Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un premio per la ricerca della carriera di ricerca del Fondo Israel Cancer Research, una sovvenzione dell&#39;Iniziativa Nazionale di Nanotecnologia Israeliana e della Helmsley Charitable Trust per un&#39;Area Tecnologica Focale sulle Nanomedicine per la Theranostics Personalizzata (VP-K) e National Istituti di Salute concedono una sovvenzione R01GM076360 (a XC).

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Una fabbricazione di microarray di glycan di successo richiede una pianificazione attenta e comprende diversi passaggi importanti nel protocollo. Questi includono: (1) pianificare i layout di blocco e piastre che definiscono tutti i parametri successivi ( ad esempio, distanze, spaziatura, quantità di campioni e stampa); (2) pulire i perni e garantire l&#39;integrità del perno, che è fondamentale per controllare l&#39;omogeneità spot; (3) mantenendo l&#39;alta umidità durante la stampa, cruciale per evitare l&#39;evaporazione del campione durante lunghe prove, che potrebbero compromettere l&#39;omogeneità spot; (4) selezionare i parametri di allineamento e analisi corretti, che possono influenzare i risultati ( ad esempio, il metodo di sottrazione di sfondo, la soglia e la flessibilità di dimensione dello spot). Il metodo può essere ulteriormente modificato per soddisfare specifici progetti sperimentali e obiettivi. Ad esempio, il numero di pre-spotting può essere modificato per meglio adattarsi a ogni tipo di materiale da stampare sull&#39;array. La fase di lavaggio del perno durante la fase di lavaggioLa stampa può essere ottimizzata per adattarsi a diversi materiali stampati, con brevi o prolungati cicli di lavaggio. Inoltre, la quantità di macchie di una pin stampata per dip può essere modificata per includere più o meno punti ma richiede una calibrazione separata per ogni tipo di materiale utilizzato nell&#39;array. Il tipo di marcatore di fluorescenza e la sua concentrazione possono essere modificati, purché contenga il gruppo chimico appropriato per la coniugazione (ad esempio, amina primaria per diapositive rivestite in epoxy). Le concentrazioni e le tipologie di curve STD possono essere estese ( ad esempio, umano / topo / altro organismo IgG, IgM, IgA, ecc .). Le condizioni del buffer possono essere ottimizzate per adattarsi a materiali diversi, preferibilmente privi di materiali con l&#39;ammina primaria per evitare il legame non specifico all&#39;array, che potrebbe causare un maggior livello di background. Importante, per il rilevamento ottimale di Neu5Gc, il reagente biologico bloccante deve essere esente da Neu5Gc ( ad esempio, evitare il latte BSA), in quanto ciò può ridurre il rilevamento di NeoglGc-sialoglycan e iNcrease background 19 , 20 . Le concentrazioni di rilevazione primaria e secondaria devono essere ottimizzate per evitare elevati livelli di sfondo e legame non specifico. Inoltre, i parametri di scansione ( ad esempio, potenza, guadagno e risoluzione) possono essere modificati per ridurre lo sfondo o migliorare i segnali bassi. Infine, i parametri di allineamento e di analisi possono essere modificati in modo da adattarsi ad alti livelli di sfondo oa caratteristiche diverse. Ulteriori informazioni e linee guida per quanto riguarda gli standard raccomandati per la segnalazione di dati di microarray glycan sono stati recentemente descritti dall&#39;iniziativa MIRAGE 17 , che possono eventualmente facilitare la condivisione dei dati e l&#39;interpretazione. In sintesi, i microarray di glico forniscono uno strumento robusto per indagare le interazioni glycan-biomolecule e possono essere adattate a vari campioni biologici. Gli anticorpi anti-Neu5Gc svolgono diversi ruoli nella malattia umana 23 . Ad esempio, nel cancro, Gli anticorpi anti-Neu5Gc svolgono ruoli duali: da un lato, servono come potenziali biomarcatori, ma dall&#39;altro servono come terapie potenziali 7 , 21 , 24 . Questi anticorpi contribuiscono anche all&#39;esacerbazione dell&#39;aterosclerosi 25 , all&#39;efficacia del xenotrapianto 20 , 26 e all&#39;effetto delle bioterapie glicosilate 27 . Pertanto, la profilazione degli anticorpi anti-Neu5Gc in vari campioni umani è di crescente interesse, e i test ad alto rendimento, come quello descritto qui, possono contribuire a favorire la nostra comprensione dei loro ruoli nella salute umana e nelle malattie.

Sias sono zuccheri acidi che coprono catene di glicamine sulle glicoproteine ​​delle superfici cellulari e sui glicolipidi nei vertebrati. L&#39;espressione Sia è modificata nelle cellule tumorali 1 e si correlano con la progressione e / o la metastasi 2 , 3 . Due delle principali forme Sia nei mammiferi sono Neu5Ac e la sua forma idrossilata, Neu5Gc 2 . Gli esseri umani non possono sintetizzare Neu5Gc a causa di una inattivazione specifica del gene che codifica l&#39;enzima CMAH. Questa non umana Sia mette metabolicamente in cellule umane come &quot;sé&quot;, proveniente da alimenti ricchi di nutrienti Neu5Gc ( es. Carni rosse) 4 , 5 . Neu5Gc è presente a bassi livelli sulle superfici cellulari dell&#39;epitelio umano e dell&#39;endotelina, ma si accumula soprattutto nei carcinomi. Neu5Gc è riconosciuto come straniero dal sistema immunitario humorale 2 , 6 .La complessità antigenica di Neu5Gc-glicani può avvenire a più livelli, tra cui la modifica di Neu5Gc, il legame, i glicanti sottostanti e gli scaffold e la loro densità, tutti riflessi dalla complessità della risposta anticorpale anti-Neu5Gc negli esseri umani 6 . Alcuni di questi anticorpi servono come biomarcatori del carcinoma e immunoterapia potenziale 7 . L&#39;avvento della sintesi chemoenzimatica di diversi sialicani 8 ha aperto la strada all&#39;analisi più approfondita di tali anticorpi, facilitata dall&#39;utilizzo della tecnologia microarray a glicole 9 , 10 . Così, con la preparazione facilitata e la manipolazione di grandi librerie di carboidrati naturali e sintetici, i microarray glicanici sono diventati una potente tecnologia ad alto rendimento per indagare le interazioni dei carboidrati con una miriade di biomolecole 10 , 11 , </sup&gt; 12 , 13 . In un formato a matrice vengono utilizzate quantità minime di materiali e questa visualizzazione multivalente di glicani biologicamente rilevanti consente di individuare migliaia di interazioni di legame in un singolo esperimento. Importante, questa tecnologia può essere applicata anche alla scoperta dei biomarker e al monitoraggio delle risposte immunitarie nei vari campioni 7 , 12 . La fabbricazione di microarray di glico di successo richiede la considerazione di tre aspetti importanti: il tipo di robot della stampante, la chimica di coniugazione di glicole e l&#39;ottica di rilevazione. Per quanto riguarda la tecnica dello strumento di stampa, sono disponibili due tecniche: contatti e stampanti non a contatto. Nella stampa a contatto, 1-48 pins d&#39;acciaio vengono immersi in una piastra di fonte multi-well contenente la soluzione di glicina e sono scoperti su diapositive di vetro funzionalizzate direttamente contattando la superficie di scivolo in vetro. La quantità di soluzione deFegato alla diapositiva è una funzione della durata persistente sulla superficie di scorrimento. Di solito, i campioni vengono prima pre-macchiati su un blocco di vetro (per raggiungere macchie omogenee) prima che siano stampate sulla superficie di scorrimento. Nelle stampanti non a contatto ( ad esempio, la stampante piezo-elettronica), i glicani vengono stampati da un capillare di vetro utilizzando segnali elettrici controllati. Il segnale elettrico può essere calibrato finemente per ottenere una stampa più precisa rispetto alla stampa a contatto. La dimensione e la morfologia dei punti sono anche relativamente più omogenei. Un ulteriore vantaggio è il riciclo del campione di nuovo alla piastra di origine dopo la stampa. Tuttavia, il principale svantaggio delle stampanti piezoelettroniche è la limitazione delle punte di stampa (4 o 8), con una durata di stampa molto lunga, che richiede particolare attenzione alla stabilità della slitta, alla temperatura, all&#39;umidità e all&#39;evaporazione del campione. La stampante a getto d&#39;inchiostro non contatto richiede maggiori volumi di campionamento 14 . <p clasS = &quot;jove_content&quot;&gt; A differenza delle limitate opzioni disponibili per i metodi di stampa, la chimica di coniugazione glicata è una considerazione più complessa, con molte opzioni da scegliere. La chimica di immobilizzazione selezionata deve tenere conto dei gruppi attivi sui glicani e della reattività della superficie di scorrimento. I glicani da immobilizzare su una specifica superficie microarray, sinteticamente sintetizzati o isolati naturalmente, richiedono tutti un gruppo reattivo identico. Inoltre, i glicani devono essere pura e omogenei. D&#39;altra parte, la superficie di immobilizzazione e la chimica dovrebbero fornire riproducibilità e densità di attacco affidabile. Sono stati sviluppati più metodi di immobilizzazione con attaccamento covalente o non covalente (assorbimento fisico) 10 , 11 , 12 , 13 . Per informazioni dettagliate sulla tecnologia microarray a glicina stampata per l&#39;inaugurazioneD investigatore, fare riferimento a queste eccellenti recensioni 13 , 15 . Importante, le recenti informazioni minime necessarie per un&#39;iniziativa per esperimenti di Glycomics (MIRAGE) descrivono le linee guida per la preparazione dei campioni 16 e per la segnalazione di dati da analisi microarray a glicole 17 per migliorare gli standard in questo campo crescente. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per la fabbricazione di microarray sialoglycan usando una specifica nano-stampante a contatto in un formato a 16 pozzetti. Ognuno dei glicani possiede un&#39;ammina primaria che medierà il loro legame covalente alle vetrate in vetro epossidico. Descriviamo anche lo sviluppo e l&#39;analisi di una sola diapositiva usando vari campioni di sera umani, anticorpi e lectini vegetali di Sia. I test di analisi microarray di Sialoglycan comportano diversi passi importanti che includono la fabbricazione, l&#39;elaborazione, lo sviluppo e l&#39;analisi di array. La fabbricazione dell&#39;array richiede la pianificazione dell&#39;arRay, preparando i glicani e la piastra sorgente, programmando la nano-stampante e stampando le diapositive. Successivamente, le diapositive vengono elaborate, sviluppate e analizzate ( Figura 1 ).

<table><tbody><tr><td>Primary-amine containing sialoglycans</td><td>Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services)</td><td>Contact info@glycohubusa.com for compound requests</td><td>Printed glycans</td></tr><tr><td>Monosodium phosphate monohydrate</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Printing buffer component</td></tr><tr><td>Disodium phosphate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>Printing buffer component</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Hy-Labs</td><td>BP-507/500D</td><td>Printing buffer/ incubation/washing buffer</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Slide blocking reagent</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G-7893</td><td>Printing buffer component</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>0700/08</td><td>Slide blocking reagent</td></tr><tr><td>Ovalbumin (Grade V)</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td>Slide Blocking protein</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>Slide washing detergent</td></tr><tr><td>Alexa 555-Hydrazide</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A20501MP</td><td>Marker on array</td></tr><tr><td>ChromPure Human IgG, whole molecule</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>009-000-003</td><td>Printing component</td></tr><tr><td>Biotinylated- SNA</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1305</td><td>Plant Lectin &amp;ndash; binding Sia-alpha2&amp;ndash;6-linked</td></tr><tr><td>Biotinylated-MALII</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1265</td><td>Plant Lectin &amp;ndash; binding Sia-alpha2&amp;ndash;3-linked</td></tr><tr><td>Chicken-anti Neu5Gc IgY</td><td>BioLegend</td><td>146903</td><td>Primary detection</td></tr><tr><td>Cy3-Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-0848</td><td>Biotin binding</td></tr><tr><td>Cy3-anti Human IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>109-165-088</td><td>Secondary detection against human IgG</td></tr><tr><td>Cy3-anti Chicken IgY</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-165-155</td><td>Secondary detection against chicken IgY</td></tr><tr><td>Human sera samples</td><td>Israeli Blood Bank</td><td></td><td>Primary detection</td></tr><tr><td>Compressed Nitrogen (Grade 5)</td><td></td><td></td><td>General dusting/drying tool</td></tr><tr><td>Epoxy-coated slides</td><td>Corning</td><td>40044</td><td>Slides</td></tr><tr><td>Epoxy-coated slides</td><td>PolyAn</td><td>2D 104-00-221</td><td>Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 &amp;micro;m size spots.</td></tr><tr><td>384-well microtiter plate</td><td>Genetix</td><td>2070</td><td>Printing plate</td></tr><tr><td>VWR lab marker</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td>Slide labeling</td></tr><tr><td>Staining Tube</td><td>ArrayIt</td><td>MST</td><td>Slide developing tool</td></tr><tr><td>Staining bath</td><td>VWR</td><td>25608-904</td><td>Slide developing tool</td></tr><tr><td>Slides glass holders</td><td>VWR</td><td>631-9321</td><td>Slide developing tool</td></tr><tr><td>GenePix Scanner</td><td>Molecular devices</td><td>4000B</td><td>Slide scanner</td></tr><tr><td>LM-60 NanoPrinter</td><td>ArrayIt</td><td>LM-60</td><td>Array printer</td></tr><tr><td>Pins</td><td>ArrayIt</td><td>946MP3</td><td>Printing pins</td></tr><tr><td>ProPlate Module</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>P37004</td><td>Slide developing module</td></tr><tr><td>Distilled water</td><td>Bio-Lab</td><td>2321020500</td><td>Required for arrayer and humidifier</td></tr><tr><td>Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 &amp;mu;L</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Matrix)</td><td>MA-2131 Impact2 Equalizer 384</td><td>Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate</td></tr></tbody></table>

profiling anti-neu5gc igg in human sera with a sialoglycan microarray assay

Le cellule sono coperte da un mantello di catene di carboidrati (glicani) che sono comunemente alterati nel cancro e che includono variazioni nell&#39;espressione di acido sialico (Sia). Questi sono gli zuccheri acidi che hanno una spina dorsale di 9 carbonio e che il cappuccio vertebrare i glicani sulle superfici delle cellule. Due delle principali forme di Sia nei mammiferi sono l&#39;acido N- acetilneuraminico (Neu5Ac) e la sua forma idrossilata, l&#39;acido N- glycolylneuraminic (Neu5Gc). Gli umani non possono produrre Neu5Gc endogeno a causa dell&#39;inattivazione del gene che codifica la citidina 5&#39;monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) idrossilasi (CMAH). Il Neu5Gc straniero viene acquisito dalle cellule umane attraverso il consumo alimentare di carne rossa e latticini e successivamente appare su diversi glicani sulla superficie cellulare accumulandosi principalmente sui carcinomi. Di conseguenza, gli esseri umani hanno anticorpi anti-Neu5Gc circolanti che svolgono diversi ruoli nel cancro e in altre malattie mediate da infiammazioni croniche e che stanno diventando potenziali diagnostiche e terapeutichergets. Qui descriviamo un test di microarray di Sialoglycan ad alta percentuale per valutare tali anticorpi anti-Neu5Gc nei sera umani. I glicanti contenenti Neu5Gc e le loro corrispondenti coppie di controlli (glicanti contenenti Neu5Ac), ognuno con un ammino primario di base, sono legati covalentemente a vetrini in vetro epossidico. Esempiamo la stampa di 56 diapositive in un formato a 16 pozzetti utilizzando una specifica stampante nano in grado di generare fino a 896 array per stampa. Ogni diapositiva può essere utilizzata per la visualizzazione di 16 diversi campioni di sera umani per la valutazione della specificità, intensità e diversità degli anticorpi anti-Neu5Gc. Il protocollo descrive la complessità di questo strumento robusto e fornisce una guida di base per coloro che intendono indagare la risposta all&#39;antigene carboidrato alimentare Neu5Gc in diversi campioni clinici in un formato di matrice.

Stampa, sviluppo e analisi di array: La stampa di un microarray di sialoglycan con più campioni di glicina e curve di IgG di IgG in 16 blocchi differenti richiede una calibrazione approfondita per garantire che tutti i campioni siano stampati in modo uniforme possibile in tutti i 16 blocchi per diapositiva ea tutte le diapositive nella stessa stampa. Pertanto, sono necessari esperimenti di calibrazione multipli prima di determinare i parametri di stampa specifici, compresa la composizione del tampone per ciascun tipo di campione, tipo di scivolamento e fabbricazione, tipo di piastra da 384 pozzetti, livelli di umidità, volume di campionamento nella piastra di 384 pozzetti, quantità di pre -prestazione per ogni tipo di campione, concentrazioni della curva di IgG STD umana e tipo di marcatore. La durevolezza di tali diaframmi stampati di sialoglycan è stata validata per durare fino a 10 mesi in una scatola sigillata sotto vuoto al buio a temperatura ambiente. In ogni esperimento di stampa, l&#39;uniformità èUlteriormente monitorati e convalidati attraverso esperimenti di controllo di qualità usando lectine e anticorpi leganti Sia. I protocolli di sviluppo e di scansione erano stati ottimizzati per ottenere uniformità e precisione confrontando campioni all&#39;interno e tra diapositive dalla stessa stampa. Le diapositive sono sviluppate con il divisore da 16 pozzetti, che assicura la corretta separazione tra i blocchi, utilizzando condizioni ottimali di blocco (chimico e biologico), lavaggi e tempi di incubazione. Il rilevamento primario e secondario era stato ampiamente tarato per garantire il massimo rilevamento con sfondo minimo e legame non specifico. Dopo la scansione e l&#39;analisi delle diapositive, i risultati dell&#39;output sono stati trasferiti in un file di fogli di calcolo e sono stati analizzati per determinare la rilevazione in ogni punto. Ogni punto è stato sottoposto a un controllo di outlier e viene omesso se non ha raggiunto il controllo QC (se il% CV è&gt; 20 e il punto è fuori dall&#39;intervallo di una deviazione standard lontano dalla media dei quattro replicati). Quindi, l&#39;intensità media del segnaleR la sottrazione di sfondo locale è stata calcolata per i punti replicati per campione per generare il relativo punto di unità di fluorescenza (RFU) per campione stampato. Una volta che l&#39;uniformità delle curve di IgG STD è stata validata in tutti i blocchi sperimentati, i valori RFU sono stati normalizzati in ng / μL IgG, consentendo la possibilità di confrontare meglio campioni all&#39;interno e tra gli esperimenti. Sia-vincolante Saggio ad alta capacità: Gli array di Sialoglycan possono essere utilizzati per rilevare determinanti ( ad es. Proteine, lectine, anticorpi, virus, ecc. ) Che legano i glicanti contenenti Sia. Per il controllo della qualità dopo la stampa, le lectine di pianta Sia-binding e anti-Neu5Gc IgY sono utilizzate 19 . SNA lega α2-6-linked Sia, MALII lega α2-3-linked Sia e anti-Neu5Gc IgY lega Sialoglycans contenenti Neu5Gc, ma non lega Neu5ASialicani 19 contenenti c, come mostrato nella Figura 2A . L&#39;esperimento di QC mira a convalidare la stampa spot e l&#39;identità e la mancanza di variabilità tra i blocchi stampati utilizzando i quattro diversi pin. La variabilità da blocco a blocchi viene monitorata sviluppando quattro blocchi per ogni rilevazione primaria per diapositiva e confrontando i blocchi stampati con ciascuno dei quattro pin con la stessa unità di rilevazione primaria. È poi fatto un confronto per assicurare che non siano presenti grandi differenze. I sera umani contengono diversi anticorpi anti-Neu5Gc 6 con implicazioni per varie malattie umane 2 , 21 , 22 , 23 . Per valutare il riconoscimento di sialoglycan nel sera IgG umano, 12 sera da donatori umani sani sono stati analizzati sul microrganismo stampato sialoglycanOarray e sviluppato utilizzando IgG anti-umano etichettato con fluorescenza ( Figura 2B ). Ogni blocco stampato contiene una curva di IgG STD umana che è paragonabile ed omogenea in tutti i blocchi ( Figura 2C ). Solo dopo aver convalidato la qualità delle curve STD in ciascun blocco ( Figura 2C ) i risultati dei punti di glico normalizzati in base alla pendenza del blocco e poi moltiplicati per il fattore di diluizione. Come mostrato nella Figura 2B , tutti i sieri umani testati contengono vari livelli di IgG anti-Neu5Gc, con quasi nessun riconoscimento delle coppie abbinate di Sialoglycans contenenti Neu5Ac. Inoltre, i modelli di riconoscimento IgG anti-Neu5Gc sono molto diversi tra questi 12 differenti sieri, sia a livello di intensità che di diversità. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56094/56094fig1.jpg" /> Figura 1: PanoramicaDella stampa, dello sviluppo e dell&#39;analisi delle matrici. ( A ) Neu5Gc9Acα2-6GalNAcαProNH2 è mostrato come un rappresentante Neu5Gc-contaente Sia glicano, con una ammina primaria che viene stampata su vetrini epossidiche. ( B ) Le matrici stampate sono sviluppate con varie proteine ​​Sia-binding, seguite da rilevazione con un appropriato anticorpo secondario etichettato con fluorescenza. Ogni sotto-array può essere sviluppato individualmente. ( C ) La scansione della diapositiva in uno scanner a fluorescenza genera un&#39;immagine che viene ulteriormente analizzata utilizzando il software dell&#39;immagine scanner. Le sotto-array sono sovrapposte con una griglia che traccia ogni punto sugli array e la fluorescenza rilevata per ogni punto. I risultati vengono quindi trasferiti in un foglio di foglio di calcolo. Una singola matrice in un singolo pozzetto è rappresentata schematicamente. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56094/56094fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56094/56094fig2v2.jpg" /> Figura 2: Profili di Microarray di Sialoglycan utilizzando varie proteine ​​Sia-binding. Le diapositive sono state sviluppate con 16 diverse unità di rilevamento primario, una in ogni blocco. ( A ) Rappresentante 3 blocchi di una diapositiva di QC che mostra i modelli di legame delle lectine Sia e MALII delle piante specifiche Sia e polio mono-specifici pollo anti-Neu5Gc IgY. I risultati sono presentati come RFU in formato heatmap per ogni singolo blocco (rosso, bianco e blu, che rappresenta il 100 °, 50 ° e 0 ° percentile, rispettivamente). ( B ) 12 sani umani sani diversi sono stati testati ad una diluizione 1: 100 e rilevati con IgG anti-huamn per profilare la reattività anti IgG IgG. I dati RFU sono stati normalizzati a ng / μL dividendo ogni valore con la pendenza della curva di IgG STD in ciascuna blE quindi moltiplicato per il fattore di diluizione. I dati sono rappresentati in formato heatmap per tutti i blocchi combinati (rosso, bianco e blu, che rappresenta te 100 °, 50 ° e 0 ° percentile, rispettivamente). ( C ) curve IgG umane di STD dei 12 blocchi sviluppati con sieri umani che erano stati utilizzati per normalizzare i dati. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56094/56094fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Glycan ID </td><td colspan="4"> Struttura </td></tr><tr><td> 1 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α3Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα3Galβ4GlcNAcβO (CH 2 ) 2 CH 2 &lt;/ Sub&gt; NH 2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α6Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="4"> Neu5Acα6GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 6 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα6GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 7 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 8 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 9 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GalNAcOO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 10 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 11 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 12 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 13 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 14 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα3Galβ3GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 15 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3Galβ3GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 16 </td><td colcampata = &quot;4&quot;&gt; Neu5Gcα3Galβ3GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 17 </td><td colspan="4"> Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 18 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα6Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 19 </td><td colspan="4"> Neu5Acα6Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 20 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα6Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 21 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 22 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα3Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 23 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α6GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 24 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα6GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 25 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 26 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα3GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 27 </td><td colspan="4"> Neu5Acα6GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 28 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα6GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 29 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α3GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 30 </td><td colspan="4"&gt; Neu5Gc9Acα3GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 31 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α6GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 32 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα6GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 33 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3Galβ3GalNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 34 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα3Galβ3GalNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 35 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GalNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 36 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td&gt; 37 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α6Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 38 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Ac6Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 39 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2 α3Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 40 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Ac3Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Elenco dei Glycani stampati. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Primario secondario </td><td> Anticorpo / Lectina </td><td> Concentrazione di riserva </td><td> Specificità </strong&gt; </td><td> Diluizione / concentrazione di lavoro </td></tr><tr><td rowspan="4"> Rilevamento primario </td><td> Biotinilata-MALII </td><td> 1 mg / ml </td><td> Acido sialico in collegamento α2-3 </td><td> 1:50, 20 μg / mL </td></tr><tr><td> Biotinilata-SNA </td><td> 2 mg / ml </td><td> Acido sialico in collegamento α2-6 </td><td> 1: 100, 20 μg / mL </td></tr><tr><td> Pollo anti-Neu5Gc IgY </td><td> ND </td><td> Neu5Gc Acido Sialico </td><td> 1: 7.000 </td></tr><tr><td> Serum umano </td><td> 100% </td><td> Numerosi epitopi </td><td> 1: 100 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Rilevamento secondario </td><td> Cy3-streptavidina </td><td> 0,75 mg / ml </td><td> biotina </td><td> 1: 500, 1,5 μg / ml </td></tr><tr><td> Cy3-anti Chicken IgY </td><td> 0,75 mg / ml </td><td> Pollo IgY </td><td> 1: 2.000, 0.375 μg / mL </td></tr><tr><td> Cy3-anti IgG umano H + L </td><td> 0,6 mg / ml </td><td> HumaN IgG </td><td> 1: 1.500, 0.4 μg / mL </td></tr></tbody></table> Tabella 2: Elenco delle proteine ​​di rilevazione primaria e secondaria. Figure aggiuntive: <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56094/SUPP_040917Leviatan_Ben-Arye_JoVE_Rev1.docx">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

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Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Profilare IgG anti-Neu5Gc in Sera umana con un assaggio microarray di Sialoglycan

Un saggio di microarray sialoglycan può essere utilizzato per valutare gli anticorpi anti-Neu5Gc nei sera umani, rendendolo un potenziale analisi diagnostica ad alto rendimento per il cancro e altre malattie umane mediate dall&#39;infiammazione cronica.

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Behavior

9.4K Views.  Tel Aviv University.  Un saggio di microarray sialoglycan può essere utilizzato per valutare gli anticorpi anti-Neu5Gc nei sera umani, rendendolo un potenziale analisi diagnostica ad alto rendimento per il cancro e altre malattie umane mediate dall'infiammazione cronica. 

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Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

Spettrometria di massa, di antigeni glicosfingolipide

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

Chemio-enzimatico di sintesi della N- glicani matrice dello sviluppo e dell'anticorpo HIV profilatura

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Chimica

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and determine glycan alterations in diseases. Most commercially available biopharmaceutical proteins are glycoproteins. The efficacy of these drugs is affected by glycosylation patterns. Therefore, an in-depth characterization method for the N-glycans is necessary. Here, we present a comprehensive approach for qualitative and quantitative analysis of N-glycans using hydrophilic interaction liquid chromatography equipped with fluorescence detection and tandem mass spectrometry (HILIC-FLD-MS/MS). N-glycans were released from glycoproteins with a facile method and labeled by a procainamide fluorophore tag in the strategy. Subsequently, the procainamide labeled N-glycans were analyzed by a HILIC-FLD-MS/MS technique. In this approach, N-glycan structures were confirmed by the tandem mass spectrometric analysis, whereas fluorescence detection was used for the quantitative analysis. An application for data analysis of the detected N-glycan peaks is described in the study. This protocol can be applied to any glycoprotein extracted from various species.

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

N-glycan profiling of glycoproteins is essential for discovering novel biomarkers and understanding glycan functions in cellular events. Additionally, N-glycan analysis of protein biopharmaceuticals is very important for human use. In this current article, a high-throughput strategy for identifying and quantifying N-glycan structures was presented using the HILIC-FLD-MS/MS technique.

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and ...

Biochimica

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing termini of oligo- and polysaccharides, as well as its unique chemical characteristics, sialic acid is involved in a multitude of different receptor-ligand interactions. By modifying the expression of sialic acid on the cell surface, sialic acid-dependent interactions will consequently be influenced. This can be helpful to investigate sialic acid-dependent interactions and has the potential to influence certain diseases in a beneficial way. Via metabolic glycoengineering (MGE), the expression of sialic acid on the cell surface can be modulated. Herein, cells, tissues, or even entire animals are treated with C2-modified derivatives of N-acetylmannosamine (ManNAc). These amino sugars act as sialic acid precursor molecules and therefore are metabolized to the corresponding sialic acid species and expressed on glycoconjugates. Applying this method produces intriguing effects on various biological processes. For example, it can drastically reduce&#160;the expression of polysialic acid (polySia) in treated neuronal cells and thus affects neuronal growth and differentiation. Here, we show the chemical synthesis of two of the most common C2-modified N-acylmannosamine derivatives, N-propionylmannosamine (ManNProp) as well as N-butanoylmannosamine (ManNBut), and further show how these non-natural amino sugars can be applied in cell culture experiments. The expression of modified sialic acid species is quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) and further analyzed via mass spectrometry. The effects on polysialic acid expression are elucidated via Western blot using a commercially available polysialic acid antibody.

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid is a typical monosaccharide-unit found in glycoconjugates. It is involved in a plethora of molecular and cellular interactions. Here we present a method to modify cell surface sialic acid expression using metabolic glycoengineering with N-acetylmannosamine derivatives.

Glycoengineering metabolica di acido sialico utilizzando N-acil-per volta Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Bioingegneria

<meta charset="utf8"></head><body>Profilazione automatizzata dei glicani a base di lectina utilizzando l'array di perline in un singolo puntale (BIST)

Rapid Glyco-Qualitative Assessment of Recombinant Proteins Using a Fully Automated System

Protein glycosylation, a critical post-translational modification, influences the stability, efficacy, and immunogenicity of recombinant proteins, including biopharmaceuticals. Glycan structures exhibit significant heterogeneity, varying with production cell types, culture conditions, and purification methods. Consequently, monitoring and evaluating the glycan structures of recombinant proteins is vital, particularly in biopharmaceutical production. The lectin microarray, a technique complementary to mass spectrometry, boasts high sensitivity and ease of use. However, it typically requires more than a day to yield results. To adapt it to non-glycoscience research or drug product process development, an automated, high-throughput alternative is needed. Therefore, the world's first fully automated lectin-based glycan profiling system was developed, utilizing the "bead array in a single tip (BIST)" technology concept. This system allows for the preparation and storage of lectin-immobilized beads in units of 1,000, with customizable parallel insertion orders for various purposes. This article presents a practical protocol for research involving "glyco-qualified" recombinant proteins. After testing their reactivity against 12 polyacrylamide-glycan conjugates, 15 lectins were selected to increase the system's versatility. In addition, the sample labeling process was optimized by switching from Cy3 to biotin, reducing the overall processing time by 30 min. For immediate data qualification, lectin-binding signals are displayed as a dotcode on the top monitor. The system's reliability was confirmed through day-to-day reproducibility tests, repeatability tests, and long-term storage tests, with a coefficient of variation of &lt;10%. This user-friendly and rapid glyco-analyzer has potential applications in the quality monitoring of endogenous glycoproteins for biomarker evaluation and validation. This method facilitates analysis for those new to glycoscience, thereby broadening its practical utility.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Far progredire la ricerca sulla glicosilazione delle proteine utilizzando un sistema completamente automatizzato

A system for the automated and rapid analysis of glycans on proteins was previously developed. This article presents the protocol for "glyco-qualitative analysis," optimized for a broad spectrum of users, such as those engaged in analyzing glycan structures in biopharmaceuticals and other glycoconjugate materials.

Valutazione rapida glico-qualitativa delle proteine ricombinanti utilizzando un sistema completamente automatizzato

Protein glycosylation, a critical post-translational modification, influences the stability, efficacy, and immunogenicity of recombinant proteins, ...

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the individual immune condition determines the success in combating internal and external potential threat signals, but also the existence of a particular pattern of circulating anti-glycan antibodies (and their serological level variation) could be a significant marker of the onset and progression of certain pathological conditions. Here, we describe a Printed Glycan Array (PGA)-based methodology that offers the opportunity to measure hundreds of glycan targets with very high sensitivity; using a minimal amount of sample, which is a common restriction present when small animals (rats, mice, hamster, etc.) are used as models to address aspects of human diseases. As a representative example of this approach, we show the results obtained from the analysis of the repertoire of natural anti-glycan antibodies in BALB/c mice. We demonstrate that each BALB/c mouse involved in the study, despite being genetically identical and maintained under the same conditions, develops a particular pattern of natural anti-carbohydrate antibodies. This work claims to expand the use of PGA technology to investigate repertoire (specificities) and the levels of circulating anti-carbohydrates antibodies, both in health and during any pathological condition.

This work shows the potential of printed glycan array (PGA) technology for the analysis of circulating anti-carbohydrate antibodies in small animals.

Stampato Glycan Array: Una tecnica sensibile per l'analisi del repertorio di anticorpi anti-carboidrati nei piccoli animali

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Profilare IgG anti-Neu5Gc in Sera umana con un assaggio microarray di Sialoglycan

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Spettrometria di massa, di antigeni glicosfingolipide

Chemio-enzimatico di sintesi della N- glicani matrice dello sviluppo e dell'anticorpo HIV profilatura

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine

Glycoengineering metabolica di acido sialico utilizzando N-acil-per volta Mannosamines

Valutazione rapida glico-qualitativa delle proteine ricombinanti utilizzando un sistema completamente automatizzato

Valutazione rapida glico-qualitativa delle proteine ricombinanti utilizzando un sistema completamente automatizzato

Valutazione rapida glico-qualitativa delle proteine ricombinanti utilizzando un sistema completamente automatizzato

Stampato Glycan Array: Una tecnica sensibile per l'analisi del repertorio di anticorpi anti-carboidrati nei piccoli animali

Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine specifico in campioni complessi

Profilare IgG anti-Neu5Gc in Sera umana con un assaggio microarray di Sialoglycan

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Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine

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Valutazione rapida glico-qualitativa delle proteine ricombinanti utilizzando un sistema completamente automatizzato

Valutazione rapida glico-qualitativa delle proteine ricombinanti utilizzando un sistema completamente automatizzato

Valutazione rapida glico-qualitativa delle proteine ricombinanti utilizzando un sistema completamente automatizzato

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Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi

Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine specifico in campioni complessi