Il metodo ritmo è stato sviluppato e ottimizzato da vari membri del gruppo di Dupree (Università di Cambridge, UK) nel corso degli anni, e apprezziamo tutti i loro contributi. Questo lavoro è stato finanziato nell'ambito del DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org) sostenuto da u. s. Department of Energy, Office of Science, ufficio di biologico e ricerca ambientale, attraverso contratto DE-AC02-05CH11231 tra Lawrence Berkeley National Laboratory e il u. s. Department of Energy. Ringraziamo anche Thea Pick e Vy Ngo per aiuto per preparare i campioni di csla9 .

1. raccolta di materiale vegetale <ol><li>raccolto materiale vegetale fresco (~ 20 mg) e immediatamente immergerlo in etanolo al 96% (v/v) e incubare a 70 ° C per 30 min; questo disattiva qualsiasi parete cellulare presenti enzimi degradativi. Per materiale secco, iniziare dal passaggio 2. 
	Attenzione: L'etanolo è infiammabile. 
	Nota: Una singola foglia di staminali o Rosetta fornirà abbastanza materiale per l'analisi. Tuttavia, meno errori derivano se una maggiore quantità di tessuto è riunite e analizzate dal momento che questo è più facile da pesare e gestire.</li>
	<li>Registrare accuratamente tessuto tipo e Stadio di sviluppo, come struttura di polisaccaride varia con entrambi. Ad esempio, con thaliana di Arabidopsis (usato qui), fase il tessuto secondo i metodi da Boyes et al. 15 Nota: nel presente protocollo, abbiamo usato la metà inferiore del fusto infiorescenza, dove il primo anemofila è completamente allungato ma non ingiallimento.</li></ol>
 2. residuo insolubile preparazione dell'alcool (aria) <ol><li>preparare aria, seguendo il metodo di Mortimer et al. 9 o un altro metodo simile, al fine di produrre una polvere priva di zuccheri solubili, come saccarosio e amido.</li>
</ol> 3. Aliquotare e pre-trattamento dell'aria Nota: l'esatta quantità di aria necessaria per ogni campione dipenderà (a) l'abbondanza di polisaccaride di interesse nel materiale e (b) la dimensione media degli oligosaccaridi rilasciato da il GH. Il metodo aggiunge una singola molecola fluorescente alla fine di ogni oligosaccaride, riducendo così il numero degli oligosaccaridi determina la sensibilità dell'esperimento. Indicativamente, per glucomannano in Arabidopsis staminali digerito con GH5/GH26 (come descritto), 500 µ g è consigliato 11, considerando che per xilano in Arabidopsis staminali digerito con GH11, 100 µ g è raccomandato come Mortimer &#39; Studio s 3. <ol><li>pesare aria (10-15 mg) in una provetta da centrifuga 15 mL e aggiungere H 2 O a una concentrazione finale di 2 mg/mL. Vortice per ottenere una sospensione anche. Se questo è problematico, quindi utilizzare un omogeneizzatore di vetro per aiutare questo processo.</li>
	<li>Aliquot 500 µ g in microfuge tubi. Asciugare le aliquote utilizzando una centrifuga vuoto (Vedi la Tabella materiali) durante la notte a 30 ° C.</li>
	<li>Pre-trattamento aria con 1 M NaOH (20 µ l) per 1 h a temperatura ambiente; questo de-acetila i polisaccaridi e gonfia le microfibrille di cellulosa, interrompendo la struttura di biomassa e consentendo l'accesso di GH. 
	Nota: Questo passaggio può essere ignorato per polisaccaridi purificati. ATTENZIONE &#8211; forte acido/base.
	<ol><li>Includono un'aliquota per un controllo di aria no-enzima (trattati allo stesso modo come tutti i campioni, eccetto il passaggio 4.1. è escluso).</li>
	</ol></li> <li>Aggiungere 200 µ l di H 2 O e 20 µ l 1 M HCl per neutralizzare. Prova che il pH è ~ 6-7 rimuovendo 1 µ l e spotting sulla carta nastri di indicatore di pH.</li>
	Tampone di acetato di ammonio 1 M di aggiungere 50 µ l di <li>, pH 6.0 (o qualunque pH è appropriato per il GHs utilizzato nello studio) e H 2 O per ottenere un volume totale di 500 µ l. 
	Nota: Acetato di ammonio è usato poiché esso sublima durante l'essiccazione, e quindi non aggiunge ulteriori sale al campione. Un eccesso di sale può portare a scarsa forma di banda e ad alta risoluzione sul gel ritmo.</li>
</ol> 4. Idrolisi dell'aria con Glycosyl Hydrolases (GHs) Nota: come accennato nella discussione, la purezza del GHs è critica. Utilizzare solo heterologously espressi, enzimi purificate per affinità. Al ricevimento di ogni lotto dal produttore, idrolizzano le aliquote definite di substrato (ad es., 500 µ g aria) con aumento della quantità di GH durante la notte (ad esempio, 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µ l) (3 unità / µ l). Quando c'è un eccesso di GH, l'impronta PACE avrà un aspetto identico. Un eccesso di enzima è necessario per fornire un risultato riproducibile perché deve essere certo che la reazione di idrolisi si sta avvicinando l'endpoint.
<ol><li>Aggiungi un importo predeterminato (Vedi sopra) di mannanases (GH5 e GH26 11) per le aliquote di aria nel buffer da passo 3.5, nonché un positivo controllo (30 µ g di glucomannano di konjac) e un controllo negativo no-aria (enzima mix in un tubo vuoto). Vortice e spin poi brevemente a raccogliere la miscela di reazione nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Incubare per una notte a 37 ° C (oppure la temperatura appropriata per il GH di scelta) con movimentazione delicata (~ 100 giri/min).</li>
	<li>Fermare la reazione incubando a 95 ° C per 20 min. 
	Nota: Le chiusure Cap possono essere utilizzate per sigillare tubi del microfuge flip-top.
	<ol><li>Centrifugare utilizzando un panca superiore microfuge alla massima velocità per 10 min e conservare il surnatante.</li>
	</ol></li> <li>Risospendere il pellet in 250 µ l di H 2 O, centrifuga come sopra e conservare il surnatante.</li>
	<li>Combinare entrambi i surnatanti e asciugare in una centrifuga vuoto (Vedi la Tabella materiali) a 30 ° C (~ 3 h o durante la notte senza riscaldamento).</li>
</ol> 5. Preparazione di standard di oligosaccaride <ol><li>magazzino di 1 mM di preparare soluzioni in H 2 O di mannosio (uomo), mannobiose (Man 2), mannotriose (Man 3), mannotetraose (Man 4), mannopentaose (Man 5) e mannohexaose (Man 6), tutti i β, 1-4 collegati. Aliquotare e conservare a-20 ° C fino a quando richiesto.</li>
	<li>Preparare 3 diverse concentrazioni di un uomo 1-6 miscela combinando 1 µ l (Standard S1), 2 µ l (S2) o 5 µ l (S3) di tutti e sei.</li>
	<li>Secco in una centrifuga vuoto (Vedi Tabella materiali) a 30 ° C (~ 1 h).</li>
</ol> 6. Derivitization di oligosaccaridi <ol><li>preparare una soluzione stock di 0,2 M formiche (acido 8-amminonaftalen-1,3,6-trisulfonic) in H 2 O: acido acetico 17:3. Brodo caldo a 60 ° C per sciogliere completamente il solido. Conservare a-20 ° C, al riparo dalla luce, per 2-3 mesi.</li>
	<li>Preparare una soluzione stock di 0,2 M di 2-Picolina borano (2-PB) in DMSO. Questo è estremamente igroscopico, quindi immediatamente risospendere tutta polvere al ricevimento in DMSO. Aliquotare e conservare a-20 ° C per 1-2 anni. Disgelare aliquote come richiesto (conservare a 4 ° C per 2 settimane e poi scartare).</li>
	<li>Preparare il tampone di derivatizzazione di H 2 O: acido acetico: DMSO alle 17:03:20.</li>
	<li>Per ogni campione, aggiungere 5 µ l di formiche, 5 µ l di 2-PB e 10 µ l di tampone di derivatizzazione. Spin brevemente per raccogliere sul fondo del tubo, vortice accuratamente e poi girare di nuovo brevemente. Vedere la Figura 1 per reazione descrizione.</li>
	<li>Incubare i campioni durante la notte a 37 ° C, al riparo dalla luce.</li>
	<li>Secco in una centrifuga vuoto (Vedi Tabella materiali) a 30 ° C (~ 2 h).</li>
	<li>Risospendere campioni e standard in 100 µ l 3 M urea. Conservare a-20 ° C, al riparo dalla luce fino a quando richiesto.</li>
</ol> 7. Preparazione del ritmo gel Nota: montaggio dell'attrezzatura di colata di gel dipenderà molto il marchio. Qui, abbiamo uSe un sistema di elettroforesi verticale (Vedi Tabella materiali), dotato di distanziali lastre di vetro di 18 x 24 cm e 1,5 mm.
<ol><li>Montare l'attrezzatura della colata gel per il produttore &#39; istruzioni s.</li>
	Buffer di ritmo di 10 x <li>make (1 M Tris-borato, pH 8.2) come segue: aggiungere 121,14 g di Tris-Base a ~ 400 mL di H 2 O e mescolare per sciogliere. Aggiustare il pH a 8.2 mediante aggiunta di acido borico solido (circa 60 g) e quindi rendere il volume fino a 1 L.</li>
	<li>Fare un 10% (p/v) di ammonio persolfato (APS) magazzino H 2 O. aliquota e memorizzare una volta alle aliquote di disgelo di-20 ° C., conservare a 4 ° C e scartare dopo 2 settimane.</li>
	<li>Fare e versare il gel di risoluzione. Per l'attrezzatura di cui sopra, 1 gel equivale a 50 mL. In una provetta da centrifuga 50 mL, mescolare H 2 O (20,2 mL), 5 mL di tampone per ritmo 10x, 24,6 mL 40% di acrilammide/Bis-acrilammide (29: 1 acrylamide:Bis). (Attenzione: tossici).
	<ol><li>Aggiungere 200 µ l di APS e 20 µ l di N, N, N, n-tetrametil-etilendiammina (TEMED). Invertire delicatamente per mescolare (per evitare di introdurre bolle d'aria). Versare il gel utilizzando un sierologici o altri pipetta di grande volume, a ~ 4 cm sotto la parte superiore delle lastre vetrate. Prestare attenzione alla possibilità di essere intrappolati nel gel le bolle d'aria. Se essi fare, smettere di versare e tilt/toccare il gel per liberarli.</li>
	</ol></li> <li>Il gel con isopropanolo (infiammabile cautela :) o, con attenzione, con H 2 O. Consenti gel per polimerizzare (20-30 minuti), poi versare lo strato superiore di overlay. Se è stato utilizzato isopropanolo, quindi lavare 2x con H 2 O. a secco liquido in eccesso con carta assorbente.</li>
	<li>Fare e versare il gel d'impilamento. Mix di 6,8 mL H 2 O, 1 mL di tampone di ritmo 10x, 2,8 mL acrilammide/Bis-acrilammide (Attenzione: tossici), 80 µ l APS e 8 µ l di TEMED in una provetta da centrifuga da 15 mL. Inverti per mescolare e overlay sopra gel polimerizzato di risoluzione. Inserire delicatamente pettini, evitando bolle d'aria intrappolamento sotto i denti del pettine.</li>
	<li>Consenti gel per polimerizzare (20-30 min.), avvolgere in tessuto umido e poi nella pellicola trasparente e conservare a 4 ° C fino a quando richiesto. Negozio con i pettini in luogo. 
	Nota: Ritmo gel possono essere memorizzati per un massimo di 2 settimane (anche se meno di una settimana è l'ideale), se sono mantenuti umidi.</li>
</ol> 8. In esecuzione di un ritmo Gel <ol><li>utilizzare un pennarello indelebile per etichettare le posizioni bene sul vetro, che aiuterà a tenere traccia di ordine di caricamento, e nell'individuare dove i pozzi sono una volta rimosso il pettine.</li>
	<li>Rimuovere il pettine. Riempire i pozzetti con buffer di ritmo di 1 x.</li>
	<li>Utilizzare un 10 µ l microsiringa per caricare 2 µ l di standard e campioni nei pozzetti. Evitare di utilizzare le corsie più esterne, che tendono a correre campioni poco.</li>
	<li>Montare la camera superiore dell'apparato gel-esecuzione e inserire il gel in un serbatoio in esecuzione raffreddato (~ 10 ° C) (° C 10) contenente 1 x ritmo tampone. Riempire la camera superiore con buffer di ritmo di 1 x.</li>
	<li>Accendere il potere ed eseguire il gel a 200 V (costante V) per 30 minuti e quindi aumento di tensione fino a 1000 V per 1h 40 min. Proteggere il gel dalla luce (ad esempio, eseguendo il wrapping serbatoi in sacchi neri della spazzatura). 
	Nota: Controllare i gel ~ 5 min dopo aver acceso la tensione e poi un altro 5 minuti dopo l'aumento della tensione fino a 1000 V. Se l'alimentatore è in grado di mantenere la tensione, poi c'è probabilmente un problema di buffer. Rimuovere il gel dal serbatoio. Rimontare l'alloggiamento superiore, verificare attentamente il posizionamento di tutte le guarnizioni. Un grande chip sul bordo superiore della lastra di vetro può impedire la piastra formando una buona tenuta con la guarnizione. Questo di solito può essere temporaneamente risolto aggiungendo una goccia di agarosio fuso 5% (p/v) per la parte scheggiata del vetro, prima di aggiungere l'alloggiamento superiore.</li>
</ol> 9. Visualizzazione di un gel di ritmo Nota: utilizzare un gel dotato di lungo-fluttuano UV bulbi nel transilluminatore e un filtro di emissione per la fotocamera che è adatto per il fluoroforo, qui 530 nm sistema di imaging. In alternativa, uno scanner laser può essere utilizzato anche, come descritto in Goubet 2.
<ol><li>Garantire il gel sistema di imaging è privo di polvere pulendo con tessuto umido privo di lanugine.</li>
	<li>Rimuovere il gel nel serbatoio di ritmo e mostra brevemente mentre il gel è ancora nelle lastre di vetro (&#60; 80 ms) per determinare se la parte anteriore della tintura è ancora sul gel.</li>
	<li>Aprire il gel utilizzando uno strumento di Cuneo e mentre il gel è ancora su un vetro piatto, utilizzare una taglierina della pizza per rimuovere sia il gel d'impilamento e, se la parte anteriore della tintura è ancora sul gel, il fondo del gel.</li>
	<li>Mettere ~ 5 mL H 2 O sulla superficie del transilluminatore e quindi trasferire il gel direttamente sul transilluminatore. Impostare il filtro UV 605 e accendere il transilluminatore UV longwave (Vedi Tabella materiali) utilizzando il software. 
	Nota: Il fluoroforo formiche qui utilizzato ha un'eccitazione/emissione di 353/520 nm.</li>
	<li>Prendere diverse immagini a diversi tempi di esposizione (per esempio, 100 ms a 10 s). Accertarsi che la luce UV è spento tra le immagini cliccando sul pulsante di luce UV (per disattivarlo) per evitare di degradare la fluorescenza. Non garantire che almeno 2 delle immagini bande saturi (il software di imaging di gel lo indicherà).</li>
	<li>Salva file come immagini ad alta-resolution.tif. 
	Nota: Immagini possono essere analizzati utilizzando il software fornito con il gel sistema di imaging, o utilizzando software di analisi di immagine liberamente disponibili, come ad esempio ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Vedere la sezione di risultati per una discussione di quantificazione.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

PACE è un metodo semplice per caratterizzare la struttura del polisaccaride. Può essere applicato a qualsiasi polisaccaride per cui sono noti GHs con attività caratterizzate, vedere numerosi esempi nella letteratura1,6,9,11. TT è stato applicato anche alla caratterizzazione di romanzo GHs12,13,18 e glicosiltrasferasi9, facendo uso di substrati definito polisaccaride e accettori.
Risultati riproducibili, interpretabili dipendono dai tre passaggi chiave. In primo luogo, il GHs utilizzato dovrebbe essere esente da contaminanti attività. Questo è il miglior ottenuta utilizzando solo heterologously espressi, purificate per affinità, enzimi. In secondo luogo, per la maggior parte degli esperimenti, è importante che l'idrolisi enzimatica dei substrati è al completamento. Questo farà sì che la stessa biomassa idrolizzata con il GH stesso dà la stessa impronta in ogni esperimento. Infine, ci dovrebbe essere un eccesso di fluoroforo nella reazione di derivatizzazione. Questo assicura che le estremità riducente disponibili siano etichettate al vicino al 100%. Questo si tradurrà in alta riproducibilità dei risultati, nonché i dati quantitativi.
Gel e reagente di qualità sono fondamentali per garantire dati riproducibili. Buffer di scarsa qualità, soprattutto del pH errato, aria bolle nel gel, e campioni con un eccesso di sale possono tutti fattore di risoluzione e ritenzione effetto di oligosaccaridi. Tuttavia, l'inclusione dei controlli consigliati descritti nella sezione protocollo e risultati permetteranno di risoluzione dei problemi.
RITMO è limitata dalla sua capacità di identificare gli oligosaccaridi. Per alcuni esperimenti, un'impronta digitale semplice è tutto ciò che è necessario. Tuttavia, per veramente quantificare la quantità di glucomannano in un campione di aria, ad esempio, l'identità di tutti gli oligosaccaridi rilasciati è richiesto, che è un processo che richiede tempo. Questo è più semplice per meno polisaccaridi complessi come xilano3. Poiché esistono pochi oligosaccaride standard disponibile in commercio, non essere sempre possibile o desiderabile per identificare tutte le bande. In questo caso, ritmo può fornire dati molto gratuiti alla spettrometria di massa (cioè, MALDI-CID9 o ESI-MS7e NMR6). Per questi metodi, è spesso utile fare una preparazione su larga scala, separare dalla cromatografia di esclusione dimensionale e quindi analizzare ciascuna frazione da entrambi PACE prima del MS o NMR. Mentre è stato segnalato che bande possono essere asportati e identificati dal MALDI-CID, in pratica abbiamo trovato che questo ha un basso tasso di successo (probabilmente a causa di interazioni di oligosaccaridi etichettati con il gel di acrilammide quando esposto ai raggi UV).
L'altra limitazione importante del ritmo è la velocità effettiva. Per ottenere una buona qualità, interpretabile gel con gli opportuni controlli, ogni gel avrà solo ~ 10 campioni sperimentali, e un ricercatore può aspettare eseguire ~ 4 ritmo gel al giorno. Recentemente, una versione del ritmo mediante elettroforesi capillare (CE) è stato sviluppato19, che permette la preparazione di campioni in piastre da 96 pozzetti. Esso è stato utilizzato con successo per caratterizzare le attività enzimatiche glycosyltransferase e polisaccaride strutture6,19, anche se richiede l'accesso a una macchina CE, che possa essere costosa da acquistare e mantenere.

Polisaccaride analisi mediante elettroforesi su gel (PACE) è un metodo per la caratterizzazione dettagliata di polisaccaridi1,2,3. Polisaccaridi di parete delle cellule vegetali sono notoriamente difficili da analizzare, e la maggior parte dei metodi richiedono attrezzature costose, operatori specializzati e grandi quantità di materiale purificato. Qui, descriviamo un semplice metodo per ottenere dettagliate informazioni strutturali polisaccaride, compresa la risoluzione di isomeri strutturali.
Comprensione pianta parete cellulare polisaccaride struttura è necessaria per quei ricercatori esplorare la biosintesi della parete cellulare di pianta o il ruolo della parete delle cellule vegetali in via di sviluppo di pianta. Recentemente, tuttavia, è diventato interessante per un più ampio gruppo di ricercatori a causa del fuoco sull'utilizzo di biomasse vegetali (essenzialmente la parete cellulare) come materia prima per produrre biocarburanti e prodotti biochimici4composizione parete cellulare vegetale. Ad esempio, efficiente saccarificazione enzimatica di questo materiale richiede una comprensione dettagliata delle strutture polisaccaride, affinché cocktail enzimatico ottimizzato può essere selezionato5.
PACE ha diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi che lo rendono ideale per l'analisi rapida di glycan complesse strutture. In primo luogo, non richiede purificazione del polisaccaride in questione, come è richiesto per la soluzione dello stato a risonanza magnetica nucleare (NMR)6. In secondo luogo, il ritmo può risolvere isomeri strutturali, a differenza di spettrometria di massa (MS, ad es., matrix-assistita laser desorption/ionization (MALDI) e ionizzazione electrospray (ESI)), che può anche essere difficile da eseguire mediante cromatografia liquida (LC) 7. in terzo luogo, il ritmo è molto sensibile, con risoluzione bassa-picomole, a differenza di cromatografia di strato sottile (TLC) o cromatografia su carta. Infine, non richiede costose attrezzature o specialista conoscenza, come è il caso per MS, NMR e LC.
Il metodo di ritmo si basa sulla specificità degli enzimi di glicosil idrolasi (GH), che prendono di mira alcuni legami glicosidici in una miscela di polisaccaridi. Quando l'enzima GH agisce sulla catena polisaccaride, rivela una riduzione fine che può quindi essere chimicamente derivatizzati, in questo caso con un'etichetta fluorescente. La mangiavano parte del campione è pertanto sottoposta a rendering non rilevabile da questo metodo. Gli oligosaccaridi con etichettati vengono quindi separati in un gel di acrilammide grande formato tramite l'elettroforesi. Questo dà un'eccellente risoluzione di molecole molto simili, ad esempio, i trisaccaridi Glc-uomo-uomo e uomo-Glc-Glc avrà un diverso Rf.
RITMO è stato usato estesamente per caratterizzare xilano diverse strutture attraverso pianta specie8, per identificare glycosyltransferase mutanti di Arabidopsis6,9,10,11 , per eseguire analisi di glycosyltransferase9e caratterizzare nuovi GH attività12,13. Abbiamo anche recentemente ha utilizzato per caratterizzare mannan della parete cellulare lievito (mensa e Mortimer, in preparazione). Qui descriviamo un metodo per la caratterizzazione di struttura della pianta parete cellulare glucomannano, basata su precedenti rapporti11,14.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Oligosaccaharide Standards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 3458-28-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannobiose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 14417-51-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannotriose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 28173-52-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannotetraose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 51327-76-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannopentaose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 70281-35-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannhexaose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 70281-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucomannan (Konjac; Low Viscosity)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-GLCML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other specialty chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid</td>
			<td>(Molecular probes) Thermo</td>
			<td>A350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-picoline borane</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specialty Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel casting kit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE660 kit</td>
			<td>18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling recirculating water bath&#160;</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>RCB20-plus 115v</td>
			<td>Needs to be able to maintain temperature at ~10 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G:Box Chemi XRQ Imaging System</td>
			<td>Syngene</td>
			<td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td>
			<td>Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Voltage Power Pack</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EC1000XL</td>
			<td>1000V&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge(Speedvac)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SPD131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Gel electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycosyl hydrolases</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging software ( Genesys)</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structural characterization of mannan cell wall polysaccharides in plants using pace

Polisaccaridi di parete delle cellule vegetali sono notoriamente difficili da analizzare, e la maggior parte dei metodi richiedono attrezzature costose, operatori specializzati e grandi quantità di materiale purificato. Qui, descriviamo un semplice metodo per ottenere dettagliate informazioni strutturali polisaccaride, compresa la risoluzione di isomeri strutturali. Analisi di polisaccaride tramite elettroforesi del gel (PACE), materiale della parete cellulare vegetale è idrolizzato con glicosil idrolasi specifici per il polisaccaride di interesse (ad esempio, mannanases per mannan). Gel di poliacrilammide di grande formato vengono quindi utilizzati per separare gli oligosaccaridi rilasciati, che sono stati etichettati fluorescente. Gel possono essere visualizzati con un gel modificato sistema di imaging (Vedi Tabella materiali). L'impronta di oligosaccaride risultante sia paragonabile qualitativamente o, con la replica, quantitativamente. Sollevatore e ramificazione informazioni può essere stabilite utilizzando ulteriori glicosil idrolasi (ad es., mannosidases e galactosidases). Mentre questo protocollo descrive un metodo per analizzare la struttura di glucomannano, può essere applicato a qualsiasi polisaccaride per cui esistono caratterizzato glicosil idrolasi. In alternativa, può essere utilizzato per caratterizzare nuovi glicosil idrolasi utilizzando substrati definito polisaccaride.

Qui vi mostriamo un gel di ritmo esempio eseguito per ogni protocollo, insieme alla descrizione di assistervi nell'interpretazione dei dati e risoluzione dei problemi, e questo è seguito da una guida generale per successo ritmo gel interpretazione13,16. Un gel rappresentativo di un ritmo standard è illustrato nella Figura 2analisi del contenuto di mannano parete cellulare ed è descritto lane di corsia.
Standard Corsie 1, 2 e 3 mostrano una scaletta di oligosaccaridi acquistati in commercio (Man1- Man6) a 5 (S1), 10 (S2) e 50 (S3) pmol concentrazione. Quando si riceve un nuovo lotto di un oligosaccaride commerciale, è importante controllare la purezza su un gel. Molti oligosaccaridi, particolarmente tetrasacccharides e più a lungo, può avere una contaminazione significativa con oligosaccaridi di altri gradi di polimerizzazione (DPs), come mostrato qui per Man6 (contrassegnati con *). Mentre la quantificazione di un gel, è importante avere almeno 3 concentrazioni degli standard, poiché è necessario per il calcolo della curva standard. Calcolo della curva standard può anche essere utile per garantire che la reazione di derivatizzazione è essenzialmente al completamento. Standard di concentrazioni note consentire confronti tra gel e un controllo utile per qualità di separazione e derivatizzazione.
Controllo positivo Corsia 4 Mostra una digestione mannanasi di glucomannano di konjac. Glucomannano di konjac è disponibile commercialmente, e mentre non ha la stessa struttura che, ad esempio, è trovato in Arabidopsis, serve a due scopi. In primo luogo, è un controllo importante per la digestione enzimatica. Il ricercatore deve stabilire che cosa un substrato commerciale digerito con loro GHs di scelta sembra quando digerito a completamento (cioè, un vasto eccesso di GH viene aggiunto alla reazione). Se in futuro esperimenti il modello cambia, questo può indicare sia una perdita di attività o contaminazione dello stock GH. In secondo luogo, serve come controllo per la reazione di derivatizzazione in presenza di sali di enzima e buffer. Se le norme sembrano buone, ma il controllo positivo è scarso, quindi questo potrebbe indicare che un componente della reazione di idrolisi è inibitorio per la derivatizzazione.
Wild type (WT) Arabidopsis gambo aria + mannanasi cocktail (GH5 + GH26) Lane 5 Mostra l'impronta di ritmo di uno stelo di Arabidopsis WT (confronta con riferimenti11,14).
csla9 Arabidopsis gambo aria + mannanasi cocktail (GH5 + GH26) Lane 6 Mostra l'impronta del ritmo dello stelo da un Arabidopsis pianta carente i principali spettacoli mannano sintasi11del gambo. Confrontare il WT e controllo negativo le impronte digitali. Mentre la maggior parte del mannan è assente in questa pianta, rimane una piccola quantità, come testimoniano le intensità di banda ridotto per tutti gli oligosaccaridi mannanasi-derivato questo è sintetizzato da ulteriori mannano sintasi (CSLA2, 3)11.
Controllo negativo - enzima solo Lane 8 mostra bande sul gel che non sono specifiche che derivano da contaminanti nella mannanasi cocktail e dovrebbero essere esclusi dall'analisi (contrassegnati con *).
Controllo negativo - WT aria solo Lane 9 Mostra bande sul gel che non sono specifici e devono essere esclusi dall'analisi (contrassegnati con *).
Controllo negativo- csla9 Aria solo Lane 10 Mostra bande sul gel che non sono specifici e devono essere esclusi dall'analisi (contrassegnati con *).
Pino legno aria + mannanasi cocktail (GH5 + GH26) Corsia 7 Mostra l'impronta di ritmo di legno di pino, che contiene galactoglucomannan. Questo ha chiaramente un diverso modello di oligosaccaridi rilasciati per Arabidopsis, grazie alla sua struttura diverso.
Controllo negativo - pino aria solo Lane 11 Mostra bande sul gel che non sono specifici e devono essere esclusi dall'analisi (contrassegnati con *).
Interpretare un gel di ritmo è relativamente semplice, ma richiede la consapevolezza dei seguenti punti. Per dati affidabile, si raccomanda di effettuare ritmo su almeno 3 indipendentemente coltivati biologica replica, e si consiglia di eseguire almeno 2 tecnici replicati su ogni replica biologico. I comandi descritti sono fondamentali per l'interpretazione, come fasce non specifiche devono essere escluse. Si consiglia inoltre di caricamento di campioni in un ordine diverso sui gel di replicare, per escludere effetti derivanti dall'illuminazione irregolare del transilluminatore. Accurata interpretazione richiede analisi delle fasce che non sono saturi. Poiché alcune impronte oligosaccaride possono contenere entrambi polisaccaridi abbondanza molto alta e bassa, si consiglia di analizzare le esposizioni multiple del gel stesso. Gli standard possono essere utilizzati per normalizzare tra immagini diverse.
Per alcuni tipi di esperimenti, può essere desiderabile per quantificare l'importo del polisaccaride nella preparazione aria. Mentre è possibile quantificare un gel di ritmo, richiede conoscenza dell'esatta identità molecolare di ogni oligosaccaride rilasciato dal GHs e dove si trova il ritmo gel. Questo attualmente non è completamente noto per mannan, ma è stato determinato per altri polisaccaridi ad esempio xilano3. Gli standard forniscono un modo di normalizzazione tra gel, anche quando non si esegue la quantificazione e così vi assisterà in ogni analisi semi-quantitativa o qualitativa.
Individuare la struttura di oligosaccaridi individuali può essere raggiunto utilizzando cocktail di GHs. sequenziale aggiunta di ulteriore GHs può rivelare informazioni dettagliate sui collegamenti e sostituzioni di oligosaccaridi rilasciati (per esempio, l'aggiunta di β - 1,4 - glucosidasi che agisce all'estremità non riducente rivelerà quali oligosaccaridi nella miscela contengono tale funzionalità). Enzimi disponibili includono galactosidases, glucuronidases e glucosidasi (Vedi il database di Chriss16 per ulteriori informazioni); vedere Hogg, d. et al. 17 come un esempio.
Il protocollo di cui sopra può essere utilizzato per caratterizzano l'attività del GHs sconosciuto. In questo caso, una biomassa definito, come Arabidopsis staminali o konjac glucomannan, dovrebbe essere utilizzato per schermata il GHs sconosciuto13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg"> 
Figura 1 : Questo Mostra lo schema per la derivatizzazione fluorescente di oligosaccaridi con formiche. Per l'ultima volta da Goubet2.<a href="//ecsource.jov href=""></a href="//ecsource.jov>e.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg"target = blank" &gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg"> 
Figura 2 : Gel rappresentante ritmo mostrando l'impronta di mannano da Arabidopsis, pino e un mutante di Arabidopsis (csla9) che ha alterato la biosintesi di mannano. AlR è idrolizzato con un cocktail di mannanasi, e gli oligosaccaridi rilasciati sono stati derivatizzati con un fluoroforo. Gli oligosaccaridi sono stati separati mediante elettroforesi in base a dimensione, forma e carica. Una scaletta di manno-oligosaccaridi (Man1-6) è indicata per aiutare a identificare la relativa mobilità di oligosaccaridi rilasciati, e un'idrolisi di mannano purificato (derivato da konjac) è indicata come controllo positivo. * = fasce non specifiche. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Un protocollo per l'analisi strutturale dei polisaccaridi mediante elettroforesi su gel (APCE), utilizzando mannano come esempio, è descritto.

Caratterizzazione strutturale di Mannan polisaccaridi di parete cellulare nelle piante usando passo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

structural-characterization-mannan-cell-wall-polysaccharides-plants

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K Views.  Joint BioEnergy Institute. Un protocollo per l'analisi strutturale dei polisaccaridi mediante elettroforesi su gel (APCE), utilizzando mannano come esempio, è descritto.

Video: Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in human pathology and other biochemical contexts. In order to perform characterization of protein deamidation, we have recently developed a novel long-length electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (LERLIC-MS/MS) method which can separate the glutamine (Gln) and asparagine (Asn) isoform products of deamidation from model compounds to highly complex biological samples. LERLIC-MS/MS is, therefore, the first shotgun proteomics strategy for the separation and quantification of Gln deamidation isoforms. We also demonstrate, as a novelty, that the sample processing protocol outlined here stabilizes the succinimide intermediate allowing its characterization by LERLIC-MS/MS. Application of LERLIC-MS/MS as shown in this video article can help to elucidate the currently unknown molecular arrays of protein deamidation. Additionally, LERLIC-MS/MS provides further understanding of the enzymatic reactions that encompass deamidation in distinct biological backgrounds.

Here we present a step-by-step protocol of the long-length electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (LERLIC-MS/MS) method. This is a novel methodology that enables for the first time quantification and characterization of the glutamine and asparagine deamidation isoforms by shotgun proteomics.

LERLIC-MS / MS per approfondita caratterizzazione e quantificazione di glutammina e asparagina deamidazione in Fucile Proteomics

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Biochimica

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

Caratterizzazione biochimica e strutturale del carboidrato trasporto substrato-proteina-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content is rather low in all organisms, amounting in plants to about 0.009% of dry weight. To date, one of the most accurate methods for measuring iron concentration in plant tissues is flame absorption atomic spectroscopy. However, this approach is time-consuming and expensive and requires specific equipment not commonly found in plant laboratories. Therefore, a simpler, yet accurate method that can be routinely used is needed. The colorimetric Prussian Blue method is regularly used for qualitative iron staining in animal and plant histological sections. In this study, we adapted the Prussian Blue method for quantitative measurements of iron in tobacco leaves. We validated the accuracy of this method using both atomic spectroscopy and Prussian Blue staining to measure iron content in the same samples and found a linear regression (R2 = 0.988) between the two procedures. We conclude that the Prussian Blue method for quantitative iron measurement in plant tissues is precise, simple, and inexpensive. However, the linear regression presented here may not be appropriate for other plant species, due to potential interactions between the sample and the reagent. Establishment of a regression curve is thus needed for different plant species.

We present a simple and reliable protocol for measuring iron content in plant tissues using the colorimetric Prussian Blue method.

Un metodo colorimetrico per la misurazione del ferro contenuto nelle piante

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Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

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This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

Privo di calibrazione In Vitro quantificazione delle proteine omo-oligomerizzazione utilizzando Strumentazione commerciale e libero, Open Source Software di analisi di luminosità

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Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and how the domains are oriented/positioned. Here, a protocol with the potential for elucidating which specific domains mediate interactions in multicomponent system through ab initio modeling is described. A method for calculating solution structures of macromolecules and their assemblies is provided that involves integrating data from small angle X-ray scattering (SAXS), chromatography, and atomic resolution structures together in a hybrid approach. A specific example is that of the complex of full-length nidogen-1, which assembles extracellular matrix proteins and forms an extended, curved nanostructure. One of its globular domains attaches to laminin &#947;-1, which structures the basement membrane. This provides a basis for determining accurate structures of flexible multidomain protein complexes and is enabled by synchrotron sources coupled with automation robotics and size exclusion chromatography systems. This combination allows rapid analysis in which multiple oligomeric states are separated just prior to SAXS data collection. The analysis yields information on the radius of gyration, particle dimension, molecular shape and interdomain pairing. The protocol for generating 3D models of complexes by fitting high-resolution structures of the component proteins is also given.

Here, we present how Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) can be utilized to obtain information on low-resolution envelopes representing the macromolecular structures. When used in conjunction with high-resolution structural techniques such as X-Ray Crystallography and Nuclear Magnetic Resonance, SAXS can provide detailed insights into multidomain proteins and macromolecular complexes in-solution.

Studi strutturali di macromolecole in soluzione con piccolo angolo x-ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for even the most challenging projects in structural biology. However, most facilities still require the presence of a scientist on site to perform the experiments. A new generation of automated beamlines dedicated to the fully automatic characterization of, and data collection from, crystals of biological macromolecules has recently been developed. These beamlines represent a new tool for structural biologists to screen the results of initial crystallization trials and/or the collection of large numbers of diffraction data sets, without users having to control the beamline themselves. Here we show how to set up an experiment for automatic screening and data collection, how an experiment is performed at the beamline, how the resulting data sets are processed, and how, when possible, the crystal structure of the biological macromolecule is solved.

Here, we describe how to use the automated screening and data collection options available at some synchrotron beamlines. Scientists send cryocooled samples to the synchrotron, and the diffraction properties are screened, the data sets are collected and processed and, where possible, a structure solution is carried out&#8212;all without human intervention.

Raccolta di dati dai cristalli delle macromolecole biologiche e completamente autonoma caratterizzazione

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

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This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination of the high-specificity separation technique IEX with the accurate molar mass analysis achieved by MALS allows the characterization of heterogeneous protein samples, including mixtures of oligomeric forms or protein populations, even with very similar molar masses. Therefore, IEX-MALS provides an additional level of protein characterization and is complementary to the standard size-exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) technique.
Here we describe a protocol for a basic IEX-MALS experiment and demonstrate this method on bovine serum albumin (BSA). IEX separates BSA to its oligomeric forms allowing a molar mass analysis by MALS of each individual form. Optimization of an IEX-MALS experiment is also presented and demonstrated on BSA, achieving excellent separation between BSA monomers and larger oligomers. IEX-MALS is a valuable technique for protein quality assessment since it provides both fine separation and molar mass determination of multiple protein species that exist in a sample.

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

This protocol describes the use of high-specificity ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering for an accurate molar mass determination of proteins, protein complexes, and peptides in a heterogeneous sample. This method is valuable for quality assessment, as well as for the characterization of native oligomers, charge variants, and mixed-protein samples.

Cromatografia a scambio ionico (IEX) accoppiata alla diffusione della luce multi-angolo (MALS) per la caratterizzazione e la separazione delle proteine

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

Caratterizzazione delle proteine mediante cromatografia di dimensioni-esclusione accoppiata alla dispersione luminosa multi-angolo (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These amyloid fibrils can sequester endogenous metastable proteins as well as components of the proteostasis network (PN) and thereby exacerbate protein misfolding in the cell. There are a limited number of tools available to assess the aggregation process of amyloid proteins within an animal. We present a protocol for fluorescence lifetime microscopy (FLIM) that allows monitoring as well as quantification of the amyloid fibrilization in specific cells, such as neurons, in a noninvasive manner and with the progression of aging and upon perturbation of the PN. FLIM is independent of the expression levels of the fluorophore and enables an analysis of the aggregation process without any further staining or bleaching. Fluorophores are quenched when they are in close vicinity of amyloid structures, which results in a decrease of the fluorescence lifetime. The quenching directly correlates with the aggregation of the amyloid protein. FLIM is a versatile technique that can be applied to compare the fibrilization process of different amyloid proteins, environmental stimuli, or genetic backgrounds in vivo in a non-invasive manner.

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Fluorescence lifetime imaging monitors, quantifies and distinguishes the aggregation tendencies of proteins in living, aging, and stressed C. elegans disease models.

Caratterizzazione delle strutture amiloidi nell'invecchiamento C. Elegans utilizzando Fluorescence Lifetime Imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...