Ringraziamo Mickael Lelek, Orestis Faklaris e Nicolas Bourg per la proficua discussione, Andrey Aristov ed Elena Rensen per aiuto con la tecnica di Super-risoluzione e Shailaja Seetharaman per una lettura attenta del manoscritto. Noi riconosciamo con gratitudine Citech UtechS fotonici Bioimmagini (Imagopole) dell'Institut Pasteur (Parigi, Francia), nonché la rete di infrastrutture di Francia-bioimmagini supportato da French National Research Agency (ANR-10-INSB-04; Investimenti per il futuro) e la Région Ile de France (programma Domaine d'Intérêt Majeur-Malinf) per l'uso del microscopio Elyra. Questo lavoro è stato supportato dalla Ligue Contre le Cancer e la French National Research Agency (ANR-16-CE13-0019).

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Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Fasi critiche nel protocollo
Presentiamo qui un protocollo che riduce al minimo gli artefatti nelle immagini dSTORM dei microtubuli e IFs nelle cellule gliali. Gli artefatti possono essere creati in ogni fase della preparazione del campione e la formazione immagine: fissazione, blocco, immunolabeling, deriva durante l'acquisizione, non ottimale lampeggiante condizioni23. Elenchiamo qui di seguito le fasi più critiche.
Pulizia lamelle è un passo importante per limitare il legame non specifico di fluorofori sulla superficie e quindi di limitare il rumore di fondo nell'immagine dSTORM.
Ti consigliamo di fissare il campione con un passo di estrazione e fissazione soluzioni utilizzando un mix di glutaraldeide e triton e quindi la fissazione con PFA (paraformaldeide) (passo n ° 3). Il protocollo di fissazione è stato adattato da Chazeau et al12: abbiamo diminuito il tempo di incubazione del passaggio di estrazione/fissazione per 60 s (punto 3.4), rimuovere il glucosio dal buffer del citoscheletro e saltato il passo extra di permeabilizzazione. Il vantaggio di questo metodo è che le subunità liberamente commovente del citoscheletro sono drenate di distanza, consentendo la formazione immagine di Super-risoluzione con meno priorità bassa12. Più in generale il passaggio di fissazione è fondamentale perché piombo cattiva fissazione (usando vecchio PFA, soluzioni a freddo, troppo lungo/breve incubazione passi) alla parziale distruzione delle reti di filamenti (microtubuli rotti, microtubuli che non raggiungono la parte anteriore delle cellule e/o in un bassa densità). Si noti che è anche possibile utilizzare fissazione di metanolo, soprattutto se solo la rete di vimentina è imaged come descritto in Leduc et al15. Tuttavia, il rumore di fondo può essere osservato all'interno della cellula (Figura 5). Anche se dSTORM le immagini ottenute con metanolo fissata le cellule sono di qualità più scadente, che ancora forniscono informazioni su cosa sia se e reti microtubule dovrebbero assomigliare ad es. in termini di densità di filamenti. Fissazione con solo glutaraldeide ha dato risultati molto poveri per IFs, sebbene sia il protocollo migliore per microtubule fissazione23.
Nella parte di immunostaining, è importante utilizzare gli anticorpi anti-topo che minimizzano il cross-reazione con anticorpi sviluppati nel ratto. Non abbiamo potuto utilizzare frammenti Fab (anti-topo) per questo motivo, perché essi cross-reagiscono non specifico con la anti-tubulina ratto oltre il mouse anti-vimentin.
A causa della potenza laser limitata disponibile, è necessario utilizzare sia 488 e 561 nm laser linee per pompare i coloranti Alexa555 allo stato scuro. Ad alta potenza laser 488 (~ 50%) è necessario anche durante l'acquisizione di osservare buona lampeggiante e basso duty cycle (la frazione di tempo un fluoroforo spende in stato on), anche se aumenta anche il rumore di fondo. La modalità di illuminazione TIRF limita l'eccitazione di fluorofori in uno strato sottile (~ 200 nm sopra il vetrino coprioggetti). Esso aumenta il rapporto segnale-rumore facendo diminuire la luce di sfondo, ma diminuisce anche il potere di eccitazione. La modalità di HILO consente taglio assiale e può essere efficiente per ottimizzare il rapporto segnale-rumore. È quindi un bene intermedio tra epi e TIRF. Utilizzando la modalità di HILO è essenziale per eccitare in modo efficiente i fluorofori Alexa555, che richiedono ad alta potenza laser a lampeggiare correttamente.
Un altro passaggio fondamentale è l'acquisizione di dati grezzi (passaggio 6). È necessario regolare i parametri di acquisizione (esposizione, guadagno, TIRF e messa a fuoco anche quando nessun dispositivo di blocco di messa a fuoco è disponibile) mentre il film viene acquisito. Mantenere una densità ottima di fluorofori brillante è importante (Figura 1A): deve essere sufficientemente bassa per separare spazialmente ogni colorante, ma abbastanza in alto per visualizzare la struttura intera dopo 40 000 fotogrammi. Se il numero di molecole attivate è troppo basso, gli stack più lunghi dovrebbero essere acquisiti. Abbiamo ottenuto buone immagini con ~ 5000 localizzazioni per µm² per IFs e 2 500 localizzazioni per cm ² per i microtubuli.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi del metodo
È importante lavorare con campioni freschi e ottimizzata buffer di imaging. pH dovrebbe essere adattata con precisione, specialmente per la MEA.
Il vimentin e microtubuli dovrebbero essere uniformemente con etichettati quando imaged con tecnica di microscopia grandangolari standard (WF). Se filamenti Guarda punteggiato/tratteggiata con microscopia classica, questo sarà amplificato quando si utilizza la risoluzione super. In questo caso, è preferibile preparare nuovi campioni. Condizioni di fissazione non ottimizzato (vecchio PFA ecc) potrebbero microtubuli cercando frammentato. Alta priorità bassa sulla superficie del vetro può derivare da un blocco inefficiente. In tal caso, BSA (albumina di siero bovino) può essere sostituito da FBS (siero fetale bovino) e utilizzato in ogni fasi di incubazione.
Se la densità di etichettatura è troppo alta (Figura 1B) e non può essere sufficientemente spinto nello scuro fuori-stato, anche con la più alta potenza del laser, la quantità di secondaria anticorpi dovrebbero essere abbassati (meglio di diminuire la quantità di anticorpi primari). Tuttavia, questo richiede la preparazione di nuovi campioni. In generale, è necessario valutare empiricamente la quantità di anticorpi secondari da utilizzare.
Se non lampeggia normalmente i fluorofori (dovrebbero essere nello stato brillante durante un solo frame), verificare che il pH del tampone imaging è corretta (pH 8.3). Se il problema persiste (soprattutto MEA), preparare nuove soluzioni. Verificare sempre che il collimatore TIRF su (TIRF u_HP). Con potenza limitata del laser, ottenendo corretta lampeggiante può essere impegnativo (on e off tariffe così come tintura luminosità dipende dalla potenza del laser, come descritto van de Linde et al.11). Altri coloranti come Alexa488 o Atto488 può essere esplorato se più potenza del laser di eccitazione è disponibile14.
Se i fluorophores smette di lampeggiare prima della fine dei 40 000 telai, modificare il buffer di imaging che potrebbe avere stato ossidato. Verificare che non ci sia bolle d'aria tra il buffer e il coperchio dopo la modifica di buffer. Sigillato campioni potrebbero essere imaged per qualche ora in un formato raw.
Se i film di tempesta vengono acquistati su un normale microscopio TIRF equipaggiato con un EMCCD, è possibile utilizzare ThunderSTORM24 per ricostruire le immagini. Opzioni simili sono disponibili per la correzione di deriva, filtro immagini e rendering delle immagini. Temporale è un plugin utilizzato con il software di Fiji/imageJ. Risultati simili sono stati ottenuti con il software del produttore e temporale (Figura 6).
CULLA (cicloottatetraene) può essere aggiunto al buffer imaging per migliorare la precisione di localizzazione delle singole molecole. Aumenta il numero di fotoni emessi per ciclo per Alexa64725. Infatti è stata osservata una migliore precisione di localizzazione (fino a 6 nm) quando l'aggiunta di 2 mM culla nel buffer di tempesta descritta nella fase 5 o con 100mm MEA come descritto nel riferimento25. Tuttavia, in queste condizioni, il numero di molecole luminose durante acquisizione diminuisce molto più veloce senza culla, limitando il numero totale delle localizzazioni di molecola alla fine dell'acquisizione e conseguente potenziale sotto-campionamento della rete se. Altri buffer di formazione immagine sono stati segnalati a lavorare bene con le tinture di Alexa, ad esempio utilizzando lattasi e oxyrase come ossigeno lo scavenging sistema26. In questo protocollo, segnaliamo la composizione del tampone che ha dato i migliori risultati in termini di risoluzione per il nostro tipo di campioni e imaging istituito, ma ogni tipo di campione richiede buffer ottimizzazione, oltre a etichettatura e ottimizzazione di condizioni di fissazione.
Limiti del metodo e possibili miglioramenti
Il metodo presentato qui è limitato a celle fisse e immagini 2D. Utilizzando uno standard set di immagini fino con un microscopio TIRF e un EMCCD, il fattore più limitante era le potenze laser (100 mW per il laser 561 nm non era sufficiente per far i coloranti Alexa555 lampeggiare). Una linea di 532 nm laser può essere più efficiente per eccitare questi coloranti. Un possibile miglioramento del metodo sarebbe quello di eseguire dSTORM 3D utilizzando ottiche astigmatismo27. Ciò richiederebbe modifiche minime del protocollo, ad eccezione di una minore densità di etichettatura e un numero di telaio aumentato. 3D doppio colore immagine tempesta fornirebbe una vista migliore di IFs avvolto intorno i microtubuli, soprattutto in fasci. Si noti che i filamenti dell'actina ha potuto essere osservati anche utilizzando lo stesso metodo di fissazione e una quantità ottimizzata di falloidina fluorescente8. 3 colore tempesta potrebbe essere usato per osservare l'organizzazione dei tre sottosistemi del citoscheletro.
Usando gli anticorpi primari e secondari aumenta la dimensione dell'oggetto di interesse poiché l'anticorpo secondario è localizzato fino a 20 nm dalla destinazione. In genere, un microtubulo 25-nm di diametro avrà una larghezza di ~ 50 nm dopo l'etichettatura. Una possibilità per migliorare la distanza tra il bersaglio e il colorante è etichettare direttamente gli anticorpi primari con i coloranti appropriati. Idealmente nanobodies etichettati con coloranti organici dovrebbero essere usate28.
Forniamo qui solo un metodo semplice per stimare la precisione di localizzazione medio di una singola molecola seguire Endesfelder et al.22. La risoluzione generale delle immagini che prende in considerazione entrambi precisione di localizzazione ed etichettatura densità, può anche essere misurata utilizzando l' approccio di Fourier anello correlazione29.
Per quanto riguarda la registrazione del canale, è difficile per sovrapporre perfettamente tutte le perline presenti nel campo visivo. Una correzione più complessa si trovano in Chazeau et al 12.
Limitazioni derivanti dal lampeggiare di fluorofori e candeggio delle sonde possono essere superate utilizzando DNA-vernice (accumulo di punti del DNA per l'Imaging in scala nanometrica topografia)30. In questo metodo, il lampeggio necessarie per la localizzazione di singola molecola viene creato dall'associazione transitoria di breve-tingere-contrassegnati oligonucleotidi a loro obiettivi complementari.
Conclusione
Questo articolo presenta un robusto protocollo per eseguire doppio-colore dSTORM imaging in 2 dimensioni dei filamenti del citoscheletro in cellule fisse. Le condizioni sperimentali che sono state trovate ottimale in termini di fissazione, immunolabeling e imaging buffer per il nostro tipo di campione sono descritti nel dettaglio. Quindi, il processo di acquisizione di dati grezzi e il tipo di lampeggiante immagini che devono essere registrati (densità di molecola, rapporto segnale-rumore, fluoroforo dovere ciclo ecc) è presentato così come come ricostruire le immagini dSTORM, correggere la deriva e filtrare i dati. Questi passaggi sono generici per l'imaging di doppio-colore dSTORM e non assaggiare il tipo specifico. Infine, viene mostrato come questa tecnica aiuta a risolvere l'organizzazione densa delle due reti del citoscheletro accoppiate.

I filamenti intermedi citoplasmatici (IFs) sono 10 nm di diametro omo - o eteropolimeri di un sottoinsieme specifico del tipo di cella di proteine se. IFs partecipare a una vasta gamma di funzioni cellulari quali risposte di motilità, proliferazione e lo stress delle cellule. Loro ruolo chiave è evidenziato dal fatto che più di 90 malattie umane sono direttamente causati da mutazioni in proteine se; per esempio, cambiamenti nella composizione se accompagna la crescita del tumore e la diffusione di1,2,3. Vi è crescente evidenza che i tre sistemi di citoscheletro lavorano in collaborazione per controllo funzioni cellulari quali la polarizzazione della cellula, divisione e migrazione2,3. Poiché non vi è un accoppiamento stretto tra architettura spaziale e funzioni, è fondamentale ottenere approfondimenti l'organizzazione strutturale del se con altri filamenti e capire meglio il cross-talk del citoscheletro. Questo articolo fornisce un protocollo per eseguire il Super-risoluzione tecnica dual-color dSTORM (diretto stocastico microscopia ottica a ricostruzione)4 e come utilizzarlo per studiare l'interazione tra se e i microtubuli in fisso, coltivate cellule in 2 dimensioni (2D).
Diverse tecniche di Super-risoluzione sono state sviluppate nel corso degli ultimi dieci anni e là scoperte furono all'origine del premio Nobel in chimica nel 20145. Tra tutte queste tecniche si trova i metodi basati su localizzazione singola molecola come PALM6 (Photo-Activated localizzazione microscopia) che utilizza proteine fluorescenti fotomodulabili, tempesta7 con coppie di fluorofori o dSTORM4 con fluorofori convenzionali. Tutti questi metodi sono basati sullo stesso principio che consiste di (i) l'interruttore della maggior parte dei reporter fluorescente in un stato "spento" "di stato (ii) l'attivazione stocastica di un sottoinsieme di essi in una fluorescente (non fluorescente), al fine di localizzare loro posizione spaziale con precisione nanometrica e (iii) la ripetizione di questo processo al fine di attivare come molti sottoinsiemi di fluorofori come possibile. Un'immagine finale viene ricostruita utilizzando tutte le localizzazioni delle molecole attivate, fornendo una risoluzione laterale fino a ~ 20-40 nm. Diversi sistemi ottici commercializzati permettendo PALM/STORM sono ora disponibili per i biologi per esperimenti di routine. Qui, uno di questi sistemi è stato usato per studiare l'associazione strutturale dei microtubuli e IFs. Tra tutti i singola molecola basati su localizzazione metodi, la tecnica di doppio-colore dSTORM è stata selezionata, perché è adatto per osservare regioni lamellare molto sottile (< 1 µm) delle cellule aderenti e può fornire un significativo miglioramento della risoluzione dell'immagine con investimento minimo di tempo e denaro. Infatti, dSTORM è una tecnica molto comoda e versatile che è compatibile con i coloranti organici standard abitualmente utilizzati per la colorazione cellulare e immunofluorescenza.
Mentre un colore dSTORM immagini sono relativamente semplici da ottenere utilizzando il fluoroforo Alexa6478, dSTORM doppio colore richiede per ottimizzare le condizioni sperimentali, in modo che due coloranti possono lampeggiare correttamente nel buffer selezionate, soprattutto quando c'è limitato potere del laser. Eccellente documenti sono già disponibili sui metodi per impostare la pagina di formazione immagine di multi-colore con dSTORM9,10,11,12,13, e questi documenti spiegano in dettaglio le possibili fonti di artefatti e risoluzione dell'immagine degradata e come superarli. In questo articolo, le condizioni sperimentali ottimali in termini di cellule fissazione, immunostaining, preparazione del campione, sono descritti al fine di acquisire immagini di fitte reti di IF citoplasmatici e microtubuli in imaging acquisizione e ricostruzione dell'immagine cellule gliali con dual-color dSTORM. Brevemente, il metodo di estrazione/fissazione descritto in Chazeau et al12 è stato adattato alle cellule gliali e utilizzato con un passaggio di post-fissazione, concentrazione di anticorpi ottimizzata, un buffer di tempesta con 10mm MEA descritto in Dempsey9 et al., che era risultati ottimali per la sperimentale messa a punto e il tipo di campione.
Cellule gliali esprimono principalmente tre tipi di proteine se: il vimentin, nestina e GFAP (proteina fibrillare acida). Queste tre proteine sono state indicate per co-polimerizzare in astrocytes14. Precedentemente abbiamo mostrato usando microscopia di Super-risoluzione strutturato illuminazione (SR SIM) che queste tre proteine se possono essere trovate nel singolo filamento di se stesso e consentono di visualizzare simile distribuzione e dinamica in cellule gliali 15. Dovuto le somiglianze tra le tre proteine di se, vimentin macchiatura è stata usata come reporter per l'intera rete di se. Utilizzando dSTORM, siamo riusciti a risolvere come fasci di forma se lungo i microtubuli, che non era possibile con la diffrazione limitata microscopia tecniche15. Queste osservazioni possono aiutare a comprendere come il vimentin IFs può microtubuli modello e regolare la loro traiettoria di crescita, promuovendo il mantenimento di un asse di polarità durante la migrazione di cellule16. Immagini di Super-risoluzione fornito informazioni chiave sull'interazione reciproca dei due sottosistemi del citoscheletro e portato approfondire il legame tra associazione spaziale e funzione locale che potrebbe essere il tipo di cella specifici17. In generale, dSTORM dual-color consente di studiare il crosstalk tra elementi del citoscheletro o altri tipi di organelli, condizione che immunostaining buone condizioni sono raggiunti in termini di densità e specificità. Questa tecnica sarà utile per caratterizzare meglio i cambiamenti di citoscheletro osservati durante astrogliosis e nel glioblastoma, il tumore più comune e più maligni del sistema nervoso centrale, dove l'espressione di proteine se è alterato 18 ,19,20,21.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Media (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41090-028</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non essential amino acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1140-050</td>
			<td>cell culture 1/100e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>cell culture 1/100e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F&#339;tal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>cell culture 1/10e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,05 % Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>fischer scientific</td>
			<td>11540486</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslip 18 mm n&#176;1,5H</td>
			<td>Marienfield/Dominic dutsher</td>
			<td>900556</td>
			<td>coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (PFA) solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td>cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td>cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td>non ionic surfactant. Used for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium borohydride (NaBH4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>452904-25ML</td>
			<td>cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>sample passivation 3% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6630</td>
			<td>primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti alpha tubulin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>MCA77G</td>
			<td>primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10635923</td>
			<td>secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10226162</td>
			<td>secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres, 0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>T7279</td>
			<td>fluorescent beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamlide magnetic chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>CM-B18-1</td>
			<td>magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteamine (MEA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30070</td>
			<td>for the blinking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543</td>
			<td>for the blinking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>sigma</td>
			<td></td>
			<td>for the blinking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322</td>
			<td>for the blinking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (trizma)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>for the blinking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash-N-Dry&#160;coverslip rack</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z688568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonic cleaner</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15-335-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick plasma</td>
			<td>PDC-32G-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging intermediate filaments and microtubules with 2-dimensional direct stochastic optical reconstruction microscopy

Il citoscheletro, composto di microfilamenti di actina, microtubuli e filamenti intermedi (IF), svolge un ruolo chiave nel controllo della forma delle cellule, la polarità e la motilità. L'organizzazione delle reti di actina e dei microtubuli è stato studiato estesamente, ma quella di IFs non è ancora pienamente caratterizzato. IFs hanno un diametro medio di 10 nm e forma una rete che si estende in tutto il citoplasma delle cellule. Sono fisicamente associate con l'actina e i microtubuli attraverso motori molecolari e linker del citoscheletro. Questa stretta associazione è al centro dei meccanismi normativi che garantiscono la regolazione coordinata delle tre reti del citoscheletro necessari per la maggior parte delle funzioni delle cellule. È pertanto fondamentale per visualizzare IFs da solo e anche insieme a ciascuna delle altre reti del citoscheletro. Tuttavia, se le reti sono estremamente dense nella maggior parte dei tipi di cellule, soprattutto nelle cellule gliali, che rende molto difficile da raggiungere con microscopia di fluorescenza standard la sua risoluzione (risoluzione di ~ 250 laterale nm). Microscopia ottica stocastica diretta di ricostruzione (dSTORM) è una tecnica che permette un guadagno nella risoluzione laterale di un ordine di grandezza. Qui, indichiamo che laterale dSTORM risoluzione è sufficiente per risolvere l'organizzazione densa delle reti se e, in particolare, dei pacchi di se che circondano i microtubuli. Tale stretta associazione è probabile che partecipano alla regolazione coordinata di queste due reti e maggio, spiegare come modello IFs vimentin e stabilizzare la organizzazione dei microtubuli, nonché potrebbe influenzare il traffico vescicolare dipendente dei microtubuli. Più in generale, vi mostriamo come l'osservazione di due componenti citoscheletriche con tecnica dual-color dSTORM porta nuova comprensione nella loro reciproca interazione.

Un microscopio dotato di 50 mW 405 nm e laser a stato solido da 100 mW 488, 561 e 642 nm, un EMCCD 512x512 fotocamera, un alpha Plan Apo 100 X / 1,46 obiettivo e Band Pass 570-650 / 655 emissione filtri passa-lungo è stato usato per i risultati rappresentativi presentati di seguito.
Figura 1A fornisce un esempio di molecola densità e segnale / rumore che deve essere utilizzato durante l'acquisizione di immagini raw. Immagini di buona qualità sono ottenute con un minimo di ~ 1 µm tra molecole vicine. In buone condizioni lampeggiante, fluorofori dovrebbero essere presenti in un solo fotogramma. Buona lampeggiante richiede per regolare le condizioni di buffer imaging (pH, agente riduttore, sistema di lavaggio dell'ossigeno) e poteri di laser, che influenzano le su-fuori-aliquote e fluorophores e pertanto il dovere ciclo (la frazione di tempo che trascorre un fluoroforo in stato on)9,11. Figura 1B, al contrario, fornisce un esempio di immagine raw, dove la densità di molecola è troppo alta e singola molecola non può essere risolto.
Figura 1 Mostra un istogramma tipico di precisione di localizzazione per tutte le molecole rilevati e analizzati dal software di produttori da una pila di 20 000 fotogrammi. Questo istogramma corrisponde all'immagine di dSTORM della rete dei microtubuli illustrata nella Figura 3B. I valori di precisione di localizzazione forniti dal software del produttore sono in buon accordo con il passaggio seguente stima i valori 8, utilizzando la precisione di puntamento di una singola molecola localizzata a tempi diversi punti22 (Figura 1).
La Figura 2A Mostra un tipico esempio di dSTORM immagine di vimentin filamenti immunolabeled con Alexa647. L'aumento della risoluzione può essere osservato chiaramente il confronto con l'immagine acquisita con un microscopio grandangolari standard (Figura 2B-C). I profili di intensità di fluorescenza rappresentati in Figura 2D mostrano che formazione immagine di microscopia di Super-risoluzione consente di risolvere il vimentin fasci. La risoluzione di dSTORM è sufficiente contare il numero di filamenti presenti nei pacchetti.
Figura 3 Mostra un esempio tipico di doppio-colore dSTORM immagine del vimentin e tubulina immunolabeled reti con Alexa647 e Alexa555 rispettivamente. La sovrapposizione delle due reti dimostra che i fasci di vimentin sono spesso localizzati lungo i microtubuli, fornendo informazioni strutturali chiave sull'accoppiamento tra i due sottosistemi di citoscheletro.
La figura 4 illustra vari esempi di immagini dSTORM dei microtubuli, ottenuti in condizioni non ottimali. In primo luogo, utilizzando Alexa488 e un buffer con 143 mM beta-mercaptoetanolo (un altro agente riduttore usato invece MEA9,10,11) e un sistema di scavenging di ossigeno (composto di 40 µ g/mL e 0,5 mg/mL glucosio ossidasi catalasi), fluorophores erano lampeggia ma non erano abbastanza brillante da essere precisamente localizzate (numero troppo basso fotone) (Figura 4A). In secondo luogo, utilizzando Alexa555 con beta-mercaptoetanolo 143 mM, 50 mM MEA e un ossigeno lo scavenging sistema, fluorophores potrebbe non essere pompato al loro stato scuro e quindi non essere ben spazialmente separati (troppo elevato duty cycle, cioè la frazione di tempo nello stato "on" è troppo lungo) (Figura 4B). Infine, utilizzando Alexa568, con 143 mM beta-mercaptoetanolo, 50mm MEA e un ossigeno lo scavenging sistema, fluorophores non erano luminose e sono stati lampeggiante lentamente con molto lungo "su" e "off" afferma (ciclo di lavoro numero e troppo alto basso fotone) (Figura 4). In tutte queste condizioni non ottimali, la rete dei microtubuli è stata scarsamente generata le immagini di Super-risoluzione. In conclusione, le condizioni ottimali richiedono fluorofori con numero di fotoni ad alta e basso fattore di servizio9,10 nel buffer immagini corrispondenti. Si noti che ottimizzazione etichettatura densità e condizioni di buffer per ottenere buone condizioni lampeggiante di imaging è una procedura standard per dual-color dSTORM e non è specifico per formazione immagine se-microtubule.
Secondo il teorema di Nyquist-Shannon, è necessario disporre di fluorofori almeno ogni 10 nm per avere una risoluzione di 20 nm. Esteso alle strutture 2D, Dempsey et al stimato che un'etichettatura di fluorofori4 ~ 10 a µm2 è necessaria. Come la rete se è più densa e suoi filamenti sono più sottili (10 nm vs 25 nm di diametro senza gli anticorpi primari e secondari) rispetto alla rete dei microtubuli, abbiamo osservato che due volte più localizzazioni sono necessari per descrivere la rete di se. Abbiamo ottenuto buone immagini con 5 000 localizzazioni/µm2 per se e 2500 localizzazioni/µm² per i microtubuli, ottenuti con cornici di 40 000 e 20 000 rispettivamente. L'immagine ad alta risoluzione è stata ottenuta con una precisione di localizzazione di σSMLM ~ 8-12 nm stimato a seguito di passaggio 8 del protocollo (precisione di puntamento di una singola molecola localizzata in tempi diversi punti22). Questa stima della precisione di localizzazione era in buon accordo con i valori forniti dal software del produttore indicato in un istogramma delle precisioni di localizzazione estratte da tutte le molecole rilevate nei dati grezzi (esempio illustrato nella Figura 1). Tale precisione di localizzazione potrebbe fornire un'immagine con una risoluzione di ~ 30 nm (2,35 * Precisione) se la densità di etichettatura è abbastanza alta. Abbiamo osservato ordinariamente il vimentin filamento con una larghezza piena a metà massimo (FWMH) di ~ 40 nm e microtubuli con una larghezza FWMH di ~ 55 nm. Poiché la risoluzione dell'immagine dipende sia la precisione di localizzazione e la densità di localizzazione, forniamo condizioni sperimentali che consentono i migliori risultati tenendo conto di entrambi i criteri.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57087/57087fig1.jpg"> Figura 1 : Densità ottimale delle singole molecole durante la stima di precisione di acquisizione e localizzazione. (A-B) Sinistra: Rappresentante immagini raw da un singolo fotogramma con una densità ottima di singole molecole nello stato brillante (A) e con una densità troppo alta (B) durante l'acquisizione di tempesta (passo 6.12.) di celle fisse U373 macchiato con anti-vimentin e anti-topo Alexa647. Destra: Immagini RAW dove le singole molecole con livello di fluorescenza sopra l'intensità di picco alla soglia di rumore (impostato su 6) sono circondate da cerchi (bianco o rosso). Il diametro del cerchio è impostato per la dimensione di maschera di picco (insieme a 9 pixel) e il colore determina se le molecole si sovrappongono (rosso) o non (bianco). Si noti che ad alta densità di singole molecole (a (B)) conduce ad un'elevata quantità di molecole che non sono presi in considerazione per la ricostruzione di immagine tempesta di sovrapposizione. A Inset: grafico che mostra un profilo di intensità di fluorescenza tipica di una singola molecola in rosso e sua gaussiana fit in nero. In questo esempio, la precisione di localizzazione è σx = 6,7 nm. Barra della scala, 1 µm. istogramma tipico (C) di precisione di localizzazione per tutte le molecole rilevati e analizzati dal software del produttore. Esso può essere visualizzato e viene aggiornato regolarmente durante l'acquisizione dei dati grezzi grazie l'elaborazione online. Questo istogramma corrisponde all'immagine di dSTORM della rete dei microtubuli illustrata nella Figura 3B. (D) Sinistra: Immagine di tempesta di una singola molecola presenta sulla superficie del vetro dopo la ricostruzione. Destra: Istogrammi delle posizioni X e Y ottenuti dopo il montaggio gaussiana. Gaussiana raccordo le distribuzioni di X e Y darà una stima della precisione di localizzazione. <a href="/files/ftp_upload/57087/57087fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57087/57087fig2.jpg"> Figura 2 : Immagine rappresentante dSTORM di una rete di vimentin. immagine di dSTORM (A), corrispondente standard largo campo immagine (B) e (C) risultati all'avanguardia di una cellula di glial U373 fisso come descritto nel protocollo e macchiato per il vimentin con Alexa647 di sovrapposizione. Fondo: zoom della regione evidenziata. Profili di intensità trasversale (D) lungo la linea gialla sulle immagini ingrandite nella A e B. barra della scala, 2 µm e 500 nm nello zoom. <a href="/files/ftp_upload/57087/57087fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57087/57087fig3.jpg"> Figura 3 : Immagine dSTORM colori dual rappresentativi delle reti dei microtubuli e il vimentin. (A) il Vimentin rete macchiato con Alexa647 (stesso come in Figura 2A). (B) rete dei microtubuli etichettata con Alexa555. (C) sovrapposizione delle reti dei microtubuli (ciano) con un'area di zoom sulla destra e il vimentin (rosso). L'immagine di dSTORM di vimentina è stato ottenuto con ~1.5 milioni di localizzazioni fuori 40 000 fotogrammi. L'immagine di dSTORM dei microtubuli è stata ottenuta con localizzazioni ~ 850 000 fuori 20 000 fotogrammi. Barra della scala, 2 µm e 500 nm nello zoom. <a href="/files/ftp_upload/57087/57087fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57087/57087fig4.jpg"> Figura 4 : Esempi di condizioni non ottimali di formazione immagine dei microtubuli. Quando i fluorophores lampeggia ma non sono abbastanza luminoso con un Alexa488 di etichettatura di tubulina nelle cellule gliali U373 e 143 mM BetaMercaptoethanol e organismo saprofago di ossigeno nel buffer di imaging (A), quando i fluorofori sono abbastanza brillanti, ma non possono essere correttamente impoverito nello stato scuro (presso la potenza del laser massima disponibile) e batter lentamente con Alexa555 etichettati tubulina in 143 mM BetaMercaptoethanol, 50mm MEA e buffer dell'organismo saprofago di ossigeno (B) e quando fluorofori lampeggiano lentamente e non sono brillanti utilizzando Alexa568 tubulina in un buffer di tempesta che contiene 143 mM BetaMercaptoethanol, 50mm MEA e organismo saprofago di ossigeno con l'etichetta (C). In tutti questi casi, le immagini di dSTORM hanno degradato ad alta risoluzione. Barra della scala, 2 µm. <a href="/files/ftp_upload/57087/57087fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57087/57087fig5.jpg"> Figura 5 : Immagine rappresentativa dual-color dSTORM delle reti il vimentin e microtubuli di un cellulare U373 fisso con metanolo freddo per 5 min. (A) il Vimentin e (B) reti di microtubuli etichettato con Alexa647 e Alexa555 rispettivamente con zoom evidenziata. Si noti la presenza di singole molecole nella parte anteriore delle cellule localizzate nel citoplasma diminuendo la risoluzione globale delle reti del filamento. Barra della scala, 2 µm e 500 nm nello zoom. <a href="/files/ftp_upload/57087/57087fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57087/57087fig6.jpg"> Figura 6 : Confronto di dSTORM ricostruite immagini Immagine di dSTORM ricostruito dal produttore software (A) e temporale (FiJi plugin) (B). (C) sovrapposizione di (A) a magenta e (B) in verde. Barra della scala, 2 µm e 500 nm nello zoom. <a href="/files/ftp_upload/57087/57087fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

I filamenti intermedi e microtubuli con microscopia di ricostruzione ottico stocastico diretto 2-dimensionale di imaging

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di dare le condizioni sperimentali ottimali dalla preparazione del campione per acquisizione di immagini e la ricostruzione al fine di eseguire immagini dSTORM 2D doppio colore dei microtubuli e filamenti intermedi in celle fisse

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

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Nanyang Technological University

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Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Imaging diretta di calcio ER con Targeted-esterasi Induced Loading Dye (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem congelamento ad alta pressione e congelamento rapido Sostituzione di tessuti vegetali per la microscopia elettronica a trasmissione

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Tridimensionale Super Resolution Microscopia di filamenti di F-actina da interferometrico fotoattivati ​​localizzazione Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...