Questo lavoro è supportato da ricerche di NIH (A1R03AI120027 (RN) e 1R21AI20012 (RN)), Grant di ricerca istituzionali (RN), Start-up concedere (RN) e seme di MD Anderson CIC concedere (RN).

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of Texas MD Anderson Cancer Center.
1. preparazione del Peptide per il vaccino
<ol><li>Sciogliere il peptide liofilizzato con tampone fosfato salino (PBS) alla concentrazione appropriata e vortexare per 30 s. Nota: Per hgp10025–33, la concentrazione finale è 1 mg/mL e per OVA257–264, la concentrazione finale è di 0,5 mg/mL. Ricostituire il peptide prima dell'iniezione. Non conservare dopo la ricostituzione.</li>
</ol>2. isolamento di Splenocytes dai topi transgenici
Nota: Isolamento delle cellule dalla milza deve essere eseguita in modo sterile.
<ol><li>
Eutanasia il topo transgenico di OT-1 utilizzando il metodo approvato di CO2 asfissia e rimuovere la milza. Nota: Mouse transgenico appropriato viene utilizzato in questo passaggio specifico per il peptide di scelta.<ol>
<li>Posare il mouse sul suo lato destro. Spruzzare il lato sinistro del mouse con 70% di etanolo (EtOH). Tirare la pelle usando il forcipe e tagliare la pelle utilizzando forbici chirurgiche; la milza sarà visibile all'interno della cavità peritoneale. Squartato delicatamente la cavità peritoneale per accedere la milza. Rimuovere la milza usando il forcipe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Disaggregare la milza inserendola in un filtro di 70 µm in una capsula di Petri con medium 2 mL A (PBS con 1% siero bovino fetale (FBS)) e fracassare la milza con l'estremità di un pistone.
	<ol>
<li>Raccogliere gli splenocytes dalla capsula di Petri e posto in una provetta conica da 50 mL. Lavare la capsula di Petri con 5 mL di terreno A due volte per raccogliere tutte le celle. Aggiungere il terreno A fino a 25 mL e centrifugare le cellule per 5 min a temperatura ambiente a 475 x g.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirare le cellule e risospendere in 1ml / al buffer di lisi di globuli rossi (RBC) della milza. Incubare a temperatura ambiente per 5 min, aggiungere 10 mL di medium A e centrifuga a temperatura ambiente a 475 x g. Risospendere il pellet in 10 mL di medium A e rimuovere detriti filtrando la sospensione cellulare attraverso un filtro di 70 µm in un pulito 50 mL conico.</li>
	<li>
Contare le celle utilizzando trypan blu e un emocitometro. Risospendere le cellule in PBS a una concentrazione finale di 106 - 1006 cellule/mL. Per gli ovuli257–264 specifiche uccidendo, risospendere a 106 cellule/mL e per hgp10025–33 specifico uccidendo, risospendere a 1006 cellule/mL.
	<ol>
<li>Giro le celle rimanenti a temperatura ambiente per 5 min a 475 x g. aspirare il supernatante e risospendere in 15 mL di PBS freddo per lavare le cellule. Ripetere il passaggio di lavaggio una volta di più. Spin, le celle a temperatura ambiente per 5 min a 475 x g. aspirare il supernatante e risospendere in PBS freddo secondo il volume finale determinato al punto 2.4.</li>
		<li>Trasferire la sospensione unicellulare a un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL e tenere il ghiaccio fino a iniezione nel destinatario del topo C57/BL6.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. iniezione di Splenocytes dai topi transgenici
<ol><li>Mouse di C57/BL6 destinatario posto in un dispositivo di ritenuta, dal lato dorsale. Area base coda di spruzzo iniezione con alcool isopropilico al 70%. Somministrare per via endovenosa 100 µ l di sospensione unicellulare (sezione 2) nella vena caudale utilizzando un ago da 27 G con il lato smussato rivolto verso l'alto.</li>
</ol>4. Covax amministrazione
Nota: Se le cellule vengono iniettate nel pomeriggio, covax deve essere somministrata la mattina seguente all'interno 18 h dell'iniezione di cellule.
<ol><li>Posizionare il mouse in una scatola chiara anestesia con isoflurano 1-3%. Dopo topi sono completamente anestetizzati, trasferire i topi per i coni di naso attaccati al collettore nella camera di anestesia. Tenere topi trattenuti con il lato dorsale fino. Nota: Amputate è confermata da un pizzico di breve punta per verificare che non è suscitata una risposta di ritiro. Legge federale limita isoflurano uso nell'ordine di un veterinario autorizzato.</li>
	<li>Area base coda di spruzzo iniezione con alcool isopropilico al 70%. Iniettare per via sottocutanea 100 µ l di soluzione di peptide (dalla sezione 1) utilizzando un ago da 27 G con la siringa penetrando 4-5 mm della regione base della coda, il lato di smussatura dell'ago rivolto verso l'alto. Nota: I topi sono vaccinati in un fianco con iniezione sottocutanea alla base della coda10.</li>
	<li>Iniettare 100 laterale di anticorpo (0,5 mg/mL di brodo) anti-CD40 µ l al sito di iniezione di vaccino.</li>
	<li>Applicare attentamente la crema del imiquimod 50 mg/mouse sui siti di vaccinazione. Strofinare la crema del imiquimod sulla superficie fino a quando la crema non è più visibile e viene completamente assorbita.</li>
	<li>Iniettare 100 µ l di proteina rhIL-2 100.000 IU/mL per via intraperitoneale (i.p.) alla regione addominale inferiore. Osservare, topi per 5 min dopo il loro recupero completamente dall'anestesia. Nota: Esperimento è in pausa a questo punto per 3 giorni.</li>
</ol>5. isolamento degli Splenocytes Target per l'etichettatura con CFSE
Nota: Isolamento delle cellule dalla milza deve essere eseguita in modo sterile.
<ol><li>Eutanasia i topi C57BL/6 secondo metodo approvato di asfissia2 CO. Rimuovere spleen(s) come descritto al punto 2.1.1. Disaggregare la milza e lavare gli splenocytes come nei passaggi 2.2.1 - 2.2.3. Lisare cellule di anima rosse come nei passaggi 2.3 - 2.3.2.</li>
	<li>Rimuovere le cellule per il conteggio utilizzando un emocitometro e calcolare per una concentrazione finale di cellule a 106 cellule/mL in soluzione CFSE-etichettatura (descritta nel passaggio 7). Spin rimanenti celle a temperatura per 5 min a 475 x aspirare il surnatante g..</li>
</ol>6. peptide pulsare dei Target Splenocytes
Nota: Peptide pulsare deve essere eseguita in modo sterile.
<ol><li>Risospendere le cellule a 106 cellule/mL in completa per i media (media di RPMI 1640 con 10% FBS, 1% L-Glutammina (L-Gln), 1% di penicillina/streptomicina (Pen/Strep)). Dividere le celle in 2 tubi (15ml coniche). Etichettare ogni provetta come pulsato o pulsati.</li>
	<li>
Aggiungere peptide nella provetta etichettata pulsata. Per gli ovuli257–264 pulsare, aggiungere 1 µ g/mL e per hgp10025–33 pulsare, aggiungere 2 µ g/mL. Nota: Le cellule pulsate subiscono la stessa incubazione delle cellule pulsata solo senza l'aggiunta del peptide.<ol>
<li>Incubare le cellule + peptide a 37 ° C per 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di completa per i media (media di RPMI 1640 con 10% FBS, 1% L-Glutammina (L-Gln), 1% di penicillina/streptomicina (Pen/Strep)) in ogni provetta per lavare entrambi pulsata e pulsati cellule bersaglio. Spin rimanenti celle a temperatura per 5 min a 475 x aspirare il surnatante g..</li>
</ol>7. preparazione di CFSE per etichettare gli Splenocytes Target
<ol><li>
Preparare la soluzione di etichettatura CFSE durante la cella di lavaggio nel passaggio 6.3; le cellule pulsate saranno etichettate come CFSECiao e i pulsati CFSElo. Preparare 1 mL di soluzione di CFSE-etichettatura per 106 cellule. Nota: CFSE è sensibile alla luce e deve essere protetto dalla luce a tutte le ore.<ol>
<li>Preparare CFSECiao -etichettatura media aggiungendo 1 uL/mL CFSE (soluzione 5 mM) per una concentrazione finale di 5 µM/mL in media RPMI 1640 con 2% FBS.</li>
		<li>Preparare CFSElo -etichettatura media aggiungendo 1 uL/mL CFSE (soluzione 0,5 mM) per una concentrazione finale di diluitore da 0,5 µM/mL RPMI 1640 con 2% FBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. etichettatura degli Splenocytes Target con CFSE
Nota: CFSE etichettatura deve essere eseguita in modo sterile.
<ol><li>Risospendere le cellule bersaglio pulsata e pulsati (dal punto 6.3) presso CFSE-etichettatura media di 106 cellule/mL. Risospendere le cellule pulsate con preparati CFSECiao-etichettatura media e le cellule pulsate con preparati CFSElo-etichettatura media.</li>
	<li>Cellule di mix e CFSE-etichettatura media da inversione leggera o vorticoso. Non mescolare nel Vortex. Incubare le cellule e CFSE-Etichettatura supporti a 37 ° C per 15 min. Remix le cellule ogni 5 min.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di multimediale completo di ogni cellule tumorali sospensione e spin a temperatura ambiente per 5 min a 475 x g.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 10 mL di PBS freddo. Girare le cellule a 4 ° C per 5 min a 475 x g.</li>
	<li>Ripetere il punto 8.4.</li>
	<li>Contare le celle e mix peptide-pulsato, CFSECiao-etichettati con pulsati, CFSElo-etichettati cellule con un rapporto di 1:1 per iniezione in topi destinatari. Mantenere un'aliquota di 1 x 106 miscelati di cellule da utilizzare per una valutazione di cytometry di flusso basale (sezione 11). Nota: Il volume finale per iniezione è 100 µ l per topo. Il conteggio finale delle cellule è 10e6 cellule. Perdita di volume nella siringa e l'ago deve essere presa in considerazione e deve essere stimato a 500 µ l.</li>
</ol>9. l'iniezione di cellule bersaglio
Nota: Tenere CFSE-labeled celle protette dalla luce prima e durante l'iniezione per quanto possibile.
<ol><li>Inserire destinatari topi C57BL/6 in un dispositivo di ritenuta con il dorso verso l'alto. Area base coda di spruzzo iniezione con alcool isopropilico al 70%. Somministrare per via endovenosa 100 µ l di sospensione unicellulare nella vena caudale con il lato smussato rivolto verso l'alto.</li>
</ol>10. re-isolamento delle cellule bersaglio
Nota: I tempi di questo passaggio sono fondamentale e dipende la citotossicità CTL e la forza dell'antigene per la stimolazione. Per la valutazione di uccidere un bersaglio di OVA257–264 pulsato, le cellule hanno bisogno di essere raccolto 4-6 h dopo l'iniezione. Poiché le cellule CFSE-labeled sono luce milze sensibili, processo al buio.
<ol><li>Eutanasia i destinatari topi C57BL/6 secondo il metodo approvato di CO2 asfissia.</li>
	<li>Rimuovere spleen(s) come descritto al punto 2.1.1. Disaggregare la milza e lavare gli splenocytes come nei passaggi 2.2.1 - 2.2.3. Lisare cellule di anima rosse come nei passaggi 2.3 - 2.3.2.</li>
	<li>Risospendere le cellule in cellule attivate la fluorescenza 1ml ordinamento buffer (FACs) (1% BSA + PBS) per la valutazione tramite flusso cytometry.</li>
</ol>11. gating logica per determinare l'attività di CTL tramite flusso Cytometry
<ol><li>
Effettuare la valutazione dell'attività CTL utilizzando un protocollo di citometria a flusso standard. Acquisire le celle utilizzando il canale FITC su un citometro a flusso con un laser di 488 nm per eccitazione11.
	<ol>
<li>Cancello sui linfociti dal vivo utilizzando i parametri di forward scatter (FSC) vs side scatter (SSC). Subgate all'interno il cancello dal vivo del linfocita per la popolazione totale di CFSE-positivi. Nota: Le cellule iniettate con etichetta CFSE comporranno un piccolo sottoinsieme dei linfociti totali presenti nella milza. Le celle CSFE-positivo dovrebbero apparire come due popolazioni distinte sulla scala logaritmica.</li>
		<li>Utilizzare un formato di istogramma per determinare la percentuale dei pulsati (sinistra, CFSElo) con pulsato (destra picco, CFSECiao) popolazioni. Perdita di CFSECiao cellule indica l'attività di CTL antigene-specifiche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+cell-permeable+fluorogenic+caspase+substrates.">Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates.</a> Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).</li><li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+relationship+and+protective+immunity+of+memory+CD8+T+cell+subsets.">Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets.</a> Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells.">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li><li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells.">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).</li><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo.">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627 (2014).</li><li>Johansson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+education+in+mice+with+single+or+multiple+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules.</a> J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).</li><li>Hailemichael, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+antigen+at+vaccination+sites+induces+tumor-specific+CD8(+)+T+cell+sequestration,+dysfunction+and+deletion.">Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion.</a> Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).</li><li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+regression+and+autoimmunity+after+reversal+of+a+functionally+tolerant+state+of+self-reactive+CD8++T+cells.">Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).</li><li>Cho, H. I., Celis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+peptide+vaccines+eliciting+extensive+CD8+T-cell+responses+with+therapeutic+antitumor+effects.">Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects.</a> Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).</li><li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy.">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li><li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells.">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Mentre questo protocollo è molto semplice, ci sono pochi passaggi critici che devono essere eseguite con cautela. L'innesco di covax dopo l'iniezione della cellula-T antigene-specifiche in fase di test è necessario vedere qualsiasi uccisione degli obiettivi pulsati. Mentre è possibile che la vaccinazione di base acqua covax crea uno stato infiammatorio acuto, per la fase infiammatoria cronica, sostituendo la formulazione a base di acqua di breve durata con un approccio basato su olio di antigene lento rilascio può produrre una migliore risultato7,12.
Inoltre, il CFSE-etichettatura delle cellule bersaglio seguendo antigene pulsante deve essere uniforme per una lettura di cytometry di flusso ideale. L'etichettatura della CFSECiao con 5 µM e la CFSElo con 0,5 µM è stato trovato per essere l'ideale in questo sistema per fornire una differenza di registro nelle popolazioni che potrebbero essere facilmente distinte.
Questo protocollo è semplice da modificare per il sistema di antigene specifico in fase di test. In primo luogo, la concentrazione del peptide amministrato come componente della covax dovrebbe essere confermata. Un modo semplice per determinare la concentrazione appropriata è di vaccinare e tracciare l'espansione delle iniettato, antigene-specifiche cellule T nel sangue. In questo caso, un debole dell'antigene (hgp10025-33) richiede il doppio del peptide come un antigene forte (OVA257–264). Le concentrazioni convalidate utilizzate nel presente protocollo sarebbe un punto di partenza ragionevole per testare altri antigeni basati sulla forza di stimolazione. Un punto di modifica sarebbe semplicemente immunizzare il selvaggio-tipo mouse con un antigene di interesse seguita dal peptide pulsata obiettivi per valutare la funzione di CTL. Tuttavia, questa modifica sarebbe contare sull'attivazione e l'espansione di endogene risposte antigene-specifiche e così i tempi del trasferimento delle cellule bersaglio sarebbero probabilmente bisogno di 7-14 giorni dopo l'immunizzazione di verificarsi. Inoltre, il livello di antigene-specifiche uccisione può essere notevolmente ridotto rispetto a quello osservato durante il trasferimento di cellule T transgeniche. Un avvertimento con questa modifica è che il livello della risposta CTL al target potrebbe essere troppo basso per essere rilevata.
Oltre alla quantità di antigene necessario per priming del T-linfocita, la tempistica del re-isolamento delle cellule bersaglio CFSE-etichetta deve essere ottimizzata per una determinata ipotesi. Modifiche alla cellula T di essere testato tale risultato nel differenziale uccidendo capacità può richiedere adattamenti nella sincronizzazione del re-isolamento. Un T-cell con una funzione avanzata uccisione sarà necessario avere alcuni obiettivi molto più veloce rispetto al suo omologo di selvaggio-tipo di valutare. Questo profilo cinetico deve essere attentamente esaminato per determinare il timepoint ottimale per affrontare l'ipotesi testata. In generale, abbiamo trovato questo per variare tra 4 e 24 h dopo l'iniezione delle cellule bersaglio.
Una limitazione dell'analisi è che le cellule effettrici non siano state stimolate a cronicamente per indurre uno stato esaurito. Funzione CTL è pertanto limitato a cellule effettrici recentemente attivato. È possibile che questo metodo potrebbe essere modificato per valutare la funzione di richiamo di una capacità di memoria della popolazione o l'abbattimento di un sottoinsieme delle cellule di T antigene-specifiche cronicamente attivati, che sarebbe interessante per future applicazioni.
Questo metodo di test CTL funzione in vivo consente di rilevamento rapido di in vivo di uccisione che supera alcune delle limitazioni di un in vitro l'impostazione. Un sistema immunitario intatto è a posto e l'adescamento delle cellule T trasferite tramite il metodo di covax si basa sulla presentazione del peptide e co-stimolazione di cellule presentanti l'antigene endogene. A differenza di altri in vivo uccidendo saggi, questo metodo non richiede la presenza di un target di tumore o un'infezione. Tuttavia, l'aggiunta di una destinazione di tumore fornirebbe un comparatore aggiuntivo e potrebbe essere aggiunto per il dosaggio prima dell'iniezione di cellule T antigene-specifiche e amministrazione di covax per future applicazioni di questo metodo.

Protocolli multipli esistono per valutare il potenziale citolitica (CTL) di un CD8+ o CD4+ T-cellula. Questa valutazione può essere facilmente fatto in vitro sotto condizioni controllate1,2,3. Inoltre, modelli di malattia infettiva, come LCMV, classicamente hanno esaminato la funzione CTL attraverso l'uso di differenzialmente CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) etichettati cellule bersaglio dove il CFSECiao-sono cellule con etichettate ha pulsato con un peptide e CFSElo-pulsati cellule rimangono contrassegnati dell'obiettivo. Le cellule sono poi iniettate con un rapporto 1:1 e valutate per la perdita della CFSECiao-etichettato pulsati obiettivi di flusso cytometry4. Modelli di vaccino e rifiuto hanno utilizzato anche strategie simili per valutazione di in vivo uccidendo entrambi CD8+ e CD4+ T cellule così come cellule NK5,6. Questo è un potente, ma richiede l'uso di agenti infettivi che innescano il sistema immunitario prima dell'iniezione di destinazione.
Questo protocollo, d'altra parte, non richiede nessuna infezione priore dell'host e invece utilizza una strategia di vaccinazione per primo il sistema immunitario prima dell'iniezione di destinazione. Questa vaccinazione è composto da una formulazione a base di acqua di vaccino del peptide che richiede la fornitura di un immunostimolante cocktail chiamato covax7, costituito da un recettore Toll-like 7 (TLR7) agonista (imiquimod crema), un anti-CD40 agonistico l'anticorpo e l'interleuchina 2 (il-2) che conduce alla combinazione sinergica di immunostimulatory agenti per l'ottenimento dei peptidi specifici adescamento e risposta immunitaria robusta. Come tale, questo test fornisce una rapida lettura della funzione CTL come il vaccino è somministrato insieme con le cellule per la valutazione della funzione solo tre giorni prima dell'iniezione delle cellule bersaglio. Inoltre, l'innesco di covax è abbastanza forte che si può vedere la capacità di uccisione della cellula T antigene-specifiche innescata tra 4 e 24 h dopo l'iniezione.
La limitazione principale di questo protocollo è l'identificazione della timeline in vivo per la rilevazione dell'uccisione di destinazione che è opportuno sia l'antigene e l'ipotesi da testare. Attenta valutazione deve essere effettuata, come variazioni nella forza di antigene così come le alterazioni genetiche in cellule di T in fase di test potrebbe causare funzione differenziale di CTL che richiederebbe un rilevamento di tempi diversi di uccisione di destinazione. Inoltre, mentre la concentrazione appropriata del peptide per la vaccinazione è stata ottimizzata per melanoma umano antigene glicopeptide 100 (hgp10025-33) e ovoalbumina257-264 (OVA257-264)8,9 , uso di un altro modello di antigene che può essere più appropriato per un dato studio richiederebbe ulteriore convalida. A causa delle differenze attese nella capacità degli antigeni di un obiettivo di stimolare la CTL effettrici funzione in combinazione con il covax come adiuvante, ottimizzazione della frequenza di concentrazione e dose dose IL-2 può essere essenziale per raggiungere l'obiettivo desiderato. Nel complesso, questo protocollo permette una rapida valutazione di uccidere funzione in vivo e può essere adattato a qualsiasi antigene specifico.

<table style="border-collapse:collapse;width:523pt" width="697">
	<colgroup>
		<col style="width:199pt" width="265" />
		<col style="width:110pt" width="146" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">6- to 12-week old female C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:110pt" width="146">Charles River</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">027</td>
			<td style="width:125pt" width="167">C57 Black 6 mice</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">OT-1 6-12-week old female mice&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Jackson Labs</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td height="24" style="height:18.0pt">hgp10025&#8211;33&#160;</td>
			<td class="xl69">CPCScientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">834139</td>
			<td>KVPRNQDWL</td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td height="24" style="height:18.0pt">OVA 257&#8211;264&#160;</td>
			<td class="xl69">CPCScientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">MISC-012</td>
			<td>SIINFEKL</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">Imiquimod cream 5%&#160;</td>
			<td class="xl69">Fougera</td>
			<td class="xl73">51672-4145-6</td>
			<td>Aldara Cream</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">CD40-specific mAb&#160;</td>
			<td class="xl69">BioXcell</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">BE0016-2</td>
			<td>clone FGK4.5</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">rhIL-2 protein&#160;</td>
			<td class="xl69">Hoffman LaRoche Inc</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">136</td>
			<td>Recombinant human IL-2 protein</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">70% isopropyl alcohol Prep&#160;</td>
			<td class="xl69">Kendall</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">S-17474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">PBS</td>
			<td class="xl69">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">10010-023</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">FBS</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">26140-079</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">RBC lysis buffer&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">A10492-01</td>
			<td>red blood cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">RPMI 1640 Media</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">L-Glutamine&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Pen/Strep</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15140122</td>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">CFSE</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">C34554</td>
			<td>5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Sigma&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">1.5 mL MCT graduated natural&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">05-408-129</td>
			<td>microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">70% ethanol</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl73">BP8201500</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Trypan blue solution, 0.4%&#160;&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Hemocytometer</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">27 gauge needle</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">BD</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">1 mL syringe</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">BD</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assay for detection of antigen-specific t-cell cytolytic function using a vaccination model

Metodologie attuali per l'uccisione di antigene-specifiche sono limitate per uso in vitro o utilizzati in modelli di malattie infettive. Tuttavia, c'è non un protocollo specificamente destinato a misurare antigene-specifiche uccisione senza un'infezione. Questo protocollo è stato progettato e descrive i metodi per superare queste limitazioni, consentendo per la rilevazione dell'antigene-specifiche uccidendo una cella obiettivo di CD8+ T cells in vivo. Ciò avviene mediante l'Unione di un modello di vaccinazione con un tradizionale CFSE-etichetta target uccidendo il dosaggio. Questa combinazione consente al ricercatore di valutare il potenziale CTL di antigene-specifiche direttamente e velocemente come il dosaggio non è dipendente della crescita del tumore o infezione. Inoltre, la lettura si basa sulla citometria a flusso e quindi dovrebbe essere facilmente accessibile alla maggior parte dei ricercatori. La limitazione principale dello studio consiste nell'identificare la timeline in vivo che è appropriato per l'ipotesi in fase di test. Variazioni nella forza di antigene e mutazioni nelle cellule T che possono derivare in funzione citolitica differenziale devono essere attentamente valutati per determinare il momento ottimale per la raccolta delle cellule e valutazione. La concentrazione appropriata del peptide per la vaccinazione è stata ottimizzata per hgp10025-33 e OVA257-264, ma occorrerebbero ulteriori convalida per altri peptidi che potrebbero essere più appropriati per un determinato studio. Nel complesso, questo protocollo permette una rapida valutazione di uccidere funzione in vivo e può essere adattato a qualsiasi antigene specifico.

Prima dell'iniezione delle cellule bersaglio CFSE-etichetta, la miscela di 1:1 cella viene eseguita su un citometro a flusso per determinare le frequenze di base il CFSECiao sia CFSElo destinazione delle cellule. Figura 1 A Mostra la strategia di gating per rilevare i cambiamenti nelle popolazioni CFSE, un cancello iniziale viene effettuato utilizzando parametri FSC e SSC. Le cellule di CFSE-positive totale sono quindi subgated prima della valutazione dei cambiamenti nella frequenza, come questa popolazione è relativamente piccola rispetto agli splenocytes endogeno senza etichetta. La frequenza relativa di CFSECiao elo popolazioni CFSE è calcolata impostando la popolazione totale di CFSE-positivi al 100%. Questa analisi può essere fatto utilizzando un formato di trama di un istogramma o un punto. Figura 1Bè riportato un esempio della frequenza relativa delle popolazioni CFSE prima dell'iniezione. Questo rapporto sarà raramente esattamente 1:1 ma dovrebbe essere abbastanza vicino. La necessità di innesco della covax è illustrato nella Figura 1C dove nessun omicidio dell'antigene pulsato, cellule CFSECiao bersaglio è osservato alle 24 h post iniezione. Figura 1 D di seguito viene illustrato l'uccisione efficace dell'antigene pulsata, CFSECiao-etichettati cellule bersaglio come il picco che è stato osservato prima dell'iniezione è quasi inosservato e il rapporto è drammaticamente spostato da 50% a 1% di rilevazione. La figura mostra anche la cinetica dell'antigene pulsata, CFSECiao-etichettato di uccisione delle cellule bersaglio valutando la perdita di questa popolazione sia h 6 e 24 h post iniezione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56255/56255fig1.jpg"> Figura 1: Confronto delle cellule con etichettate al basale e dopo l'iniezione delle cellule bersaglio CFSE-labeled. (A) la strategia di gating per la valutazione della funzione CTL è indicata. Brevemente, i linfociti dal vivo sono gated utilizzando parametri di forward scatter (FSC) vs side scatter (SSC). Totale celle CSFE-positivi sono subgated all'interno del cancello di cellule vive. Il rapporto di CFSECiao e CFSElo è basato sui loro rispettivo frequenza all'interno della popolazione totale di CFSE-positivi. (B) CFSE seguente etichettatura, cellule bersaglio sono misti 1:1 e valutate per il rapporto di CFSECiao e CFSElo cellule tramite flusso cytometry. I numeri indicano la frequenza delle rispettive cime su entrambi un istogramma (a sinistra) e formati di CFSE vs SSC dot plot (a destra). (C) questo dimostra la mancanza di cellule bersaglio uccidendo senza precedente vaccinazione con covax regime. Splenocytes sono stati raccolti 24 h dopo l'iniezione. (D) questo dimostra l'uccisione di antigene-pulsato CFSECiao cellule bersaglio a 6 h (grafici in alto viene) e 24 h (grafici in basso) dopo l'iniezione. I numeri indicano la frequenza delle cime CFSE-etichetta su un istogramma (a sinistra) e il formato CFSE vs SSC punto trama (a destra). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56255/56255fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

L'obiettivo del presente protocollo è quello di consentire il rilevamento in vivo di uccisione di una cella di destinazione in un modello murino di antigene-specifiche.

In Vivo Test per la determinazione della funzione citolitica di cellule T antigene-specifiche utilizzando un modello di vaccinazione

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

in-vivo-assay-for-detection-antigen-specific-t-cell-cytolytic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

9.8K Views.  University of Texas MD Anderson Cancer Center. L'obiettivo del presente protocollo è quello di consentire il rilevamento in vivo di uccisione di una cella di destinazione in un modello murino di antigene-specifiche.

Video: In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

Antigene specifico In Vivo Analisi Uccidere utilizzando cellule bersaglio CFSE etichetta

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Induzione di Graft-versus-host disease e<em&gt; In Vivo</em&gt; T monitoraggio cellulare Utilizzando un MHC-abbinato modello murino

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

Trans-vivo Delayed Type Ipersensibilità Assay per Antigen regolamento specifico

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

In vitro per valutare l&#39;impatto di immunoregolatorio Pathways su HIV-specifica CD4 T effettrici delle cellule di funzione

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello di un attacco T-Cell Oligodendrocyte-diretto nel acute cervello fette

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

La valutazione della retina microglia fagocitaria Funzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando un test citometria a flusso basato su

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generazione<em&gt; De Novo</em&gt; Antigene-specifici T umana recettori cellulari di trasduzione retrovirale di Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

Rilevamento e l&#39;arricchimento di Rare antigene-specifiche cellule B per l&#39;analisi del fenotipo e funzione

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

Un'analisi di Microarray della proteina per determinazione sierologica dell'infezione di Clostridium difficile anticorpo seguenti risposte antigene-specifiche

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...