Questo lavoro è stato supportato in parte dal progetto per lo sviluppo di ricerche Innovative sulle terapeutica del cancro (P-DIRECT) (15cm0106102h0002, K.M.) e il progetto per la ricerca sul cancro e l'evoluzione terapeutica (P-creare) (16cm 01061150001, K.M.) dal Giappone Agenzia per la ricerca medica e sviluppo, AMED; la Fondazione di scienza di Takeda (Y.M.); Concessione della principessa Takamatsu Cancer Research Fund (13-24520, Y.M.); e pagine JSP KAKENHI Grant numero JP16K07133 (Y.M.).

1. reagente Setup
<ol><li>
Reagenti utilizzati per la sincronizzazione delle cellule
	<ol>
<li>Per generare medio dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) contenente timidina 2,5 mM, sciogliere 30,28 mg di timidina per 1 mL di acqua di grado di coltura del tessuto per preparare timidina 125 mM. Filtrare la soluzione con un'unità di filtro di 0,22 μm siringa. Aggiungere 1 mL di timidina preparata 125 mM per 50 mL di DMEM completati con 10% (vol/vol) siero bovino fetale (FBS).</li>
		<li>Per generare DMEM contenente 0,1 μg/mL di nocodazole, sciogliere nocodazole in dimetilsolfossido (DMSO) per preparare 5 μg/μL nocodazole. Aggiungere 1 µ l di 5 µ g / µ l nocodazole per 50 mL di DMEM supplementato con 10% FBS (vol/vol).</li>
		<li>Per generare DMEM contenente 0,002% (vol/vol) di DMSO, aggiungere 1 µ l di DMSO per 50 mL di DMEM supplementato con 10% FBS (vol/vol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reagenti utilizzati per l'analisi di IP-RdRP
	<ol>
<li>Preparare il lysis buffer a: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) e 0,5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Conservare il reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare 5 x tampone acetato: 50 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acido (HEPES)-KOH (pH 7,8), acetato di potassio di 500 mM e 20 mM MgCl2. Conservare il reagente a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparare il tampone di lavaggio tampone 1: 1 x acetato, glicerolo al 10% (vol/vol), 0.1% (vol/vol) Triton x X-100 e 0.06 inibitore della proteasi cocktail, acido ethylenediamenetetraacetic (EDTA)-gratuito. Preparare il tampone di lavaggio 1 giorno di utilizzo o il giorno prima dell'uso. Conservare il reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare la soluzione AGC: 1x tampone acetato, 10% (vol/vol) glicerolo e 0,02% (wt/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonat (CHAPS). Conservare il reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Per generare la soluzione AGC contenente 2 mM CaCl2, aggiungere 100 µ l di 1 M CaCl2 per 50 mL di soluzione AGC. Conservare il reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Per generare la soluzione AGC contenente 3 mM etilene glicole a (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA), µ l 375 di 0,4 M EGTA (pH 7,5) per 50 mL di soluzione AGC. Conservare il reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare il tampone di lavaggio tampone 2: 1 x acetato e CHAPS 0,02% (wt/vol). Conservare il reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare soluzione HMD: 0,2 M HEPES-KOH (pH 7,8), 40 mM MgCl2 e 2 mM dithiothreitol (DTT). Conservare il reagente a-20 ° C. Nota: La soluzione HMD dovrebbe essere rinnovato almeno in tre mesi.</li>
		<li>Preparare 2 x buffer di proteinasi K: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM EDTA e 1% (wt/vol) sodio dodecil solfato (SDS). Conservare il reagente a-20 ° C.</li>
		<li>Preparare 2 x buffer di caricamento: formammide 95% (vol/vol), 20 mM EDTA e 1% (wt/vol) arancio G. conservare il reagente a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione delle cellule HeLa
Nota: Preparare cellule HeLa sincronizzate in fase mitotica (manipolato) o dividendo in modo asincrono (unmanipulated). Cultura delle cellule in presenza di 5% CO2 a 37 ° C.
<ol><li>
Sincronizzazione delle cellule HeLa in mitosi
	<ol>
<li>Piastra di 1 x 106 delle cellule HeLa con 10 mL di DMEM supplementato con 10% FBS in una piastra di coltura di 10cm (vol/vol).</li>
		<li>Due giorni dopo il placcaggio, sostituire il mezzo con 10 mL di DMEM contenente timidina 2,5 mM e 10% FBS (vol/vol). Coltura delle cellule per 24 h.</li>
		<li>Lavare le cellule tre volte con 10 mL di tampone fosfato salino (PBS) (-) e la cultura delle cellule con 10 mL di DMEM contenente 10% (vol/vol) FBS per 6 h.</li>
		<li>Sostituire il mezzo con 10 mL di DMEM contenente 0,1 µ g/mL di nocodazole e 10% (vol/vol) FBS e cultura le cellule per 14 h.</li>
		<li>Agitare delicatamente la piastra di coltura e recuperare il surnatante contenente le cellule mitotiche indipendente. Contare il numero di cellulare per il dosaggio di IP-RdRP.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 490 x g per 5 min a 4 ° C e scartare il surnatante. Nota: Il pellet cellulare possa essere conservato a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione delle cellule HeLa unmanipulated
	<ol>
<li>Piastra di 1 x 106 delle cellule HeLa con 10 mL di DMEM supplementato con 10% FBS in una piastra di coltura di 10cm (vol/vol).</li>
		<li>Due giorni dopo il placcaggio, sostituire il mezzo con 10 mL di DMEM contenente 10% FBS (vol/vol). Coltura delle cellule per 30 h.</li>
		<li>Sostituire il mezzo con 10 mL di DMEM contenente 0,002% (vol/vol) DMSO e 10% (vol/vol) FBS e cultura le cellule per 14 h.</li>
		<li>Raccogliere le cellule di trypsinization utilizzando 0,7 mL di tripsina (2,5 g/L) contenente EDTA da 1 millimetro. Contare il numero di cellulare per il dosaggio di IP-RdRP.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 490 x g per 5 min a 4 ° C e scartare il surnatante. Nota: Il pellet cellulare possa essere conservato a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. IP-RdRP Assay
<ol><li>Preparazione della proteina A-agarosio perlina
	<ol>
<li>Trasferire 1 mL (letto volume 500 µ l) di resina di affinità in una microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare a 800 x g per 5 min a 4 ° C e scartare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 800 µ l di tampone di lisi ai talloni e mescolare bene capovolgendo la provetta diverse volte. Centrifugare a 800 x g per 3 min a 4 ° C e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio due volte (totale tre lavaggi).</li>
		<li>Aggiungere 800 µ l di tampone di lisi ai talloni, mescolare bene capovolgendo la provetta diverse volte. Ruotare il tubo durante la notte (o per almeno 4 ore) a 4 ° C in un agitatore rotativo.</li>
		<li>Centrifugare la provetta a 800 x g per 3 min a 4 ° C e scartare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di tampone di lisi ai talloni e mescolare bene capovolgendo la provetta diverse volte. Memorizzare le perline a 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del lysate delle cellule
	<ol>
<li>(Opzionale) Se le celle sono bloccate nel passaggio 2, posizionare e scongelare le cellule congelate su ghiaccio fino a quando le cellule si allentano.</li>
		<li>Lavare le cellule una volta con 10 mL di PBS (-). Centrifugare il campione a 1.450 x g per 5 min a 4 ° C e scartare il surnatante.</li>
		<li>Lisare le cellule con buffer di lisi ghiacciata (un 1 mL di tampone di lisi A 1 x 107 delle cellule) pipettando delicato.</li>
		<li>Sottoporre ad ultrasuoni il campione in una provetta da 1,5 mL con seguenti condizioni; impostare l'amplificazione del sonicatore al 25% e trattare con ultrasuoni per 10 s.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 20.400 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Raccogliere il surnatante. Trasferire 1 mL ciascuno del surnatante in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Attenzione: Eseguire tutte le procedure in condizioni di RNAsi-libera.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunoprecipitazione
	<ol>
<li>Pre-deselezionare il lisato dal punto 3.2.6 aggiungendo 40 µ l (tallone volume 20 µ l) di perline A-agarosio proteina lavata per 1 mL di lisato. Mescolare bene capovolgendo la provetta diverse volte e ruotare il campione per 30 min a 4 ° C.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 13.000 x g per 1 min a 4 ° C e recuperare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 40 µ l (letto 20 µ l) di proteina lavata A-agarosio perline e 10 µ g di anticorpo anti-umano TERT (clone: 10E9-2)8 in pre-sgomberati lisato. Mescolare bene capovolgendo la provetta diverse volte e ruotare il campione a 4 ° C durante la notte.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 3.300 x g per 0,5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Lavare le perle con tampone di lavaggio 1: aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio 1 ai talloni, mescolare bene capovolgendo la provetta e ruotare il campione per 5 min a 4 ° C. Centrifugare il campione a 3.300 x g per 0,5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio altre tre volte.</li>
		<li>Lavare le perle di una volta con soluzione AGC contenente 2 mM CaCl2: aggiungere 1 mL di soluzione AGC contenente 2 mM CaCl2 ai talloni, mescolare bene capovolgendo la provetta e ruotare il campione per 5 min a 4 ° C. Centrifugare il campione a 3.300 x g per 0,5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Trattare le perline con nucleasi di Micrococcal (MNase): preparare la miscela di reazione MNase descritta nella tabella 1. Risospendere le sfere in 60 µ l della miscela di reazione MNase pipettando delicato. Agitare il campione delicatamente (20-25 giri/min) su una piattaforma girevole di un agitatore per impostare in un'incubatrice di Peltier-tipo per 15 min a 25 ° C. Nota: È molto importante utilizzare un agitatore ondulato e seguire rigorosamente il limite di velocità in questo passaggio. Altro tipo di Scuotipaglia, quali mixer rotante, non sono raccomandati.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 3.300 x g per 0,5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Lavare le perle due volte con soluzione AGC contenente 3 mM EGTA: aggiungere 1 mL di soluzione AGC contenente 3 mM EGTA ai talloni, mescolare bene capovolgendo la provetta e ruotare il campione per 5 min a 4 ° C. Centrifugare il campione a 3.300 x g per 0,5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio una volta.</li>
		<li>Lavare le perle una volta con tampone di lavaggio 2: aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio 2ai talloni, mescolare bene capovolgendo la provetta e ruotare il campione per 5 min a 4 ° C. Centrifugare il campione a 3.300 x g per 0,5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Mantenere le perline sul ghiaccio durante l'impostazione RdRP reazione. Attenzione: Eseguire tutte le procedure in condizioni di RNAsi-libera.</li>
	</ol></li>
	<li>RdRP reazione
	<ol>
<li>Preparare una miscela di reazione RdRP in un nuovo tubo come descritto nella tabella 2.</li>
		<li>6 µ l di [α -32P] UTP (3.000 IC/mmol) per la miscela e mescolare bene di pipettaggio. Nota: ATP [α -32P], [α -32P] CTP o GTP [α -32P] può essere utilizzato per la reazione anziché [α -32P] UTP.</li>
		<li>Aggiungere 1 µ l di modello RNA (1 µ g / µ l) per la miscela e mescolare bene di pipettaggio. Nota: Per stabilire il dosaggio RdRP, è consigliato il seguente modello di RNA: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.</li>
		<li>Risospendere le perline con 20 µ l di miscela di reazione RdRP dal punto 3.4.3 pipettando.</li>
		<li>Agitare il campione delicatamente (20-25 giri/min) su una piattaforma girevole di un agitatore per impostare in un'incubatrice di peltier-tipo per 2 h a 32 ° C.</li>
		<li>Aggiungere la miscela di reazione 5,4 µ l di proteinasi K (20 mg/mL) e 45,4 µ l di tampone di proteinasi K x 2. Mescolare pipettando e agitare (20-25 giri) il campione su un giradischi impostato in un'incubatrice di Peltier-tipo per 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 109,2 µ l di acqua RNAsi-libera al campione.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di acido fenolo-cloroformio nell'esempio. Mescolare bene dal vortice e poi Centrifugare il campione a 21.100 x g per 5 min a temperatura ambiente. Trasferire la fase acquosa ad un nuovo tubo. Ripetere questo passaggio una volta.</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l di acetato di sodio 3 M (pH = 5.2), 4 µ l di vettore di precipitazione e 250 µ l di etanolo alla fase acquosa. Agitare il tubo bene per miscelazione, poi Centrifugare il campione a 21.100 x g per 20 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
		<li>Lavare la pallina con 300 µ l di etanolo freddo (vol/vol) di 70% conservato a-20 ° C. Centrifugare il campione a 21.100 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Scartare il surnatante e asciugare il pellet. Attenzione: Eseguire tutte le procedure in condizioni di RNAsi-libera. Nota: Il pellet dal passaggio 3.4.11 può essere memorizzato a-20 ° C per almeno 2 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Trattamento di RNAsi
	<ol>
<li>Risospendere il pellet da passo 3.4.11 in 20 µ l di acqua RNAsi-libera.</li>
		<li>Preparare una miscela di reazione di RNAsi in un nuovo tubo come descritto nella tabella 3.</li>
		<li>Aggiungere 180 µ l della miscela di reazione RNasi al campione e incubare la provetta per 2 ore a 37 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 2,3 µ l di 10% (vol/vol) SDS al campione e incubare per 15 min a 37 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 2 µ l di proteinasi K (20 mg/mL) al campione e incubare per 15 min a 37 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 205 µ l di acido fenolo-cloroformio nell'esempio. Mix ben Vortex, poi Centrifugare il campione a 21.100 x g per 5 min a temperatura ambiente. Trasferire la fase acquosa ad un nuovo tubo.</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l di acetato di sodio 3 M (pH 5.2), 4 µ l di vettore di precipitazione e 250 µ l di etanolo alla fase acquosa. Agitare il tubo bene per miscelazione, poi Centrifugare il campione a 21.100 x g per 20 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
		<li>Lavare la pallina con 300 µ l di etanolo freddo (vol/vol) di 70% conservato a-20 ° C. Centrifugare il campione a 21.100 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Scartare il surnatante e asciugare il pellet. Nota: Il pellet dal punto 3.5.9 può essere memorizzato a-20 ° C per almeno 2 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Autoradiografia e l'elettroforesi del gel
	<ol>
<li>Risospendere il campione con 20 µ l di acqua RNAsi-libera.</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l di 2x buffer di caricamento.</li>
		<li>Bollire il campione per 10 min a 95 ° C. Schiacciare il campione sul ghiaccio.</li>
		<li>Esegua il gel. Nel caso in cui la dimensione del modello è 34 nts (Vedi anche punto 3.4.3), gel di poliacrilammide 7 M Urea - 10% viene utilizzato per denaturare elettroforesi del gel.</li>
		<li>Asciugare il gel con un gel asciuga.</li>
		<li>Esporre la pellicola direttamente sul gel di secchi all'interno di una cassetta radiografica con uno schermo d'intensificazione a-80 ° C.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Martinez, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+and+extra-telomeric+roles+for+telomerase+and+the+telomere-binding+proteins.">Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins.</a> Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).</li><li>Nakamura, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+catalytic+subunit+homologs+from+fission+yeast+and+human.">Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.</a> Science. 277 (5328), 955-959 (1997).</li><li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).</li><li>Salgado, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+an+RNAi+polymerase+links+RNA+silencing+and+transcription.">The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription.</a> PLoS Biol. 4 (12), e434 (2006).</li><li>Castel, S. E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+the+nucleus:+roles+for+small+RNAs+in+transcription,+epigenetics+and+beyond.">RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond.</a> Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).</li><li>Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+RNA+polymerase+is+an+essential+component+of+a+self-enforcing+loop+coupling+heterochromatin+assembly+to+siRNA+production.">RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).</li><li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-dependent+RNA+polymerase+formed+by+TERT+and+the+RMRP+RNA.">An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA.</a> Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).</li><li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+telomerase+reverse+transcriptase+in+heterochromatin+maintenance.">Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance.</a> Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).</li><li>Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+RNA+Synthesis+by+RNA-Dependent+RNA+Polymerase+Activity+of+Telomerase+Reverse+Transcriptase.">De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase.</a> Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).</li><li>Okamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+tumor+initiating+cells+of+defined+genetic+composition+by+nucleostemin.">Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).</li><li>van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+viral+RNA-dependent+RNA+polymerization.">Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il dosaggio di IP-RdRP è un metodo sensibile per rilevare attività RdRP di TERT umano. Proteina TERT è altamente espressa in cellule HeLa mitotiche, in cui TERT forma il RdRP complesso8,9,10. Ciò suggerisce che mitotiche cellule HeLa sono un materiale ottimo per rilevare attività RdRP. Nel protocollo descritto in precedenza, mitotiche e non sincronizzate le cellule HeLa sono incluse come un positivo e un esempio negativo, rispettivamente. Come mostrato in Figura 1A, RdRP dosaggio prodotti dal modello consigliato RNA in cellule HeLa mitotic Visualizza ampi segnali radioattivi tra 20 a 30 nt. Oltre alle cellule HeLa, abbiamo effettuato il test con diversi tipi di linee cellulari e trovato che il pattern di segnale può essere cambiato in cellulari diversi tipi9: alcuni mostrano un forte segnale solo circa 30 nt, alcuni mostrano un modello simile con cellule HeLa. Abbiamo anche avere eseguito l'analisi con modelli di RNA diversi da 34 nt modello8, breve e lungo (~ 300 nt) RNA con varie sequenze e con successo RdRP prodotti ottenuti da tali modelli anche se ci può essere qualche preferenza. Per la prima prova, tuttavia, si consiglia di utilizzare cellule HeLa in fase mitotica e il modello nt RNA 34. RdRPs può generare RNA double-stranded in un primer-dipendente e in un modo primer-independent11. Abbiamo segnalato che TERT conserva questa proprietà come umano RdRP7,9; TERT sintetizza dsRNA da un modello di RNA con 3'-foldback struttura attraverso un meccanismo di back-adescamento7. Per il modello nt RNA 34, TERT sintetizza fili complementari senza l'utilizzo di primer9. Per rilevare in modo specifico RdRP prodotti sintetizzati in modo indipendente dal primer, cioè de novo sintetizzato RNA prodotti, [α -32P] NTP può essere sostituito con [γ -32P] NTP nel RdRP reazione9.
MNase trattamento di immunocomplessi TERT su perline è un passaggio fondamentale per ottenere i risultati desiderati. Se il trattamento di MNase viene eseguito troppo a lungo o con intensa agitazione, si ridurrebbero notevolmente i prodotti RdRP. Per evitare tali problemi, si consiglia di seguire rigorosamente il protocollo attentamente. Soluzione HMD è un altro fattore critico per il successo. Se trovate che i segnali sono molto deboli, sostituire la soluzione HMD a uno appena preparato.
In tutto il protocollo, uno dovrebbe prendere molta cura per evitare la contaminazione RNasi. Ribonucleasi trattamento dovrebbero essere realizzate con apparecchiature dedicate. Dopo la manipolazione la ribonucleasi, uno dovrebbe eliminare i puntali e tubi con RNAsi immediatamente, eliminano RNasi con soluzioni specializzate (ad es. RNasi tranquilla) e cambiare groves.
TERT interagisce con non solo TERC ma anche molti tipi di RNA endogeni, e abbiamo segnalato parte di loro7. Modifica nell'analisi della IP-RdRP, ad esempio, il saggio di IP-RdRP senza trattamento MNase, fornirà la lista completa di modelli di RNA endogeni per RdRP TERT-collegata attività e bioinformatica guida sulle loro caratteristiche di sequenza. Abbiamo applicato con successo questo protocollo al tessuto lisato. Perché TERT è espresso in una varietà di tessuti normali e tumorali, questo test potrebbe essere utile per studiare la funzione enzimatica non canonico di TERT in essere umano.

Trascrittasi inversa umana del telomerase (TERT) è ben nota come la subunità catalitica della telomerasi e allunga del telomero utilizzando il componente di RNA telomerasi (TERC), il RNA specifico modello1. Anche se TERT polimerizza DNA telomerico come componente della telomerasi, le analisi strutturali e filogenetiche indicano che TERT è strettamente correlata con virale polimerasi RNA-dipendente del RNA (RdRPs), nonché della trascrittasi inversa virale e condivide i domini con queste polimerasi2,3,4. RdRP è l'enzima che genera il filamento di RNA complementare a un modello di RNA. L'enzima è codificato non solo virus, ma anche in organismi di modello, come pianta, lievito e vite senza fine, e la sintesi del RNA double-stranded da RdRP contribuisce al silenziamento genico post-trascrizionale e post-trascrizionali in questi organismi5,6 . Anche se RdRP umano era scomparso da molto tempo, abbiamo trovato RdRP attività in TERT umano nel 20097.
Abbiamo in primo luogo confermato RdRP attività di TERT con proteina ricombinante7, poi stabilito un dosaggio sensibile in vitro per rilevare attività RdRP di endogeno TERT8. Qui, dimostriamo in vitro RdRP test (IP-RdRP assay) per TERT endogeno. Questo metodo inizia con immunoprecipitazione (IP) di TERT endogeno e viene seguito da in vitro RdRP reazione, in cui ribonucleotidi radioattivi sono incorporati nei filamenti di RNA nascente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1082">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:464px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:155px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">044-29765</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin mixed solution</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>32777-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline (PBS(-))</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-23555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thymidine</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>07147-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>08904-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31333-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>35434-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>18321-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nonidet P-40 (NP-40)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>25223-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce Protein A Plus Agarose</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td align="right">22812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>17514-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium hydroxide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium acetate</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>28405-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>135-00165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>17045-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-21105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete, EDTA-free</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11 873 580 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>06731-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micrococcal nuclease (MNase)</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>2910A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>15214-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>07957-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14128-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">[a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEG507H</td>
			<td>Use fresh RI for the assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase inhibitor</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>SIN-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Takara</td>
			<td align="right">9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3 M Sodium acetate</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>316-90081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol (99.5)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14713-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dr. GenTLE Precipitation Carrier</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td align="right">9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase One Ribonuclease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>02873-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formamide, deionized</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>16345-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>15130-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Orange G</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>25401-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CO2 incubator</td>
			<td>e.g., ASTEC</td>
			<td>SCA-325DRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>e.g., TOMY</td>
			<td>EX-135</td>
			<td>For step B)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro refrigerated centrifuge</td>
			<td>e.g., KUBOTA</td>
			<td align="right">3740</td>
			<td>For step 6.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125</td>
			<td>Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro refrigerated centrifuge</td>
			<td>e.g., TOMY</td>
			<td>MX-305</td>
			<td>For step 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cooled incubator</td>
			<td>e.g., Panasonic</td>
			<td>MIR-154-PJ</td>
			<td>Set a rotary shaker inside</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rotary shaker</td>
			<td>e.g., TAITEC</td>
			<td>RT-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cooled incubator&#160;</td>
			<td>e.g., TAITEC</td>
			<td>BR-43FL</td>
			<td>Set a shaker &#8220;MINI WAVE&#8221; inside, for step 7.7</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MINI WAVE</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>WEV-03</td>
			<td>A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator</td>
			<td>e.g., TAITEC</td>
			<td>HB-80</td>
			<td>Set a shaker &#8220;MINI WAVE&#8221; inside, for step 8.5 and 8.6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Block incubator</td>
			<td>e.g., ASTEC</td>
			<td>BI-516S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-quantitative detection of rna-dependent rna polymerase activity of human telomerase reverse transcriptase protein

Trascrittasi inversa umana del telomerase (TERT) è la subunità catalitica della telomerasi e allunga telomeri attraverso attività DNA polimerasi RNA-dipendente. Anche se TERT viene definita come una trascrittasi inversa, analisi strutturale e filogenetiche del TERT dimostrano che TERT è un membro della polimerasi di mano destra e riguarda virale polimerasi RNA-dipendente del RNA (RdRPs) come pure della trascrittasi inversa virale. In primo luogo abbiamo identificato RdRP attività di TERT umana che genera RNA complementare stand a un modello di RNA non codificanti e contribuisce al RNA silencing in cellule tumorali. Per analizzare questa attività enzimatica non canonico, abbiamo sviluppato RdRP test con TERT ricombinante nel 2009, da allora in poi stabilito in vitro RdRP dosaggio per TERT endogeno. In questo manoscritto, descriviamo il metodo quest'ultimo. Brevemente, TERT complessi immuni sono isolati dalle cellule e incubati con modello RNA e rNTPs compresi rNTP radioattivo per RdRP reazione. Per eliminare singoli filamenti di RNA, prodotti di reazione sono trattati con RNAsi ho e i prodotti finali sono analizzati con elettroforesi su gel di poliacrilammide. Radiomarcato RdRP prodotti possono essere rilevati mediante autoradiografia dopo l'esposizione durante la notte.

Con il modello consigliato di RNA radioattivo RdRP prodotti sono osservati tra 20-30 nucleotidi (nt) specificamente in cellule HeLa in fase mitotica dopo l'esposizione durante la notte (Figura 1A). In genere, l'intensità del segnale dei prodotti RdRP dimostra due picchi che sono posizionati circa 25 nt e 30 nt in consonanza con la distribuzione delle dimensioni dei prodotti confermata dalla prossima generazione sequenziamento9. Contrariamente alle cellule mitotiche, cellule HeLa senza sincronizzazione dimostrano quasi assenza dei prodotti radioattivi 20 – 30 nt. Segnali ovali, che vengono posizionati sotto 20 nt in tutti i campioni, sono derive non specifici.
Nel caso che c'è solo un prodotto di nt ~ 30 con segnale debole in cellule HeLa mitotiche, indica che la reazione di RdRP non è andata bene. Ad esempio, se MNase trattamento avviene all'incirca e a sproposito, l'intensità del segnale in HeLa mitotica celle diminuisce significativamente (Figura 1B). RdRP reazione con vecchio HMD soluzione riduce inoltre i prodotti (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57021/57021fig1.jpg"> Figura 1 : Rappresentante RdRP prodotti di TERT endogeno in cellule HeLa mitotic. (A) tre risultati rappresentativi del dosaggio IP-RdRP in cellule HeLa trattati con nocodazole (manipolato) o DMSO (unmanipulated). Il 34 chimicamente sintetizzato nt RNA è stato utilizzato come modello. (B) analisi IP-RdRP in cellule HeLa mitotiche eseguita con il trattamento inadeguato di MNase. (C) test IP-RdRP in cellule HeLa mitotiche eseguita con soluzione HMD fresca o vecchia. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57021/57021fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenti</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nucleasi di micrococcal, 20 U / µ l</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nucleasi di micrococcal Buffer, 10x</td>
			<td>8 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua RNAsi-libera</td>
			<td>Μ L 51</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Componente MNase reazione mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenti</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>SCREPOLATURE, 0,07% (wt/vol)</td>
			<td>6 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione HMD</td>
			<td>2 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>rATP, 80 mM</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>rGTP, 8 mM</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>rUTP, 0,4 mM</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>rCTP, 8 mM</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inibitore di RNasi, 40 U / µ l</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua RNAsi-libera</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Componente RdRP reazione mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenti</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNasi una ribonucleasi, 10 U / µ l</td>
			<td>0.2 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampone di reazione, 10x</td>
			<td>20 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua RNAsi-libera</td>
			<td>159,8 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: Componente ribonucleasi reazione mix.

Watch this Scientific Journal Video about Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein at JoVE.com

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Rilevamento semi-quantitativa dell'attività della RNA polimerasi RNA-dipendente della proteina di Human Telomerase Reverse Transcriptase

Trascrittasi inversa umana del telomerase (TERT) sintetizza non solo DNA telomerico, ma anche RNA double-stranded attraverso attività RNA polimerasi RNA-dipendente. Qui, descriviamo un neocostituita dosaggio per rilevare attività RNA polimerasi RNA-dipendente di TERT endogeno.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

semi-quantitative-detection-rna-dependent-rna-polymerase-activity

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

9.7K Views.  National Cancer Center Research Institute. Trascrittasi inversa umana del telomerase (TERT) sintetizza non solo DNA telomerico, ma anche RNA double-stranded attraverso attività RNA polimerasi RNA-dipendente. Qui, descriviamo un neocostituita dosaggio per rilevare attività RNA polimerasi RNA-dipendente di TERT endogeno.

Video: Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing biosynthetic pathways. In this manuscript, the use of a highly effective system for the construction of multigene synthetic operons under the control of an inducible T7 RNA polymerase is described. This system allows many genes to be expressed simultaneously from one plasmid. Here, a set of four related vectors, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K, and pMGX-hisK, with either the ampicillin or kanamycin resistance selectable marker (A and K) and either possessing or lacking an N-terminal hexahistidine tag (his) are disclosed. Detailed protocols for the construction of synthetic operons using this vector system are provided along with the corresponding data, showing that a pMGX-based system containing five genes can be readily constructed and used to produce all five encoded proteins in Escherichia coli. This system and protocol enables researchers to routinely express complex multi-component modules and pathways in E. coli.

This study describes methods for the T7-mediated co-expression of multiple genes from a single plasmid in Escherichia coli using the pMGX plasmid system.

Inducibile T7 RNA Polymerase-mediato sistema di espressione multigene, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

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Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Rilevamento di eventi rari utilizzando la sequenza di RNA e DNA di correzione d'errore

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome editing, embryonic stem (ES) cell-based gene-targeting technology does not have these shortcomings and is widely used to modify animal/mouse genome ranging from large deletions/insertions to single nucleotide substitutions. Notably, identifying the relatively few homologous recombination (HR) events necessary to obtain desired ES clones is a key step, which demands accurate and reliable methods. Southern blotting and/or conventional PCR are often utilized for this purpose. Here, we describe the detailed procedures of using those two methods to identify HR events that occurred in mouse ES cells in which the endogenous Myh9 gene is intended to be disrupted and replaced by cDNAs encoding other nonmuscle myosin heavy chain IIs (NMHC IIs). The whole procedure of Southern blotting includes the construction of targeting vector(s), electroporation, drug selection, the expansion and storage of ES cells/clones, the preparation, digestion, and blotting of genomic DNA (gDNA), the hybridization and washing of probe(s), and a final step of autoradiography on the X-ray films. PCR can be performed directly with prepared and diluted gDNA. To obtain ideal results, the probes and restriction enzyme (RE) cutting sites for Southern blotting and the primers for PCR should be carefully planned. Though the execution of Southern blotting is time-consuming and labor-intensive and PCR results have false positives, the correct identification by Southern blotting and the rapid screening by PCR allow the sole or combined application of these methods described in this paper to be widely used and consulted by most labs in the identification of genotypes of ES cells and genetically modified animals.

Here, we present a detailed protocol for identifying homologous recombination events that occurred in mouse embryonic stem cells using Southern blotting and/or PCR. This method is exemplified by the generation of nonmuscle myosin II genetic replacement mouse models using traditional embryonic stem cell-based homologous recombination-mediated targeting technology.

Identificazione di eventi di ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali del Mouse mediante Southern Blotting e reazione a catena della polimerasi

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription polymerase chain reaction (nested RT-PCR) was developed to detect the conserved region of the nucleoprotein (N) gene of lyssaviruses. The method applies reverse transcription (RT) using viral RNA as template and oligo (dT)15 and random hexamers as primers to synthesize the viral complementary DNA (cDNA). Then, the viral cDNA is used as a template to amplify an 845 bp N gene fragment in first-round PCR using outer primers, followed by second-round nested PCR to amplify the final 371 bp fragment using inner primers. This method can detect different genetic clades of rabies viruses (RABV). The validation, using 9,624 brain specimens from eight domestic animal species in 10 years of clinical rabies diagnoses and surveillance in China, showed that the method has 100% sensitivity and 99.97% specificity in comparison with the direct fluorescent antibody test (FAT), the gold standard method recommended by the World Health Organization (WHO) and the World Organization for Animal Health (OIE). In addition, the method could also specifically amplify the targeted N gene fragment of 15 other approved and two novel lyssavirus species in the 10th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) as evaluated by a mimic detection of synthesized N gene plasmids of all lyssaviruses. The method provides a convenient alternative to FAT for rabies diagnosis and has been approved as a National Standard (GB/T36789-2018) of China.

A pan-lyssavirus nested reverse transcription polymerase chain reaction has been developed to detect specifically all known lyssaviruses. Validation using rabies brain samples of different animal species showed that this method has a sensitivity and specificity equivalent to the gold standard fluorescent antibody test and could be used for routine rabies diagnosis.

Valutazione di una reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa nidificata universale per la rilevazione di Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA polymerase II and co-transcriptional capping and splicing of the precursor RNA to form the mature mRNA. During mRNA synthesis, the RNA polymerase II elongation complex is a target for regulation by a large collection of transcription factors that control its catalytic activity, as well as the capping, splicing, and 3&#8217;-processing enzymes that create the mature mRNA. Because of the inherent complexity of mRNA synthesis, simpler experimental systems enabling isolation and investigation of its various co-transcriptional stages have great utility.
In this article, we describe one such simple experimental system suitable for investigating co-transcriptional RNA capping. This system relies on defined RNA polymerase II elongation complexes assembled from purified polymerase and artificial transcription bubbles. When immobilized via biotinylated DNA, these RNA polymerase II elongation complexes provide an easily manipulable tool for dissecting co-transcriptional RNA capping and mechanisms by which the elongation complex recruits and regulates capping enzyme during co-transcriptional RNA capping. We anticipate this system could be adapted for studying recruitment and/or assembly of proteins or protein complexes with roles in other stages of mRNA maturation coupled to the RNA polymerase II elongation complex.

Here, we describe the assembly of RNA polymerase II (Pol II) elongation complexes requiring only short synthetic DNA and RNA oligonucleotides and purified Pol II. These complexes are useful for studying mechanisms underlying co-transcriptional processing of transcripts associated with the Pol II elongation complex.

Complessi di allungamento dell'RNA artificiale Polymerase II per eventi di elaborazione dell'RNA co-trascrizione

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Un saggio per quantificare il legame proteino-RNA nei batteri

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

Analisi anticorp-free per l'analisi dell'attività di RNA methyltransferase

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...