I set di dati di diffrazione dei raggi X sono stati raccolti nel beamline 7A del laboratorio Accelerator Pohang (Corea). Questo studio è stato sostenuto dal programma di ricerca scientifica di base amministrato dalla Fondazione Nazionale di Ricerca della Corea (NRF), finanziato dal Ministero della Scienza, ICT e pianificazione futura (2015R1A1A01057574 a MH).

1. Produzione e purificazione della proteina ricombinante di rBC1531 <ol><li> Preparazione di un plasmide di espressione ricombinante BC1531 (rBC1531) <ol><li> Preparare il DNA genomico di B. cereus 10 . </li><li> Amplificare il gene bc1531 da un template del DNA genomico B. cereus mediante reazione a catena polimerica (PCR), utilizzando primer avanti e indietro (vedi Elenco materiali) per creare siti di enzimi di restrizione Bam HI e Sal I rispettivamente 10 . </li><li> Digestare il prodotto PCR e un vettore pET49b modificato (pET49bm) utilizzando Bam HI e Sal I, come descritto 11 . </li><li> Mescolare il prodotto PCR digerito e il vettore (rapporto 3: 1) dal punto 1.1.3 utilizzando ligasi di T4 DNA in una reazione di 10 μL, come descritto 11 . Incubare a 18 ° C per 30 min. </li><li> Pipettare 3 μL della reazione di legatura in 50 μL di chemicaLe cellule E. coli DH5α competenti in un tubo. Mescolare delicatamente pipettando su e giù e posto sul ghiaccio per 30 minuti. Scossa termica per 45 s a 42 ° C. Aggiungere 1 ml di mezzo Luria-Bertani (LB) e coltivare le cellule mentre si agita vigorosamente (250 rpm, 37 ° C, 45 min). </li><li> Prendere 100 μL delle cellule trasformate dal punto 1.1.6 e spargerle sulle piastre LB-agar con 100 μg / mL kanamicina (Kan). Incubare per ~ 18 h a 37 ° C. </li><li> Raccogliere le colonie utilizzando una punta sterile e coltivare le cellule in 3 ml di mezzo LB con 100 μg / mL Kan; Agitare energicamente (250 giri / min, 37 ° C, 18 h). </li><li> Preparare il DNA del plasmide utilizzando un metodo di lisi alcalino-SDS, come descritto 10 . </li><li> Confermare la sequenza nucleotidica del costrutto di espressione rBC1531 utilizzando il sequenziamento del DNA 12 . </li></ol></li><li> Sovrapressione della proteina rBC1531 <ol><li> Ri-trasformare il ceppo E. coli BL21 (DE3) con rBC1531-expPlasmide di rase, come descritto nei passaggi 1.1.5-1.1.6, per sovraespressione. </li><li> Selezionare una colonia e svilupparla in 10 ml di mezzo LB contenente 50 μg / mL Kan (LB + Kan); Agitare energicamente per 18 ore a 37 ° C. </li><li> Inoculare 10 ml di coltura durante la notte in 1 L di LB + Kan media e crescere a 37 ° C fino a quando il OD 600 (densità ottica a 600 nm) raggiunge ~ 0,7. </li><li> Immergere la coltura in acqua ghiacciata per ~ 15 min per raffreddare la temperatura a 18 ° C e aggiungere isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) alla coltura a una concentrazione finale di 1 mM per l&#39;espressione della proteina ricombinante. Crescere la coltura a 18 ° C per un ulteriore ~ ​​16-18 h. </li></ol></li><li> Purificazione di rBC1531 <ol><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione (5.000 xg, 4 ° C, 30 min). Scartare con attenzione il surnatante in modo da non disturbare le cellule. Riassemblare le cellule in 50 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) contenente 10 mM imidazolo. </li><li> Lyse le cellule due volte per sonicazione su ghiaccio per evitare il sovratemperatura dei lisati delle cellule (tempo: 2 min 30 s; ciclo: 5 s; ciclo spento: 10 s; ampiezza: 38%). </li><li> Eliminare il lisato cellulare per centrifugazione (~ 25.000 xg, 4 ° C, 30 min). </li><li> Mescolare 3 mL di branelli di nichel e 60 mL di PBS contenente 10 mM imidazolo e portare a gravità il tampone supplementare per sistemare i branchi di nichel equilibrati in una colonna di vetro di cromatografia di 2,5 x 10 cm. </li><li> Pipettare per trasferire il surnatante dal punto 1.3.3 alla colonna con branelli di nichel pre-equilibrati e incubare a 4 ° C per 2 ore su una ruota di filatura a bassa velocità (~ 20 rpm). </li><li> Lasciare che il surnatante venga scaricato per gravità e lavare le colonne di nickel nella colonna tre volte con 100 ml di PBS contenente 10 mM imidazolo. </li><li> Elute rBC1531 proteina applicando 4 x 5 ml di PBS contenente 250 mM imidazolo. </li><li> Prendere 15 μL dell&#39;eluzione dal punto 1.3.7 e farla funzionare sul 15% SDS-PAGE. Visualizzare le bande proteicheIl gel con colorazione blu di Coomassie 10 . </li></ol></li><li> Rimozione dei tag di affinità della proteina rBC1531 mediante proteolisi di trombina <ol><li> Pipettare le frazioni nel tubo di dialisi (peso molecolare tagliato: 3 kDa) e collocare il tubo in un bicchiere contenente 4 l di tampone compatibile a tamponi di tampone (20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl e 1,5 mM β-mercaptoetanolo) A 4 ° C per una notte. </li><li> Pipettare le frazioni e trasferirle in un tubo conico. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a 280 nm e stimare la concentrazione proteica rBC1531, come descritto 13 . </li><li> Prendere 50 μg di rBC1531 in un tubo da 0,5 ml e aggiungere varie quantità di trombina ( ossia 2, 1, 0,6 e 0,3 unità). Incubare le reazioni di rBC1531 e trombina a 20 ° C per ~ 3 h per determinare la minima quantità di trombina necessaria per eliminare il tag N-terminale di affinità. </li><li> Eseguire le reazioni rBC1531 e trombina su un 15%SDS-PAGE e determinare la minima quantità di trombina ( ad esempio, 0,3 unità di trombina per 50 μg di rBC1531) che digerisce completamente il tag N-terminale di affinità e produce un tag senza rBC1531. </li><li> Aggiungere 10 mg di proteina rBC1531 e 60 unità di trombina a un tubo da 15 mL e incubare a 20 ° C per circa 3 ore per la reazione di trombina-proteolisi. </li><li> Applicare gli standard di filtrazione del gel a una colonna di cromatografia di esclusione (SEC) per preparare una curva standard dei pesi molecolari e dei volumi di eluizione, come descritto 13 . </li><li> Posizionare la proteina rBC1531 digerita da trombina dal punto 1.4.6 in un tubo filtrante centrifugo (peso molecolare tagliato: 3 kDa) e centrifugare a 3.000 g a 4 ° C per ridurre a un volume inferiore a 5 ml. </li><li> Applicare la proteina concentrata rBC1531 alla colonna SEC e raccogliere 60 frazioni eluite in 0,5 mL per tubo 13 . </li><li> Prendere 15 μL di ciascuna frazione, eseguirli su una SDS-PAGE del 15% e staiN il gel utilizzando la soluzione di colorazione Coomassie (0,15% (w / v) blu brillante Coomassie, 40% (v / v) metanolo e 10% (v / v) acido acetico glaciale) come descritto 10 . </li><li> Pipettate le frazioni che contengono rBC1531 e li raccolgono in un tubo. </li></ol></li></ol> 2. Screening e ottimizzazione di cristallizzazione di rBC1531 <ol><li> Condizioni di screening per la cristallizzazione della proteina rBC1531 <ol><li> Concentrare il rBC1531 dal punto 1.4.11 fino a ~ 18,5 mg / mL utilizzando un tubo filtrante centrifugo, come descritto nel passaggio 1.4.8. </li><li> Aggiungere 50 μL di ciascuna soluzione di screening di cristallizzazione (vedere la sezione 2.2) 14 ai pozzetti delle piastre di cristallizzazione a sedere a 96 pozzetti. Posizionare 0,5 μL della soluzione proteica rBC1531 da 18,5 mg / ml su un letto seduto. Mescolare la soluzione proteica con 0,5 μL della soluzione del pozzetto, ripetendo il processo per l&#39;intera piastra. </li><li> Coprire la piastra con una pellicola adesiva chiara.Posizionare le piastre a 96 pozzetti a 18 ° C e consentire la diffusione del vapore. </li><li> Scansione delle gocce a ingrandimento 20-40X utilizzando un microscopio leggero per monitorare la formazione di cristallo ogni giorno per 2-3 settimane. </li><li> Raccogliere i dati di diffrazione dei raggi X utilizzando i cristalli ottenuti con rBC1531 proteina. </li></ol></li><li> Ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione rBC1531 <ol><li> Preparare 500 μl della soluzione di condizione di cristallizzazione iniziale selezionata ( es. 0,1 M sodio cacodilato, pH 6,5 e 1,0 M citrato di sodio) e riempire una piastra di cristallizzazione a 24 pozzetti per la caduta di seduta. </li><li> Aggiungere 0,5 μL della soluzione proteica rBC1531 da 18,5 mg / ml a un letto seduto, mescolare con 0,5 μL della soluzione di pozzetto e coprire immediatamente la piastra con un film adesivo chiaro. Mettere la piastra a 18 ° C. </li><li> Osservate la crescita del cristallo sotto un microscopio leggero per una settimana. </li><li> Ottimizzare varie condizioni di cristallizzazione variando il pH ( es, PH 5,5-6,8) di 0,1 M cacodilato e modificando la concentrazione di sale ( cioè 0,9-1,2 M) di citrato di sodio per ottenere singoli cristalli. Monitorare la crescita del cristallo per ~ 1 settimana e raccogliere i dati di diffrazione dei raggi X 12 . </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzazione dell&#39;attività di trifosfatasi nucleosidica (NTPase) di rBC1531 <ol><li> Validazione dello studio colorimetrico inorganico fosfato-dipendente <ol><li> Preparare uno stadio di pirofosfato (100 mM) e diluire fino a concentrazioni finali di 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50, 100 e 250 μM in 200 μl di tampone di reazione (20 mM HEPES, pH 7,4, 150 MM NaCl e 2 mM MgCl2) in duplicati a 96 pozzetti. Utilizzare la prima piastra come un controllo (questo non contiene pirofosfatasi). Assicurarsi che la seconda piastra contiene pirofosfatasi come piastra di lavoro, come indicato nella fase 3.1.2. </li><li> Aggiungere 0,01 unità di Saccharomyces cerevisiae inorganico pYrofosfatasi (1 μL) ai pozzetti della piastra di lavoro e incubare a 20 ° C per 30-60 minuti. </li><li> Preparare la soluzione di acido molibdato mescolando le soluzioni di molibdato di ammonio (0,86% v / v) e acido ascorbico (14% v / v) in un rapporto 7: 3. Aggiungere 16 μL di soluzione di acido molibdato a entrambi i pozzetti di lavoro e di controllo e attendere 15 min. </li><li> Leggere la densità ottica a 690 nm (OD 690nm ). </li></ol></li><li> Analisi colorimetrica NTPase <ol><li> Preparare uno strato di substrato nucleosidico trifosfato (NTP) di 100 mM e diluire fino alla concentrazione desiderata ( es. 0, 0,2, 4,4,11,22,44,88, o 132 μM) in 180 μl di tampone di analisi (20 mM HEPES, PH 7,4, 150 mM NaCl e 2 mM MgCl2). </li><li> Aggiungere 20 μg di rBC1531 (1,5 mM) e i substrati NTP dalla fase 3.2.1 fino a 200 μL per reazione in una piastra a 96 pozzetti e pipettare verso l&#39;alto e verso il basso per mescolare bene. Coprire la piastra con il suo coperchio e posizionarla in un incubatore a 37 ° C per 30 minPer eseguire la reazione di idrolisi del substrato. </li><li> Trasferire la piastra a un bagno d&#39;acqua di 70 ° C e lasciare riposare per 15 minuti per fermare reazioni catalitiche mediate da rBC1531. </li><li> Aggiungere ogni 0.01 unità di S. cerevisiae pirofosfatasi inorganica (1 μL) ad ogni pozzetto della piastra di reazione (dalla fase 3.2.3) e incubare a 20 ° C per 30 min. Aggiungere 16 μL di soluzione di acido molibdato alla piastra di reazione per sviluppare il colore (~ 15 min). Leggete a OD 690nm . </li><li> Analizzare utilizzando l&#39;equazione di Michaelis-Menten, come descritto 12 . </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving from a gene to a purified recombinant protein. Using recombinant protein, biophysical characterization analyses were conducted to reveal that tetrameric rBC1531 catalyzes NTP hydrolysis into NMP and PPi. 
SEC was employed as the last step of protein purification to remove any protein contaminants derived from the cell lysates that have different sizes than rBC1531. A SEC column was also used to determine the oligomerization status of rBC1531, which was a tetramer. The crystal structure of rBC1531 was consistently determined to be tetrameric12. 
Among biophysical techniques, X-ray crystallography is the best technique for generating atomic models of protein. In general, three-dimensional singular crystals with dimensions larger than 0.1 mm are required for X-ray diffraction. To obtain X-ray diffraction-suitable crystals, crystallization conditions were optimized. For rBC1531, two conditions produced crystals in the initial screening, but only one condition was useful for producing diffraction-suitable crystals12. 
The NTP hydrolysis activity of rBC1531 was assessed by monitoring the formation of a blue-colored complex of molybdate and Pi in the rBC1531-mediated enzymatic reaction15. It has the great advantage of non-radioactively detecting NTP hydrolysis, since the molybdate-Pi complex can be optically measured. In the rBC1531 reaction, the blue-colored complex was generated only in the presence of pyrophosphatase, demonstrating that rBC1531 hydrolyzes NTP into NMP and pyrophosphate. Furthermore, because the blue color of the molybdate-Pi complex can be detected with the naked eye, Pi levels in the rBC1531 reaction, as well as in other applications, can be easily assessed in pilot experiments. Moreover, kinetic parameters, such as Km and Vmax can be calculated by quantifying the intensity of the colorimetric reaction using a visible-light spectrophotometer. However, the presences of free phosphate in the reaction buffer or precipitation during the enzymatic reaction would impair the attainment of accurate results from the NTP hydrolysis reactions. Thus, it is desirable to prepare a Pi standard curve using the identical reaction buffer as in the NTP hydrolysis runs and to ensure an increase in optical density only in the presences of Pi. 
Given that the Km value of the rBC1531-NTP was low (Km = 10 &#181;M), the true substrate for rBC1531 may be a specific type of canonical or noncanonical (d)NTP. To test this possibility, the experimental conditions can be modified to use a specific NTP (i.e., ATP, GTP, CTP, or UTP) rather than a mixture of NTPs. By comparing kinetic parameters, substrate specificity can be determined in future applications. Indeed, additional studies indicate that BC1531 prefers ATP12. Despite the technical simplicity of the colorimetric assay using the molybdate reaction, this assay has a drawback in that the color can become randomly intense when the blue-colored molybdate-Pi complex is left at neutral pH for an extended period of time. Therefore, a critical step is to perform measurements within 15-30 min after the molybdate is added to the Pi-containing sample. The experiment is repeated using the same time point to avoid variations in OD measurements. 
In conclusion, various biophysicochemical methods were used to analyze the oligomerization state and enzymatic activity of rBC1531 and to prepare diffraction-quality crystals for structural studies. These methods can be safely and easily applied to other proteins of interest with minimal experimental equipment requirements.

L&#39;espressione della proteina ricombinante è ampiamente utilizzata per superare i problemi associati a fonti di proteine ​​naturali, quali limitate quantità di proteine ​​e contaminazioni nocive. Inoltre, negli studi sui geni patogeni e sulle proteine, può essere utilizzato un ceppo di laboratorio alternativo che non richiede ulteriori precauzioni di sicurezza. Ad esempio, Bacillus cereus è un modello utile per studiare Bacillus anthracis a causa della loro stretta relazione evolutiva 1 . B. anthracis è un patogeno obbligatorio che provoca l&#39;antrace fatale per via inalatoria negli esseri umani e nel bestiame e può essere potenzialmente utilizzato come bioweapon 2 . Pertanto, gli studi di laboratorio su B. anthracis sono strettamente disciplinati dai centri statunitensi per il controllo delle malattie, che richiedono pratiche di livello di biosicurezza 3 (BSL-3), che prevedono che l&#39;area di laboratorio sia segregata con una pressione negativa della stanza. A differenza di B. anthracis </eM&gt;, B. cereus è classificato come agente BSL-1 e quindi ha minime preoccupazioni di sicurezza. B. cereus è un patogeno opportunistico che, dopo l&#39;infezione, provoca avvelenamenti alimentari che possono essere trattati senza assistenza medica. Tuttavia, poiché B. cereus condivide molti geni critici con B. anthracis , le funzioni delle proteine ​​di B. anthracis possono essere studiate utilizzando gli omologhi corrispondenti di B. cereus 1 . Il cluster di gene ba1554 - ba1558 di B. anthracis è altamente conservato con il cluster bc1531 - bc1535 Di B. cereus , così come con il cluster bt1364-bt1368 di Bacillus thuringiensis , in termini di organizzazione e sequenza del gene. Inoltre, i primi geni ( ba1554 , bc1531 e bt1364 ) dei rispettivi cluster sono assolutamente conservati ( cioè l&#39; identità della sequenza nucleotidica del 100%), implyiUn ruolo critico del prodotto genico nelle specie di Bacillus . A causa della sua collocazione in questi cluster di geni, ba1554 è stato erroneamente identificato come un regolatore di trascrizione supposto 3 . Tuttavia, l&#39;analisi della sequenza di aminoacidi del prodotto ba1554 indica che appartiene alla famiglia MazG, che ha attività di pirofosfosforrolasi nucleotidica e non è associata all&#39;attività del fattore di trascrizione 4 , 5 . Sebbene le proteine ​​appartenenti alla famiglia MazG siano diverse rispetto alla sequenza e alla lunghezza complessiva, condividono un dominio MazG con un residuo di 100 residui caratterizzato da un motivo EXXE 12-28 EXXD (&quot;X&quot; indica qualsiasi residuo di aminoacidi e il numero Indica il numero di residui X). Il dominio MazG non sempre rappresenta direttamente una certa attività catalitica. Un membro MazG di Escherichia coli (EcMazG) possiede due domini MazG, ma suIl dominio C-terminale MazG è enzimaticamente attivo 6 . Inoltre, la specificità del substrato degli enzimi MazG varia da non-specifici nucleosid trifosfati (per EcMazG) a specifici dCTP / dATP (per MazG associati all&#39;integrina) e dUTP (per dUTPasi) 6 , 7 , 8 , 9 . Pertanto, sono necessarie analisi biofisico-chimiche della proteina BA1554 per confermare l&#39;attività NTPase e decifrare la sua specificità del substrato. Qui forniamo un protocollo passo dopo passo che la maggior parte dei laboratori senza un impianto BSL-3 può seguire per caratterizzare il prodotto proteico del gene B. cereus bc1531 , che è un ortologo di B. anthracis ba1554 , a livello molecolare. Brevemente, il ricombinante BC1531 (rBC1531) è stato espresso in E. coli e purificato utilizzando un tag di affinità. Per gli esperimenti cristallografici a raggi X, i cristalliZione delle proteine ​​rBC1531 sono state proiettate e ottimizzate. Per valutare l&#39;attività enzimatica del rBC1531, l&#39;attività di NTPase è stata monitorata in modo colorimetrico per evitare nucleotidi etichettati radioattivamente che sono stati convenzionalmente utilizzati. Infine, le analisi dei dati biofisicochimici ottenuti ci hanno permesso di determinare lo stato di oligomerizzazione e i parametri catalitici di rBC1531, così come ottenere dati di diffrazione dei raggi X dal cristallo rBC1531.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Bacillus cereus&lt;/em&gt; ATCC14579</td><td>Korean Collection for Tissue Culture</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>Genomic DNA prep kit</td><td>GeneAll</td><td>106-101</td><td>Genomic DNA preparation</td></tr><tr><td>Forward primer</td><td>Macrogen</td><td>GAAGGATCCGGAAGCAAAAA&lt;br/&gt; CGATGAAAGATATGCA</td><td>&lt;em&gt;Bam&lt;/em&gt;HI site is underlined</td></tr><tr><td>Reverse primer</td><td>Macrogen</td><td>CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT&lt;br/&gt; CCCTCATCAATACGTG</td><td>&lt;em&gt;Sal&lt;/em&gt;I site is underlined</td></tr><tr><td>nPfu-Forte</td><td>Enzynomics</td><td>P410</td><td>PCR polymerase</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bam&lt;/em&gt;HI</td><td>Enzynomics</td><td>R003S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sal&lt;/em&gt;I</td><td>Enzynomics</td><td>R009S</td><td></td></tr><tr><td>pET49b expression vector</td><td>Novagen</td><td>71463</td><td>Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Enzynomics</td><td>M001S</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis memebrane</td><td>Thermofisher</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Dry block heater</td><td>JSR</td><td>JSBL-02T</td><td></td></tr><tr><td>LB broth (Luria-Bertani)</td><td>LPS solution</td><td>LB-05</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>LPS solution</td><td>KAN025</td><td></td></tr><tr><td>Mini-prep kit</td><td>Favorgen</td><td>FAPDE300</td><td>Plasmid DNA preparation</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competent cell</td><td>Novagen</td><td>69450-3CN</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>50-213-378</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Daejung</td><td>7548-4100</td><td>PBS material</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Daejung</td><td>6566-4405</td><td>PBS material</td></tr><tr><td>Potassium phosphate</td><td>Bio Basic Inc</td><td>PB0445</td><td>PBS material</td></tr><tr><td>Sodium phosphate</td><td>Bio Basic Inc</td><td>S0404</td><td>PBS material</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Bio Basic Inc</td><td>IB0277</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agaros</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>Nickel bead</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Finepcr</td><td>AG</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio-rad</td><td>1610374</td><td>SDS-PAGE protein standard</td></tr><tr><td>Coonmassie Brilliant Blue R-250</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP101-25</td><td>Coomassie staining solution</td></tr><tr><td>Methyl alcohol</td><td>Samchun chemical</td><td>M0585</td><td>Coomassie staining solution</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Daejung</td><td>1002-4105</td><td>Coomassie staining solution</td></tr><tr><td>Dialysis memebrane</td><td>Thermofisher</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Merckmillipore</td><td>605157-1KUCN</td><td>Prepare aliquots of 20 &amp;mu;L (1 Unit per &amp;mu;L) and store at 70 &amp;deg;C and thaw before use</td></tr><tr><td>Superdex 200 16/600</td><td>General Electric</td><td>28989335</td><td>Size exclusion chromatography</td></tr><tr><td>Gel filtration standard</td><td>Bio-rad</td><td>151-1901</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal filter</td><td>Amicon</td><td>UFC800396</td><td></td></tr><tr><td>Crystralization plates</td><td>Hampton research</td><td>HR3-083</td><td>96-well sitting drop plate</td></tr><tr><td>The JCSG core suite I-IV</td><td>Qiagen</td><td>130924-130927</td><td>Crystallization secreening solution</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Cryschem plates</td><td>Hampton research</td><td>HR3-158</td><td>24-well sitting drop plate</td></tr><tr><td>Inorganic pyrophosphatase</td><td>Sigma</td><td>10108987001</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium molybdate solution</td><td>Sigma</td><td>13106-76-8</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>50-81-7</td><td></td></tr><tr><td>NTP substrate</td><td>Startagene</td><td>200415-51</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Biotek</td><td>SynergyH1</td><td>microplate reader</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td>GraphPad</td><td>Prism 5 for Window</td><td></td></tr></tbody></table>

recombinant protein expression, crystallization, and biophysical studies of a bacillus-conserved nucleotide pyrophosphorylase, bcmazg

Per superare le restrizioni e le normative di sicurezza nello studio di geni e proteine ​​da veri agenti patogeni, è possibile studiare i loro omologhi. Bacillus anthracis è un patogeno obbligato che provoca l&#39;antrace fatale inalatorio. Bacillus cereus è considerato un utile modello per studiare B. anthracis a causa della sua stretta correlazione evolutiva. Il cluster gene ba1554 - ba1558 di B. anthracis è altamente conservato con il cluster bc1531 - bc1535 in B. cereus , così come con il cluster bt1364 - bt1368 in Bacillus thuringiensis, indicando il ruolo critico dei geni associati nel genere Bacillus . Questo manoscritto descrive metodi per preparare e caratterizzare un prodotto proteico del primo gene ( ba1554 ) dal cluster di gene in B. anthracis utilizzando una proteina ricombinante del suo ortologo in B. cereus , bc1531.

La caratterizzazione della proteina di interesse in questo studio è iniziata con la preparazione di una quantità sufficiente di proteina B. cereus bc1531 (rBC1531) ricombinante, preferibilmente più di alcuni milligrammi. Il frammento di DNA che codifica la proteina BC1531 è stato preparato mediante PCR utilizzando il DNA genomico di B. cereus come un template, in quanto contiene geni ortologi identici a ba1554 . RBC1531 è stato sovraespresso come una proteina solubile nelle cellule E. coli . La proteina rBC1531 è stata espressa con un tag 6x-Histidine e un sito di scissione trombina al suo N-terminale 12 . Come prima fase di purificazione, rBC1531 è stato purificato mediante cromatografia di affinità di nichel ( Figura 1A ). Successivamente, è stata eseguita una prova di digestione trombinica per determinare la minima quantità di trombina necessaria per la completa digestione del tag di affinità da rBC1531 ( Figura 1A ). Nelle nostre mani, 0,3 unità di trombina era sufFiciente per rimuovere completamente il tag di affinità da rBC1531. Così, durante la scalatura, 10 mg di rBC1531 è stato trattato con 60 unità di trombina per la rimozione di tag. Dopo la digestione della trombina, il rBC1531 senza tag è stato applicato ad una colonna SEC per rimuovere eventuali aggregati solubili e contaminanti a peso molecolare superiore o inferiore. Le frazioni di rBC1531 sono state analizzate mediante SDS-PAGE, i cui risultati suggerivano che il rBC1531 fosse ~ 99% puro ( Figura 1A ). Complessivamente, 1 litro di coltura ha prodotto ~ 8 mg di proteina rBC1531. Per valutare lo stato oligomerico di rBC1531, è stata eseguita SEC. Una curva lineare standard che correla il valore di log dei pesi molecolari dei campioni con i loro corrispondenti volumi di eluizione è stata tracciata utilizzando i picchi degli standard proteici ( Figura 1B ). RBC1531 è stato eluso ad un volume di eluizione di ~ 84 mL e il suo apparente peso molecolare è stato stimato a ~ 55 kDa. Dato che la molecola calcolata noiLa forza del monomer rBC1531 è ~ 13 kDa, questi risultati indicano che rBC1531 si associa come tetramer. Purificato rBC1531 è stato sottoposto a screening per la cristallizzazione usando ~ 400 condizioni in un metodo di diffusione del vapore a goccia-goccia. I cristalli rBC1531 sono risultati in ~ 2 giorni in due condizioni: condizione A, 0,1 M citrato di sodio (pH 5,5) e 20% PEG 3000 ( Figura 2A ) e condizione B, 0,1 M sodio cacodilato (pH 6,5) e 1,0 M sodio Citrato ( figura 2B ). Le condizioni di cristallizzazione sono state ottimizzate variando il pH (0,1 M citrato di sodio, pH 5,0-6,0) e la concentrazione di PEG 3000 (18-21% PEG 3000) dalla condizione-A e modificando il pH (0,1 M sodio cacodilato, pH 5.5-6.8) e la concentrazione di sale (0.9-1.2 M citrato di sodio) dalla condizione-B. I cristalli adatti alla diffrazione sono stati ottenuti solo per la condizione-B, mentre i cristalli della condizione-A tendevano ad essere inter-coltivati ​​piuttosto che singolari. Cristalli della condizione-BI raggi X diffrattati ad una risoluzione di 2,74 Å ( figura 2C ) e sono stati utilizzati per la determinazione della struttura rBC1531. L&#39;osservazione di un dominio MazG conservato nella sequenza proteica BA1554 ha suggerito la presenza di attività NTPase capace di idrolizzare NTPs. L&#39;idrolisi del NTP produce generalmente nucleoside difosfato (NDP) e fosfato inorganico (Pi), o nucleoside monofosfato (NMP) e pirofosfato (PPi). PPi richiede un&#39;attività aggiuntiva di pirofosfatasi per produrre Pi. I livelli di Pi possono essere misurati direttamente utilizzando il molibdato, che forma un complesso blu con Pi (molibdato-Pi) che può essere monitorato utilizzando la densità ottica a una lunghezza d&#39;onda di 690 nm (OD 690nm ) ( Figura 3A ). Nel nostro studio, dopo l&#39;idrolisi di NTP da rBC1531, nessun colore blu visibile è stato prodotto dopo l&#39;aggiunta di molibdato ( Figura 3B ). Tuttavia, quando la pirofosfatasi è stata aggiunta all&#39;idrolisi NTP rBC1531-mediataLa colorazione è cambiata in azzurro intenso ( Figura 3B ), indicando che rBC1531 ha attività di pirofosfoidroloca NTP. Un diagramma di concentrazione di OD 690nm e NTP è stato analizzato utilizzando un metodo di regressione non lineare per determinare i parametri cinetici (V max di 0,75 e K m di 10 μM) per l&#39;enzima rBC1531 ( Figura 3C ). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55576/55576fig1.jpg" /> Figura 1: analisi SDS-PAGE e cromatografia di esclusione di dimensioni (SEC). ( A ) analisi SDS-PAGE di rBC1531. (Left) I picchi di eluizione rBC1531 dalla cromatografia di affinità di nichel (corsia 2, Ni) e SEC (corsia 3) sono stati analizzati insieme a standard proteici (corsia 1, etichettati in kDa). (Destra) Analisi della digestione trombinica di rBC1531 per la rimozione del tag affinità. Le quantità di trombina aggiunta a 50 μg di rBC1531 in diverse reazioni sono indIn unità sopra il gel. ( B ) Analisi di cromatografia di dimensioni-esclusione (SEC) di rBC1531 e delle norme proteiche. (Sinistra) Profili di eluzione di rBC1531 (blu) e standard (rosso). I pesi molecolari delle proteine ​​standard sono mostrati sopra ogni picco, in kDa. Gli assi verticali (y) e orizzontali (x) mostrano rispettivamente le unità di milli-assorbimento (mAU a 280 nm) e i volumi di ritenzione (mL). (Destra) La dimensione molecolare apparente di rBC1531 è stata stimata utilizzando una trama lineare per i pesi molecolari, nella scala dei log e nei volumi di eluizione di standard proteici (R 2 = 0.9934). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55576/55576fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55576/55576fig2.jpg" /> Figura 2: Cristallizzazione e diffrazione del raggio X. ( A ) cristalli rBC1531 in conditi(PH 5,5) e 20% PEG 3000. ( B ) i cristalli rBC1531 in condizione-B, 0,1 m di sodio cacodilato (pH 6,5) e 1,0 m di sodio citrato. Sono mostrati i cristalli iniziali (sinistro) e ottimizzati (medio e destro). Il cristallo rBC1531 ottimizzato (a destra, ~ 0,35 mm x ~ 0,35 mm x ~ 0,20 mm) è stato utilizzato per la diffrazione dei raggi X. Barre scala = 100 μm. ( C ) immagine di diffrazione del raggio del cristallo rBC1531 ottenuta sul PAL beamline BL-7A 12 . La freccia indica un punto ad alta risoluzione. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55576/55576fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55576/55576fig3.jpg" /> Figura 3: attività NTPase. ( A ) La formazione del complesso molibdeno-Pi dipende dalla concentrazione di Pi. La densità ottica a 690 nm è diDirettamente associata all&#39;aumento dei livelli di Pi. L&#39;asse Y e l&#39;asse X rappresentano rispettivamente OD 690nm e concentrazione (μM) di Pi. ( B ) Il colore cambia dopo l&#39;aggiunta di pirofosfatasi. Nella prima fila di pozzi non è stata aggiunta la pirofosfatasi e non ha formato il complesso pi-blu colorato. Tuttavia, la seconda fila è costituita da pozzetti in cui le reazioni rBC1531-NTP sono state trattate con pirofosfatasi e hanno sviluppato un colore blu. I valori di OD 690nm aumentano con l&#39;aumento delle concentrazioni di NTP. ( C ) Michaelis-Menten trama delle reazioni rBC1531-NTP. L&#39;asse Y e l&#39;asse X rappresentano rispettivamente OD 690nm e concentrazione (0-120 μM) di substrati NTP. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard per tre esperimenti separati. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55576/55576fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Bacillus anthracis è il patogeno obbligato di antrace fatale inalatorio, per cui studi di geni e proteine ​​sono strettamente regolamentati. Un approccio alternativo è quello di studiare geni ortologi. Descriviamo studi biofisicochimici di un B. ortologo di B. anthracis in B. cereus , bc1531, che richiede una minima quantità di apparecchiature sperimentali e mancano gravi preoccupazioni di sicurezza.

Espressione proteica ricombinante, cristallizzazione e studi biofisici di a<em&gt; Bacillus</em&gt; -conservato nucleotide pirofosforilasi, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

7.4K Views.  Yonsei University.  Bacillus anthracis è il patogeno obbligato di antrace fatale inalatorio, per cui studi di geni e proteine ​​sono strettamente regolamentati. Un approccio alternativo è quello di studiare geni ortologi. Descriviamo studi biofisicochimici di un B. ortologo di B. anthracis in B. cereus , bc1531, che richiede una minima quantità di apparecchiature sperimentali e mancano gravi preoccupazioni di sicurezza. 

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Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

Produzione, Cristallizzazione e struttura Determinazione<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 tramite Microseeding e Zinco-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Ricerca

Biochimica

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in their largest dimension, which used to represent a challenge. We present two alternative workflows for the structure determination of protein microcrystals by X-ray crystallography with a particular focus on crystals grown in vivo. The microcrystals are either extracted from cells by sonication and purified by differential centrifugation, or analyzed in cellulo after cell sorting by flow cytometry of crystal-containing cells. Optionally, purified crystals or crystal-containing cells are soaked in heavy atom solutions for experimental phasing. These samples are then prepared for diffraction experiments in a similar way by application onto a micromesh support and flash cooling in liquid nitrogen. We briefly describe and compare serial diffraction experiments of isolated microcrystals and crystal-containing cells using a microfocus synchrotron beamline to produce datasets suitable for phasing, model building and refinement.
These workflows are exemplified with crystals of the Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin produced by infection of insect cells with a recombinant baculovirus. In this case study, in cellulo analysis is more efficient than analysis of purified crystals and yields a structure in ~8 days from expression to refinement.

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

A protocol is presented for X-ray crystallography using protein microcrystals. Two examples analyzing in vivo-grown microcrystals after purification or in cellulo are compared.

Microcristallografia dei cristalli proteici e<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffrazione

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

Espressione e purificazione dei canali ionici di mammiferi Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States alone, an average of 41,400 deaths and 1.86 million hospitalizations are caused by influenza virus infection each year 1. Point mutations in the polymerase basic protein 2 subunit (PB2) have been linked to the adaptation of the viral infection in humans 2. Findings from such studies have revealed the biological significance of PB2 as a virulence factor, thus highlighting its potential as an antiviral drug target.
The structural genomics program put forth by the National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) provides funding to Emerald Bio and three other Pacific Northwest institutions that together make up the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). The SSGCID is dedicated to providing the scientific community with three-dimensional protein structures of NIAID category A-C pathogens. Making such structural information available to the scientific community serves to accelerate structure-based drug design.
Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for new lead discovery by targeting a pathway or an entire protein family. Emerald Bio has developed a high-throughput, multi-target parallel processing pipeline (MTPP) for gene-to-structure determination to support the consortium. Here we describe the protocols used to determine the structure of the PB2 subunit from four different influenza A strains.

Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for lead discovery. The following article highlights how the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease utilizes a multi-target approach for gene-to-structure determination of the PB2 influenza A subunit.

Multi-target Parallel Processing Approccio per Gene-to-struttura Determinazione della polimerasi Influenza PB2 subunità

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Immunologia e infezioni

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

Ingegneria Cell-permeabile proteine

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

Biologia

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. PRMTs can either mono- or dimethylate arginine guanidino groups symmetrically or asymmetrically. The enzymology of these proteins is a complex and intensely investigated area that requires milligram quantities of high-quality recombinant protein. The baculovirus expression vector system (BEVS) employing Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) and Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) insect cells has been used for expression screening and production of many PRMTs, including PRMT 1, 2, and 4 through 9. To simultaneously screen for the expression of multiple constructs of these proteins, including domains and truncated fragments as well as the full-length proteins, we have applied scalable methods utilizing adjustable and programmable multichannel pipettes, combined with 24- and 96-well plates and blocks. Overall, these method adjustments enabled a large-scale generation of bacmid DNA, recombinant viruses, and protein expression screening. Using culture vessels with a high-fill volume of Sf9 cell suspension helped to overcome space limitations in the production pipeline for single batch large-scale protein production. Here, we describe detailed protocols for the efficient and cost-effective expression of functional PRMTs for biochemical, biophysical, and structural studies.

The baculovirus expression vector system (BEVS) is a robust platform for expression screening and production of protein arginine methyltransferases (PRMTs) to be used for biochemical, biophysical, and structural studies. Milligram quantities of material can be produced for the majority of PRMTs and other proteins of interest requiring a eukaryotic expression platform.

Produzione di proteine PRMT ricombinanti utilizzando il baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Cristallizzazione delle proteine di membrana trasportatrici ABC nelle bicelle lipidiche

ABCG5/G8 Crystallization in a Lipidic Bicelle Environment for X-Ray Crystallography

ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute lipid-embedded membrane proteins. Extracting these membrane proteins from the lipid bilayer to an aqueous environment is typically achieved by employing detergents. These detergents disintegrate the lipid bilayer and solubilize the proteins. The intrinsic habitat of membrane proteins within the lipid bilayer poses a challenge in maintaining their stability and uniformity in solution for structural characterization. Bicelles, which comprise a blend of long and short-chain phospholipids and detergents, replicate the natural lipid structure. The utilization of lipid bicelles and detergents serves as a suitable model system for obtaining high-quality diffraction crystals, specifically to determine the high-resolution structure of membrane proteins. Through these synthetic microenvironments, membrane proteins preserve their native conformation and functionality, facilitating the formation of three-dimensional crystals. In this approach, the detergent-solubilized heterodimeric ABCG5/G8 was reintegrated into DMPC/CHAPSO bicelles, supplemented with cholesterol. This setup was employed in the vapor diffusion experimental procedure for protein crystallization.

Autore in primo piano: Una configurazione di cristallizzazione delle bicelle per le proteine di membrana trasportatrici ABC per far progredire lo sviluppo di farmaci 

This protocol describes a setup for the crystallization of the sterol transporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 is reconstituted into bicelles for hanging-drop crystallization. The protocol does not require specialized materials or substrates, making it accessible and easy to adapt in any laboratory for determining the protein structure through X-ray crystallography.

Cristallizzazione ABCG5/G8 in ambiente bicellare lipidico per cristallografia a raggi X

ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute lipid-embedded membrane proteins. Extracting these membrane proteins from the lipid bilayer to an ...

Strategie per l'espressione e la purificazione dei trasportatori di soluti

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

Autore in primo piano: Espressione e purificazione di trasportatori di soluti umani utilizzando geni ottimizzati per i codoni 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

Espressione proteica ricombinante, cristallizzazione e studi biofisici di a

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Produzione, Cristallizzazione e struttura Determinazione

Microcristallografia dei cristalli proteici e

Espressione e purificazione dei canali ionici di mammiferi Bestrophin

Multi-target Parallel Processing Approccio per Gene-to-struttura Determinazione della polimerasi Influenza PB2 subunità

Ingegneria Cell-permeabile proteine

Produzione di proteine PRMT ricombinanti utilizzando il baculovirus Expression Vector System

Cristallizzazione ABCG5/G8 in ambiente bicellare lipidico per cristallografia a raggi X

Cristallizzazione ABCG5/G8 in ambiente bicellare lipidico per cristallografia a raggi X

Cristallizzazione ABCG5/G8 in ambiente bicellare lipidico per cristallografia a raggi X

Espressione e purificazione ad alto rendimento di vettori di soluti umani per studi strutturali e biochimici