo. Microglia coltivate in queste condizioni definite e medie mostre elaborati processi ramificati e comportamento dinamico sorveglianza. Illustriamo alcuni effetti di esposizione sierica sulla microglia coltivate ed discutere come queste culture senza siero confrontare culture siero-esposti così come il microglia in vivo.

Questo protocollo descrive un metodo di cultura elevata purezza ramificata microglia da ratti giovani. Risultati simili possono essere ottenuti utilizzando animali immaturi, perinatali e adulti, come discusso di seguito. Poiché gli isolamenti delle cellule includono spesso sottili sfumature e molte opportunità per cellule di morire, abbiamo usato i punti di controllo di controllo di qualità per aiutare a determinare il successo alle varie fasi. Abbiamo controllato in genere sospensioni cellulari utilizzando un emocitometro a più passaggi nel protocollo di isolamento (Figura 1A). Gli isolamenti di successo dovrebbero produrre 2,5-5 x 105 animali di cellule/giovanile. Animali da P7 - P15 mostrano rendimenti più vicino a 5 x 105 cellule/animale, mentre le cellule isolate da animali più vecchi di P30 mostrano rendimenti più vicino a 2,5 x 105 cellule/animale. Oltre il monitoraggio totale delle cellule conta in tutto il protocollo, è importante determinare la salute generale delle cellule isolate, che può essere difficile perché microglia isolata in questo modo hanno una morfologia arrotondata o bipolare durante i primi giorni nella cultura . Qui, abbiamo incluso immagini di fase di P25 microglia in coltura durante i primi 6 giorni dopo l'isolamento in TIC e TIC contenente 10% di siero fetale di vitello (FCS) (Figura 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57122/57122fig1.jpg"> Figura 1: valutazione di salute delle cellule durante il protocollo di isolamento e in 6 giorni di cultura. (A) contrasto di fase immagini illustrando i punti di controllo di controllo di qualità presso i designato fasi della procedura di isolamento delle cellule. Sospensioni cellulari erano imaged mescolando 9 µ l di sospensione cellulare con 1 µ l di 0,4% trypan blu prima di caricarla su un emocitometro. Altre immagini mostrano il panning piatto stesso, e tutte le immagini vengono visualizzate come un campo a 20 ingrandimenti. Barra di scala, 200 µm. MGM, coltura di microglia. (B) corso di tempo dei cambiamenti morfologici microglial e proliferazione in 6 giorni di cultura in privo di siero TIC crescita media o TIC più 10% di siero fetale di vitello (FCS). Le cellule CD11b-immunopanned erano esatte placcato sulla piastra di coltura di tessuto collagene-rivestito anionici/cationici rivestito (Vedi Tabella materiali per i dettagli), e lo stesso campo era imaged di contrasto di fase ogni 24 h. scala bar, 100 µm. TIC, TGF-β2/IL-34 / Terreno di coltura contenente colesterolo. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57122/57122fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La valutazione sistematica della salute e la vitalità delle cellule isolate è importante per il successo degli esperimenti e riproducibilità. Qui indichiamo microglia isolata da un animale di P21 coltivato in MGM, TIC o TIC completati con 10% FCS dopo 7 giorni in vitro (DIV) con un'analisi di attuabilità. Se l'isolamento è stata completata, culture mostrano tra 80-90% redditività in TIC dopo 7 DIV. cellule coltivate in presenza di siero alla fine salire a quasi 100% redditività da questa misura, tuttavia questo è gonfiato artificialmente sia di rapida proliferazione di le cellule esposte al siero e rapida fagocitosi delle cellule morte all'interno di queste culture (Figura 2A). Oltre alla sopravvivenza robusto, TIC coltivate cellule mostrano anche una morfologia ramificata rispetto al FCS trattato le cellule (Figura 2B, C).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57122/57122fig2.jpg"> Figura 2: sopravvivenza di microglia in MGM, TIC o TIC + FCS più di sette giorni nella cultura. (A) le cellule sono state isolate dai ratti P21 e coltivate in terreno di coltura di microglia (MGM), contenente il mezzo di crescita TGF-β2/IL-34/colesterolo (TIC), o TIC + 10% siero fetale del vitello (FCS). In ogni punto del tempo, terreno di coltura è stata completata con calceina (finale 1.33 µM) e omodimero di etidio (2,5 µM finale) per 15 min etichettare le cellule vive e cellule morte, rispettivamente. Le cellule sono state contate in ogni campo usando uno script automatico di ImageJ. (B e C) dopo 7 DIV, con nessun cambiamento di media, cellule cresciute in TIC (B) o TIC completati con 10% FCS (C) sono state macchiate per marcare le cellule vivi e morte come sopra. Immagini rappresentative sono state scattate con un 10 X (sinistra) o 40x (a destra). Barra della scala, 40 µm. barre di errore rappresentano errore standard della media (SEM). Questa figura è stata modificata da Bohlen et al. 9 e usato con permesso. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57122/57122fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per dimostrare il successo isolamento e coltura di microglia altamente pura, abbiamo isolato la microglia dai ratti P21 e coltivato queste cellule in TIC o TIC completati con 10% FCS per 8 giorni. Le cellule erano quindi fissi e macchiate con marcatori microgliali (Iba-1 e CD11b) e indicatore di proliferazione (Ki67, Figura 3A). In aggiunta alla macchiatura per gli indicatori delle cellule, RNA-seq sulle cellule di recente isolate possono fornisce uno strumento potente e sensibile per valutare il profilo di RNA delle cellule e possono aiutare ad informare la purezza iniziale delle culture. CD11b immunopanning in genere comporta una piccola percentuale di CD11b+ riporto neutrofili/monociti oltre CD11b+ microglia (Figura 3B). Queste cellule moriranno in TIC dopo pochi giorni, ma possono complicare l'analisi dei punti di tempo precedenti.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57122/57122fig3.jpg"> Figura 3: purezza delle cellule coltivate come valutato da immunohistochemistry e RNA-seq. Microglia (A) sono stati isolati dai ratti di P21, piastrate su PDL/collagene rivestito vetrini coprioggetti e coltivate in terreno di coltura contenente TGF-β2/IL-34/colesterolo (TIC) per 8 giorni. Le cellule erano fissate con paraformaldeide al 4% (PFA) per 10 min a temperatura ambiente e immunitario-macchiati con Iba-1 (1: 500), CD11b (1: 1500) e Ki67 (1: 500). Brevemente, celle fisse sono state bloccate con 0,1% detergente (Vedi tabella di metodi per i dettagli) e 10% di siero normale asino (NGS) per 1 h a temperatura ambiente. Le cellule sono state quindi incubate con anticorpi primari in 0,1% detergente con 1% NGS durante la notte a 4 ° C. Le cellule sono state lavate tre volte per 5 minuti ciascuno in PBS. Le cellule poi sono state incubate con anticorpi secondari tutti 1: 500 in 0,1% detergente con 1% NGS per 1 h a temperatura ambiente. Le cellule erano nuovamente lavate tre volte in PBS e montate con DAPI-contenente mezzo di montaggio. Immagini rappresentative sono state prese a 40 ingrandimenti. Barra della scala, 50 µm. (B) espressione di specifici trascritti cellula-tipo rappresentativo dalle cellule appena isolato e coltivate. Microglia sono stati isolati dai ratti P21 e lisate direttamente dal piatto immunopanning per isolamento del RNA e RNA-seq. marcatori di altri tipi di cellulari principali CNS (astrociti, neuroni, oligodendrociti e cellule endoteliali) mostrano contaminazione minima del Cellule CD11b-immunopanned. Marcatori del neutrofilo vengono rilevati nelle cellule appena isolato (nero), ma si perdono nelle culture privo di siero (grigio). Cellule coltivate esprimono alti livelli di marcatori del macrofago comuni, ma marcatori definisce la firma specializzata microglial sono rapidamente downregulated dalle cellule coltivate. Barre di errore rappresentano errore standard della media (SEM). I dati vengono modificati da Bohlen et al. 9 e usato con permesso. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57122/57122fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Macchiando per redditività e gli indicatori delle cellule consente di determinare la sopravvivenza e la purezza delle cellule, ma fornisce informazioni limitate sulle dinamiche della cultura. Qui abbiamo fornito un filmato time-lapse di P21 ratto microglia dopo 14 DIV in TIC. Dopo due settimane, senza siero culture mostrano comportamento dinamico sorveglianza, con rapido processo estensioni e retrazioni in tutto il piatto (Vedi Movie 1). Inoltre, precedentemente abbiamo trovato che l'esposizione del siero trasforma questi riposo proprietà dello stato di microglia, con conseguente cambiamenti morfologici e fagocitici della durata. Abbiamo incluso un filmato di microglia coltivate per 5 giorni in TIC, poi esposti a 10% FCS (Vedi film 2).
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57122/57122mov1.jpg"> Movie 1: culture microglia definito e medie mostrano morfologia ramificata con processi dinamici. Le microglia sono stati isolati da un ratto P21, spot piastrate su piastre rivestite con collagene anionici/cationici coltura di tessuti rivestiti e coltivate per 14 giorni in TIC. A 14 DIV, immagini sono stati raccolti ogni 3 min. Il filmato viene riprodotto a 6 fotogrammi/s, e il timestamp nell'angolo inferiore destro indica la durata dell'imaging in h:min. film è riprodotto da Bohlen et al. 9 e usato con permesso. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57122/Movie_1.avi" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57122/57122mov2.jpg"> Movie 2: l'esposizione del siero provoca un rapido cambiamento morfologico in colture microgliali definito medio-. Le microglia sono stati isolati da un ratto P21, spot piastrate su piastre rivestite con collagene anionici/cationici coltura di tessuti rivestiti e coltivate per 5 giorni nel TIC. Alle 5 DIV, immagini sono stati raccolti ogni 5 min Baseline motilità/morfologia è stata registrata, quindi alle 02:55 (2 h e 55 min), un cambiamento di media di 50% è stato effettuato per aggiungere FCS a una concentrazione finale di 10%. Le cellule erano imaged per ulteriori 7 h. Il filmato viene riprodotto a 6 fotogrammi/s e il timestamp nell'angolo inferiore destro indica la durata di imaging in h:min. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57122/Movie_2.avi" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>

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Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Sforzi per comprendere la funzione di microglial in dettaglio sono stati ostacolati dalla mancanza di modelli di cultura microglial che ricapitolano le proprietà di microglia maturo in vivo . Questo protocollo descrive un metodo di isolamento e coltura progettato per mantenere la sopravvivenza robusto di ratto maturo altamente ramificato microglia in condizioni definite e medie.

Isolamento e coltura di Microglia roditore per promuovere una dinamica ramificate morfologia in Medium senza siero

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

isolation-culture-rodent-microglia-to-promote-dynamic-ramified

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.8K Views.  Stanford University. Sforzi per comprendere la funzione di microglial in dettaglio sono stati ostacolati dalla mancanza di modelli di cultura microglial che ricapitolano le proprietà di microglia maturo in vivo . Questo protocollo descrive un metodo di isolamento e coltura progettato per mantenere la sopravvivenza robusto di ratto maturo altamente ramificato microglia in condizioni definite e medie.

Video: Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Analisi automatizzata Sholl di Digitized morfologia neuronale a scale multiple

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

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Neuroscienze

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Isolamento e la coltura di cellule embrionali neuronali di ratto: un protocollo veloce

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Consegna diretta intraventricolare di farmaci per il sistema nervoso centrale, Roditore

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

Isolamento del liquido cerebrospinale da embrioni roditori per l&#39;uso con sezionato espianti cerebrali corticali

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Dynamic Quantitative Sensory Testing to Characterize Central Pain Processing

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain processing is present in many chronic pain conditions and can influence responses to specific therapies. Thus, the ability to precisely describe the state of central pain processing has profound clinical significance in both prognosis and prediction. Because it is not practical to record neuronal firings directly in the human spinal cord, surrogate behavior tests become an important tool to assess the state of central pain processing. Dynamic QST is one such test, and can probe both the ascending facilitation and descending modulation of incoming nociceptive signals via TS and CPM, respectively. Due to the large between-individual variability in the sensitivity to noxious signals, standardized TS and CPM tests may not yield any meaningful data in up to 50% of the population due to floor or ceiling effects. We present methodologies to individualize TS and CPM so we can capture these measures in a broader range of individuals than previously possible. We have used these methods successfully in several studies at the lab, and data from one ongoing study will be presented to demonstrate feasibility and potential applications of the methods.

By assessing pain in response to repetitive or different types of standardized stimuli, dynamic quantitative sensory testing (QST) can reveal changes in the central processing of pain. We present methods to optimize and individualize two dynamic QST measures: temporal summation (TS) and conditioned pain modulation (CPM).

Dinamico Quantitative Sensory Test per caratterizzare Central Processing Pain

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolamento e l'estrazione di RNA dei neuroni, macrofagi e Microglia da cervelli di Zebrafish larvale

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As the first responders, microglia have important functions to mitigate neuron and glia dysfunction, and in this process, they undergo a broad range of morphologic changes. Microglia morphologies can be categorized descriptively or, alternatively, can be quantified as a continuous variable for parameters such as cell ramification, complexity, and shape. While methods for quantifying microglia are applied to single cells, few techniques apply to multiple microglia in an entire photomicrograph. The purpose of this method is to quantify multiple and single cells using readily available ImageJ protocols. This protocol is a summary of the steps and ImageJ plugins recommended to convert fluorescence and bright-field photomicrographs into representative binary and skeletonized images and to analyze them using software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) and FracLac for morphology data collection. The outputs of these plugins summarize cell morphology in terms of process endpoints, junctions, and length as well as complexity, cell shape, and size descriptors. The skeleton analysis protocol described herein is well suited for a regional analysis of multiple microglia within an entire photomicrograph or region of interest (ROI) whereas FracLac provides a complementary individual cell analysis. Combined, the protocol provides an objective, sensitive, and comprehensive assessment tool that can be used to stratify between diverse microglia morphologies present in the healthy and injured brain.

Microglia are brain immune cells that survey and react to altered brain physiology through morphologic changes which may be evaluated quantitatively. This protocol outlines an ImageJ based analysis protocol to represent microglia morphology as continuous data according to metrics such as cell ramification, complexity, and shape.

Quantificare la morfologia di Microglia da microfotografie di Immunohistochemistry preparato tessuto usando ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...