Questo lavoro è stato sostenuto dagli alimenti per la salute Discovery tema presso l&#39;Ohio State University e il Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari presso l&#39;Ohio State University. Gli autori desiderano ringraziare l&#39;impianto NMR presso l&#39;Ohio State University e l&#39;impianto NMR alla Penn State University.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Modifiche e strategie per la risoluzione Qualità spettrale. La larghezza di riga del segnale NMR e quindi la risoluzione dello spettro NMR è fortemente dipendente spessoramento, che è un processo per l&#39;ottimizzazione della omogeneità del campo magnetico. Per le analisi di routine, 1D spessoramento è adeguata e non è necessario uno spessoramento 3D, dato che essa è stata eseguita da personale NMR su base regolare. Se questo non è il caso, una spessoramento 3D deve essere eseguita prima analisi utilizzando un campione contenente 0,6 ml di H 2 O: D 2 O (90:10). Per ottenere un migliore e più veloce spessoramento, il campione deve essere centrato nella regione di eccitazione / rilevamento della bobina a radiofrequenza (RF), utilizzando il calibro di profondità graduata, prima di essere inserito nel foro del magnete. Un altro fattore che influenza spessoramento gira il campione ad una velocità di rotazione di 10-20 Hz. Sebbene filatura il campione a questa velocità di rotazione migliora gli spessori radiali (X, Y, XY, XZ, YZ, X 2 -Y 2, ecc), è generalmente raccomandato per evitare la comparsa di bande laterali filatura del primo o ordine superiore. Tuttavia, quando si lavora su strumenti che operano in Larmor le frequenze inferiori a 400 MHz, filatura è raccomandato per esperimenti 1D NMR. Risoluzione, nonché la sensibilità, sono influenzate dal guadagno del ricevitore valore (rg). bassi valori del guadagno del ricevitore riducono la sensibilità, mentre valori superiori appropriata trabocco causa del convertitore analogico-digitale (ADC). Risultati ADC overflow nei asimmetrica linea-forme ei segnali non possono essere usate per scopi quantitativi perché i primi punti del decadimento libero dell&#39;induzione (FID) potrebbero essere persi. Nella maggior parte dei casi, il &quot;rga&quot; comando calcola un valore rg appropriato. Tuttavia, in alcuni casi, il valore rg calcolato dal software è superiore al valore ideale e v&#39;è una distorsione nella forma Lorentziana del segnale NMR. Intal caso, l&#39;utente dovrebbe immettere manualmente un valore minore rg digitando &quot;rg (valore)&quot; nella linea di comando. Un tipico valore RG per i campioni analizzati con questo protocollo è 8. Spesso, quando si utilizza criogenicamente raffreddato sonde NMR con una qualità-alto fattore (fattore Q), un grande ritardo (tempo morto)&gt; 200uS tra l&#39;ultimo impulso e il periodo di rilevazione è necessario per evitare artefatti, come una gobba attorno frequenza del trasmettitore ed una laminazione in linea di base della gamma. Tuttavia, un ritardo tale causa un grande errore di fase del primo ordine negativo, che può anche introdurre un rotolamento basale e cali di grandi dimensioni intorno alla base dei segnali forti. In questi casi, una sequenza di impulsi spin-echo z ripristinata può essere usato per produrre spettri NMR con baseline significativamente migliorati, anche se una piccola riduzione sensibilità può verificarsi 23. Fosfolipidi. Oltre alle analisi di olio di pescecampioni ricche di trigliceridi ed esteri etilici, NMR possono essere utilizzati per l&#39;analisi dei campioni di olio di pesce ricchi di fosfolipidi (PL). Tuttavia, particolare attenzione è richiesta per tali campioni perché PLS formare aggregati, che possono causare una significativa riduzione della risoluzione spettrale e sensibilità. Per l&#39;analisi di questi campioni, una miscela solvente di cloroformio deuterato: metanolo (CDCl 3: CD 3 OD) in un rapporto di 70:30 è richiesto per ottenere spettri di alta qualità. Standard interno. BHT è stato scelto come standard interno in questo studio, perché è una molecola altamente simmetrico semplice 1 H e 13 C NMR e nessuno dei suoi picchi si sovrappongono con quelle di costituenti di olio di pesce. BHT ha un segnale nello spettro 1 H NMR, che appare come un singoletto a δ 6.97 e appartiene alle due protoni equivalenti aromatici (para - posizione rispetto al gruppo OH) e un segnale aδ 151.45 in C NMR Spettro 13 che appartiene al carbonio quaternario aromatici recanti il gruppo -OH. Entrambi questi segnali non hanno sovrapposizione con uno qualsiasi dei componenti di olio di pesce, e quindi può essere utilizzato per scopi di quantificazione. Altri composti come 1,2,4,5-tetracloro-3-nitrobenzene (TCNB) o cloruro di etilene possono essere utilizzati anche come standard interni alternative, tuttavia, sono caratterizzati da valori superiori T 1. LIMITI DELLA TECNICA La quantificazione di vari acidi grassi e lipidi negli integratori di olio di pesce è ottenuta attraverso l&#39;integrazione delle appropriati segnali NMR diagnostici negli spettri 1D. Tali segnali devono appartenere a un componente specifico campione e devono avere alcuna interferenza con i segnali provenienti da altri composti. Questo può essere un problema per 1 H NMR poiché lo spettro 1 H NMR è caratterizzato da una bassa risoluzione a causa del breve intervallo di Cheturni MICAL. Inoltre, la presenza di accoppiamento scalare (J) produce multipletti e rende l&#39;analisi più complicata. Ad esempio, gli esteri etilici (EE) possono essere quantificati utilizzando 1 H NMR dalla tripletta caratteristica (J = 7.20 Hz) del gruppo metilico a δ 1.25 e il multipletto a δ 4.12, che appartiene ai protoni metilenici del gruppo estere. Tuttavia, quando si utilizza strumenti NMR operanti in Larmor le frequenze inferiori a 850 MHz, l&#39;analisi di EE usando 1 H NMR dovrebbe essere evitata a causa della parziale sovrapposizione del picco a δ 4.12 con il picco a δ 4.14 TGS, e la sovrapposizione di il segnale a δ 1.25 con l&#39;ampio segnale dei protoni metilenici alifatici a δ 1,23-1,35. Sono stati osservati anche grandi deviazioni tra il 1 H e 13 C analisi di EPA in alcuni campioni, 13 C NMR era più vicino alla composizione dichiarata fornito da tegli produttore. Ciò è probabilmente dovuto alla sovrapposizione del segnale a δ 1.69, che viene utilizzato per l&#39;analisi EPA, con segnali di altri composti che appaiono in alcuni tipi di integratori di olio di pesce. Ulteriori errori quantificazioni possono insorgere quando si utilizza uno standard interno grazie alla purezza incerto dello standard interno e da errori di pesatura. L&#39;analisi composizionale può essere espresso in concentrazioni molari relative senza l&#39;uso di uno standard interno. Se i risultati devono essere espressi in concentrazioni assolute, per esempio come milligrammi di acido grasso per grammo di olio (mg / g), è richiesto l&#39;uso di uno standard interno. Tuttavia, nei casi in cui il segnale NMR di interesse appartiene a più composti con pesi molecolari differenti, i risultati possono non essere espresse come mg / g, anche utilizzando uno standard interno. Inoltre, l&#39;impiego di standard interno solito aumenta la lunghezza dell&#39;analisi perché la s interna più comune<html> tandards, come BHT, sono piccole molecole con elevata simmetria molecolare, che si traduce in lunghi tempi di rilassamento. Poiché il tempo di ripetizione (ritardo tra gli impulsi + tempo di acquisizione) viene impostato in base al più lungo tempo di rilassamento T 1 nel campione, l&#39;uso di uno standard interno aumenterà la durata degli esperimenti poiché sono necessari lunghi ritardi tra gli impulsi. Questo è un fattore molto importante per analisi 13 C NMR causa della eccezionalmente lunga T 1 tempo di rilassamento di nuclei di carbonio. L&#39;aggiunta di un composto paramagnetico come Cr (acac) 3 può ridurre efficacemente il tempo di rilassamento T 1. La concentrazione raccomandata di Cr (acac) 3 è di 0,75 mg / mL di soluzione. Concentrazioni maggiori di Cr (acac) 3 possono essere considerati per un&#39;ulteriore riduzione di T 1, tuttavia, è richiesta cautela per evitare decrementi S / N a causa della linea allargamento. S copi &quot;&gt; Sebbene il 13 C NMR è caratterizzato da una risoluzione spettrale molto più elevata rispetto a 1 H, la sensibilità dell&#39;esperimento 13 C NMR è significativamente inferiore a causa della bassa abbondanza naturale (1,1%) ed il basso rapporto giromagnetico (67.26 10 6 rad s -1 T -1) di 13 C nuclei. Inoltre, i lunghi tempi di rilassamento T 1 di 13 C aumentano la lunghezza dell&#39;analisi. Questo può essere un problema quando l&#39;olio disponibile per l&#39;analisi è limitata, in quanto un aumento numero di scansioni deve essere utilizzato per ottenere un segnale ragionevole rumore. Limitazioni nella sensibilità e la risoluzione degli spettri NMR impediscono l&#39;analisi di molti composti minori in olio di pesce che possono essere analizzati con altre tecniche come la GC. Ad esempio, 1 Η NMR è in grado di separare le singole steroli o acidi grassi (ad es palmitico e stearico), mentre 13 Cnon è in grado di determinare i composti che appaiono in concentrazione molto bassa in olio di pesce come l&#39;acido miristico, dodecanoico e che si sovrappongono con i segnali di tutti gli acidi grassi saturi in δ 173.24 e δ 172,82. Sebbene l&#39;aumento della quantità di campione che viene analizzato rende l&#39;analisi di alcuni composti minori possibili, è necessaria cautela per campioni molto concentrati, a causa della loro maggiore viscosità. Soluzioni molto viscose contenenti più di 150 mg di olio deve essere evitata perché v&#39;è una diminuzione di S / N dovuta alla linea allargamento causato dalle ridotte spin-spin T 2 tempi di rilassamento. Inoltre, ritardi più lunghi tra gli impulsi sono necessarie a causa del lungo T 1 e ci sono diversi problemi di spessoramento, e quindi in risoluzione. Tutti i composti analizzati in olio di pesce con NMR possono essere quantificati simultaneamente in un&#39;istantanea senza utilizzare alcuna procedura di separazione o di purificazione. Il un NMRALISI è rapido come lo spettro 1 H può essere registrato in meno di un minuto, mentre l&#39;acquisizione 13 C NMR dura 10 min. Va notato, tuttavia, che ci sono alcuni fattori che influenzano il tempo di acquisizione dei dati. Specificamente, per 13 C NMR, il tempo di esecuzione 10 min può essere raggiunto solo senza l&#39;impiego di standard interni, e con l&#39;uso di sonde criogenicamente raffreddati, in cui la bobina RF e il preamplificatore vengono raffreddati e quindi il rumore termico è minimizzata. A 10-15 volte maggiore del tempo sperimentale dovrebbe essere previsto per analisi 13 C NMR quando la temperatura ambiente (convenzionali) vengono usate sonde. Significative in relazione a metodi esistenti spettroscopia NMR è risultato essere un potente strumento per la determinazione qualitativa e quantitativa della composizione di integratori di olio di pesce, e per la sua rapidness ha il potenziale di essere applicato per il throughput screening alto di un vasto nu<html> mber dei campioni di olio di pesce. spettroscopia NMR è per definizione una metodologia quantitativa poiché l&#39;area segnale è direttamente proporzionale al numero di nuclei che causano il segnale. Mentre chimici altamente tossici devono preparare campioni NMR, questo metodo è ecologico perché tali piccole quantità di questi agenti chimici (ad esempio CDCl 3) servono a differenza di altri metodi che richiedono grandi quantità di solvente per eluire i campioni. Inoltre, NMR ha diversi vantaggi rispetto ad altri metodi analitici. Nessuna calibrazione con standard è richiesto prima dell&#39;analisi, e una minima preparazione del campione senza operazioni di separazione e purificazione viene generalmente adottato, che rende NMR uno strumento analitico molto veloce. Inoltre, 13 C NMR è la migliore metodologia disponibile per determinare la distribuzione posizionale di vari acidi grassi sullo scheletro di glicerolo. Mentre l&#39;idrolisi enzimatica è stata utilizzata come alternativa non è sempre affidabile= &quot;xref&quot;&gt; 24. Questo è di particolare importanza in quanto v&#39;è un notevole interesse per lo studio della regiospecificity di vari acidi grassi negli alimenti, come si è scoperto che questo riguarda la loro funzione nella dieta umana 25, 26. Applicazioni future Nonostante l&#39;accordo tra l&#39;analisi NMR e l&#39;etichetta dei prodotti, così come il fatto che ci sono alcuni studi che dimostrano accordo tra GC e NMR, riteniamo che gli studi intra-laboratorio più rigorosi e completi sono tenuti a esaminare l&#39;accordo tra NMR e tradizionale metodologie per l&#39;analisi dei costituenti di olio di pesce con un numero maggiore di campioni, dei prodotti di olio di pesce di diverse provenienze, e soluzioni standard certificate. Un&#39;altra importante applicazione futura di NMR in analisi olio di pesce sarà la determinazione dei prodotti di ossidazione. Oltre alla determinazionedei principali composti nell&#39;olio di pesce, diversi prodotti di ossidazione primari e secondari nell&#39;olio di pesce, come aldeidi e perossidi, sono presenti. 1 H NMR può essere potenzialmente applicato per la valutazione dello stato di ossidazione in olio di pesce, in diverse condizioni di ossidazione, come mostrato nella figura 3. La sfida più grande in questa analisi sarà l&#39;assegnazione NMR e l&#39;identificazione dei singoli prodotti di ossidazione. Progressi nella sensibilità del hardware NMR consentiranno inoltre l&#39;identificazione dei singoli steroli mediante 13 C NMR. spettroscopia NMR può essere applicato anche per l&#39;analisi del tessuto pesce nel suo complesso anche senza estrazione utilizzando alta risoluzione Magic Angle Spinning (HR-MAS) NMR. I passaggi critici all&#39;interno del protocollo Due delle fasi più critiche che influenzano l&#39;accuratezza di spettri NMR quantitativi coinvolgono la selezione di un impulso a 90 ° e l&#39;uso di un ritardo tra puLSES ≥ 5 × T 1. L&#39;angolo di impulsi è proporzionale alla larghezza di impulso che è un parametro NMR calibrato che dipende dalla strumentazione e il campione. Un impulso a 90 ° è essenziale per la conversione completa di longitudinale (z) magnetizzazione alla magnetizzazione trasversale osservabile (xy). È importante notare che prima della calibrazione impulso, la NMR sondato deve essere ben sintonizzato ed abbinati. Ciò consente di ottimizzare il trasferimento della potenza RF al campione e quindi massimizzare S / N e garantire disaccoppiamento efficace. La sintonizzazione sonda è principalmente influenzata dalla costante dielettrica del campione, quindi se ci sono differenze nella concentrazione tra i campioni, ripetere il processo di sintonizzazione per ciascuno. Il C NMR esperimento 1D 13 coinvolge sia 13 C e 1 H canali di sintonizzazione in modo automatico e la congruenza è necessario che entrambe nuclei. Un ritardo tra gli impulsi più di 5 × T 1 garantisce la completa recovery della magnetizzazione netta al suo valore iniziale. Se tutte le risonanze nello spettro non hanno completamente rilassato prima di ciascun impulso, il segnale viene parzialmente soppressa e questo porta ad imprecisioni nel dell&#39;integrazione. T 1 valore è un fattore critico che influenza la durata dell&#39;esperimento e dipende l&#39;intensità del campo magnetico nonché la viscosità del campione. Dato che la viscosità tra i campioni è simile, tempi T 1 rilassamento dovrebbero essere determinati per ciascuno strumento solo all&#39;inizio della sessione di analisi. Un&#39;altra caratteristica importante dell&#39;analisi olio di pesce con 13 C NMR è la selezione della sequenza di impulsi appropriata. Il metodo più affidabile per l&#39;analisi quantitativa 13 C è l&#39;inverso gated esperimento di disaccoppiamento, dove protone banda larga disaccoppiamento viene applicata solo durante il periodo di acquisizione e quindi non v&#39;è alcun trasferimento di polarizzazione da 1 a 13 HC tramite l&#39;effetto nucleare Overhauser (NOE). Tuttavia, mentre l&#39;esperimento NMR completamente disaccoppiati può essere utilizzato per scopi quantitativi, cautela è necessaria quando si utilizza questo esperimento perché ci sono diversi fattori NOE tra atomi di carbonio con differenti molteplicità e confronto quindi solidale tra metile, metilene, metano e carbonilici carboni devono essere evitati. Nonostante ciò, quando solo carboni di molteplicità simile e ambiente chimico sono considerati nell&#39;analisi, il metodo completamente disaccoppiato è affidabile. Un esempio di questo è carboni carbonilici di acidi grassi che sono stati trovati per avere differenze significative nei fattori NOE dopo disaccoppiamento 27. Inoltre, per carboni recanti protoni, l&#39;esperimento completamente disaccoppiato fornisce maggiore sensibilità dovuta ai contributi NOE sull&#39;intensità del segnale NMR. Un confronto tra spettri acquisiti con le due sequenze di impulsi viene mostrata in Figura S1.

Il consumo di acidi grassi n -3 nella dieta ha dimostrato di essere utile contro diverse condizioni quali disturbi cardiaci 1, 2, 3, 4 e malattie infiammatorie diabete 5. La dieta occidentale è considerato povero di n -3 acidi grassi e quindi si raccomanda il consumo di integratori di olio di pesce per migliorare la n -6 / -3 n equilibrio nella nutrizione del consumatore 1. Nonostante il recente aumento del consumo di pesce supplemento di olio, le domande rimangono circa la sicurezza, l&#39;autenticità e la qualità di alcuni di questi prodotti. L&#39;analisi rapida ed accurata compositiva di supplementi di olio di pesce è essenziale per valutare correttamente la qualità di questi prodotti commerciali e garantire la sicurezza dei consumatori. Le metodologie più comuni per la valutazione del supplemento di olio di pesces sono gascromatografia (GC) e la spettroscopia a infrarossi (IR). Mentre questi sono metodi altamente sensibili, soffrono di diversi inconvenienti 6. Analisi GC richiede molto tempo (4-8 h) per la separazione e derivatizzazione dei singoli composti è richiesto 7 e l&#39;ossidazione dei lipidi possono verificarsi durante l&#39;analisi 8, 9. Mentre la spettroscopia IR può essere quantitativa, un modello di previsione è richiesta per essere costruito usando parziale minimi quadrati regressione (PLSR), anche se ci sono eccezioni in cui bande IR possono essere attribuiti ad un singolo composto 10. PLSR richiede l&#39;analisi di un gran numero di campioni, che aumenta il tempo di analisi 11. Per questo motivo, v&#39;è un crescente interesse per lo sviluppo di nuove metodologie analitiche che permettono l&#39;analisi precisa e veloce di un gran numero di campioni di olio di pesce. Organizzazioni come l&#39;Office di integratori alimentari (ODS) presso il National Institutes of Health (NIH) e la Food and Drug Administration (FDA) hanno collaborato con l&#39;Associazione dei chimici analitici ufficiali (AOAC) per sviluppare questi nuovi metodi 12, 13. Uno dei metodi analitici più promettenti per lo screening e la valutazione di matrici a più componenti, come integratori alimentari, è Nucleare spettroscopia a risonanza magnetica (RMN) 14, 15. spettroscopia NMR ha diversi vantaggi: è una tecnica non distruttiva e quantitativa, richiede minima o nessuna preparazione del campione, ed è caratterizzato da un&#39;eccellente precisione e riproducibilità. Inoltre, la spettroscopia NMR è una metodologia ecologico perché utilizza solo piccole quantità di solventi. Lo svantaggio principale della spettroscopia NMR è la sua sensibilità relativamente bassa rispetto ad altri analytiMetodi cal, tuttavia, i recenti progressi tecnologici nella strumentazione quali campi magnetici forti, sonde criogeniche di vari diametri, elaborazione dati avanzata e sequenze di impulsi versatili e tecniche hanno aumentato la sensibilità fino alla gamma nM. Mentre strumentazione NMR è alto costo, la lunga durata di spettrometri NMR e le molte applicazioni di NMR abbassare il costo delle analisi a lungo termine. Questo protocollo video dettagliato ha lo scopo di aiutare i nuovi operatori del settore evitare insidie associati con 1 H e 13 C NMR analisi spettroscopica di supplementi di olio di pesce.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Avance III 850 NMR instrument</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avance III 500 NMR instrument</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCI 5mm probe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Helium cooled inverse (proton deetected) NMR probe featuring three independent channels (1H, 13C, 15N)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBO prodigy 5mm probe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Nitrogen cooled observe (X-nuclei detected) probe, featuring two channels; one for 1H and 19F detectionand one for X-nuclei (covering from 15N to 31P)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner turbin</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>NMR spinners are made by polymer materials and they have a rubber o-ring to hold the NMR tube securely in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topspin 3.5</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deuterated chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;865-49-6</td>
			<td>99.8 atom % D, contains 0.03 TMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol,</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;128-37-0</td>
			<td>purity &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish oil samples</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tubes</td>
			<td>New Era</td>
			<td>NE-RG5-7</td>
			<td>5mm OD Routine &#8220;R&#8221; Series NMR Sample Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSMS</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Bruker Systems Management System; control system device</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr spectroscopy as a robust tool for the rapid evaluation of the lipid profile of fish oil supplements

La dieta occidentale è povera di acidi grassi n -3, pertanto si raccomanda il consumo di supplementi di olio di pesce per aumentare l&#39;apporto di questi nutrienti essenziali. L&#39;obiettivo di questo lavoro è quello di dimostrare l&#39;analisi qualitativa e quantitativa di olio di pesce incapsulato utilizzando ad alta risoluzione 1 H e 13 C NMR utilizzando due diversi strumenti NMR; 500 MHz e uno strumento 850 MHz. Sia protone (1 H) e carbonio (13 C) spettri NMR possono essere utilizzati per la determinazione quantitativa dei principali costituenti degli integratori di olio di pesce. Quantificazione dei lipidi negli integratori di olio di pesce è ottenuta attraverso l&#39;integrazione dei segnali NMR appropriate nel relativi spettri 1D. Risultati ottenuti da 1 H e 13 C NMR sono in buon accordo con l&#39;altro, nonostante la differenza di risoluzione e sensibilità tra i due nuclei e due strumenti. Offerta 1H NMRsa un&#39;analisi più rapida rispetto a 13 C NMR, lo spettro può essere registrato in meno di 1 minuto, a differenza di analisi 13 C NMR, che dura da 10 minuti a un&#39;ora. Lo spettro NMR 13 C, tuttavia, è molto più informativo. Può fornire dati quantitativi per un maggior numero di singoli acidi grassi e può essere utilizzato per determinare la distribuzione posizionale degli acidi grassi sullo scheletro di glicerolo. Entrambi i nuclei possono fornire informazioni quantitative in un esperimento senza la necessità di purificazione o separazione gradini. La forza del campo magnetico colpisce soprattutto l&#39;spettri NMR 1 H a causa della sua bassa risoluzione rispetto a 13 C NMR, tuttavia, strumenti NMR costo ancora più basso possono essere efficacemente applicato come un metodo standard dai laboratori dell&#39;industria alimentare e controllo qualità.

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NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

Qui, la spettroscopia ad alta risoluzione 1 H e 13 C Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) è stato utilizzato come strumento di rapida e affidabile per l&#39;analisi quantitativa e qualitativa dei supplementi di olio di pesce incapsulati.

Spettroscopia NMR come uno strumento robusto per la rapida valutazione del profilo lipidico di olio di pesce integratori

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

25.9K Views.  The Ohio State University.  Qui, la spettroscopia ad alta risoluzione 1 H e 13 C Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) è stato utilizzato come strumento di rapida e affidabile per l'analisi quantitativa e qualitativa dei supplementi di olio di pesce incapsulati. 

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Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Isolamento e Caratterizzazione chimica del lipide A da batteri Gram-negativi

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

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Chimica

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic isotopes are typically incorporated metabolically to improve the sensitivity and allow for sequential resonance assignment. Reductive 13C-methylation is an alternative labeling method for proteins that are not amenable to bacterial host over-expression, the most common method of isotope incorporation. Reductive 13C-methylation is a chemical reaction performed under mild conditions that modifies a protein&#39;s primary amino groups (lysine &#949;-amino groups and the N-terminal &#945;-amino group) to 13C-dimethylamino groups. The structure and function of most proteins are not altered by the modification, making it a viable alternative to metabolic labeling. Because reductive 13C-methylation adds sparse, isotopic labels, traditional methods of assigning the NMR signals are not applicable. An alternative assignment method using mass spectrometry (MS) to aid in the assignment of protein 13C-dimethylamine NMR signals has been developed. The method relies on partial and different amounts of 13C-labeling at each primary amino group. One limitation of the method arises when the protein&#39;s N-terminal residue is a lysine because the &#945;- and &#949;-dimethylamino groups of Lys1 cannot be individually measured with MS. To circumvent this limitation, two methods are described to identify the NMR resonance of the 13C-dimethylamines associated with both the N-terminal &#945;-amine and the side chain &#949;-amine. The NMR signals of the N-terminal &#945;-dimethylamine and the side chain &#949;-dimethylamine of hen egg white lysozyme, Lys1, are identified in 1H-13C heteronuclear single-quantum coherence spectra.

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Two methods for assigning the &#945;- and &#949;-dimethylamine nuclear magnetic resonance signals of a reductively 13C-methylated N-terminal lysine are described. One method utilizes the pH-induced selectivity of the reductive methylation reaction, and the other uses aminopeptidase to selectively remove the N-terminal lysine.

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

HKUST-1 as a Heterogeneous Catalyst for the Synthesis of Vanillin

Vanillin (4-hydoxy-3-methoxybenzaldehyde) is the main component of the extract of vanilla bean. The natural vanilla scent is a mixture of approximately 200 different odorant compounds in addition to vanillin. The natural extraction of vanillin (from the orchid Vanilla planifolia, Vanilla tahitiensis and Vanilla pompon) represents only 1% of the worldwide production and since this process is expensive and very long, the rest of the production of vanillin is synthesized. Many biotechnological approaches can be used for the synthesis of vanillin from lignin, phenolic stilbenes, isoeugenol, eugenol, guaicol, etc., with the disadvantage of harming the environment since these processes use strong oxidizing agents and toxic solvents. Thus, eco-friendly alternatives on the production of vanillin are very desirable and thus, under current investigation. Porous coordination polymers (PCPs) are a new class of highly crystalline materials that recently have been used for catalysis. HKUST-1 (Cu3(BTC)2(H2O)3, BTC = 1,3,5-benzene-tricarboxylate) is a very well known PCP which has been extensively studied as a heterogeneous catalyst. Here, we report a synthetic strategy for the production of vanillin by the oxidation of trans-ferulic acid using HKUST-1 as a catalyst.

The conversion of trans-ferulic acid to vanillin was achieved by heterogeneous catalysis. HKUST-1 was employed in this synthesis and the essential step in the catalytic process was the generation of unsaturated metal sites. Thus, when the catalyst was activated under vacuum, full vanillin conversion (yield of 95%) was obtained.

HKUST-1 come catalizzatore eterogeneo per la sintesi di vanillina

Vanillin (4-hydoxy-3-methoxybenzaldehyde) is the main component of the extract of vanilla bean. The natural vanilla scent is a mixture of approximately ...

Spin Saturation Transfer Difference NMR (SSTD NMR): A New Tool to Obtain Kinetic Parameters of Chemical Exchange Processes

This detailed protocol describes the new Spin Saturation Transfer Difference Nuclear Magnetic Resonance protocol (SSTD NMR), recently developed in our group to study processes of mutual-site chemical exchange that are difficult to analyze by traditional methods. As the name suggests, this method combines the Spin Saturation Transfer method used for small molecules, with the Saturation Transfer Difference (STD) NMR method employed for the study of protein-ligand interactions, by measuring transient spin saturation transfer along increasing saturation times (build-up curves) in small organic and organometallic molecules undergoing chemical exchange.
Advantages of this method over existing ones are: there is no need to reach coalescence of the exchanging signals; the method can be applied as long as one signal of the exchanging sites is isolated; there is no need to measure T1 or reach steady state saturation; rate constant values are measured directly, and T1 values are obtained in the same experiment, using only one set of experiments.
To test the method, we have studied the dynamics of the hindered rotation of N,N-dimethylamides, for which much data is available for comparison. The thermodynamic parameters obtained using SSTD are very similar to the reported ones (spin-saturation transfer techniques and line-shape analysis). The method can be applied to more challenging substrates that cannot be studied by previous methods.
We envisage that the simple experimental set up and the wide applicability of the method to a great variety of substrates will make this a common technique amongst organic and organometallic chemists without extensive expertise in NMR.

Spin Saturation Transfer Difference NMR SSTD NMR: A New Tool to Obtain Kinetic Parameters of Chemical Exchange Processes

A detailed protocol describing the SSTD NMR method is presented here to help new users apply this new method to obtain the kinetic parameters of their own systems undergoing chemical exchange.

Spin saturazione Transfer Difference NMR (SSTD NMR): Un nuovo strumento per ottenere Kinetic parametri di processi a scambio chimico

This detailed protocol describes the new Spin Saturation Transfer Difference Nuclear Magnetic Resonance protocol (SSTD NMR), recently developed in our ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Intuizioni le interazioni di aminoacidi e peptidi con materiali inorganici Uso singola molecola Forza Spettroscopia

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Application and Methodology of the Non-destructive 19F Time-domain NMR Technique to Measure the Content in Fluorine-containing Drug Products

Here, we describe a protocol developed by our group that uses low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the average content of fluorinated drugs in their formulated drug product forms: tablets or capsules. This method is specific to fluorinated drugs because it detects only the content of fluorine, avoiding interference from the excipients that lack fluorine. The advantages of measuring the active content of fluorinated drugs using low-field 19F TD-NMR versus high-field 19F solid-state (SS) NMR are the simplicity of the method; the low cost; and the non-destructive nature of the technique, with all samples recoverable in intact forms (e.g., powders, tablets, and capsules), making this technique affordable for any laboratory.
We have tested the method with three fluorinated drug products available on the market - cinacalcet, lansoprazole, and ciprofloxacin - with doses ranging from 15 to 500 mg. The results of the analyses, measured by low-field 19F TD-NMR, supported the reported label claims for the average drug content.
Based on the simplicity and reproducibility of the analysis, we envision this methodology being implemented in any laboratory, including manufacturing plants, as a process analytical technology (PAT) tool in the pharmaceutical industry.

Application and Methodology of the Non-destructive 19F Time-domain NMR Technique to Measure the Content in Fluorine-containing Drug Products

A simple and non-destructive technique that measures the average content of drug substances in formulated drug products containing fluorine using low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) is presented here. The technique can be applied to the development and manufacturing of drugs in the pharmaceutical industry.

Applicazione e metodologia della tecnica NMR Non distruttivo 19F dominio del tempo per misurare il contenuto in prodotti contenenti fluoro di droga

Here, we describe a protocol developed by our group that uses low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). In the case of fast reversible electrochemical processes, current is predominantly affected by the rate of diffusion, which is the slowest and limiting stage. EIS is a powerful technique that allows separate analysis of stages of charge transfer that have different AC frequency response. The capability of the method was used to extract the value of charge transfer resistance, which characterizes the rate of charge exchange on the electrode-solution interface. The application of this technique is broad, from biochemistry up to organic electronics. In this work, we are presenting the method of analysis of organic compounds for optoelectronic applications.

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) of species that undergo reversible oxidation or reduction in solution was used for determination of rate constants of oxidation or reduction.

Spettroscopia di impedenza elettrochimica come uno strumento per la stima della costante tasso elettrochimica

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Color Spot Test As a Presumptive Tool for the Rapid Detection of Synthetic Cathinones

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and other border protection agencies globally. Color testing is a presumptive identification technique indicating the presence or absence of a particular drug class using rapid and uncomplicated chemical methods. Owing to their relatively recent emergence, a color test for the specific identification of synthetic cathinones is not currently available. In this study, we introduce a protocol for the presumptive identification of synthetic cathinones, employing three aqueous reagent solutions: copper(II) nitrate, 2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline (neocuproine) and sodium acetate. Small pin-head sized amounts (approximately 0.1-0.2 mg) of the suspected drugs are added to the wells of a porcelain spot plate, and each reagent is then added dropwise sequentially before heating on a hotplate. A color change from very light blue to yellow-orange after 10 min indicates the likely presence of synthetic cathinones. The highly stable and specific test reagent has the potential for use in the presumptive screening of unknown samples for synthetic cathinones in a forensic laboratory. However, the nuisance of an added heating step for the color change result limits the test to laboratory application and decreases the likelihood of an easy translation to field testing.

Here we present a simple, inexpensive, and selective chemical spot test protocol for the detection of synthetic cathinones, a class of new psychoactive substances. The protocol is suitable for use in various areas of law enforcement that encounter illicit material.

Colore Spot Test come strumento presuntivo per la rilevazione rapida di Cathinones sintetico

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and ...

A New Straightforward Method for Lipophilicity (logP) Measurement using 19F NMR Spectroscopy

Fluorination has become an effective tool to optimize physicochemical properties of bioactive compounds. One of the applications of fluorine introduction is to modulate the lipophilicity of the compound. In our group, we are interested in the study of the impact of fluorination on lipophilicity of aliphatic fluorohydrins and fluorinated carbohydrates. These are not UV-active, resulting in a challenging lipophilicity determination. Here, we present a straightforward method for the measurement of lipophilicity of fluorinated compounds by 19F NMR spectroscopy. This method requires no UV-activity. Accurate solute mass, solvent and aliquot volume are also not required to be measured. Using this method, we measured the lipophilicities of a large number of fluorinated alkanols and carbohydrates.

A New Straightforward Method for Lipophilicity logP Measurement using 19F NMR Spectroscopy

A novel and straightforward variation of the shake-flask method was developed for accurate lipophilicity measurement of fluorinated compounds by 19F NMR spectroscopy.

Un nuovo metodo semplice per la misurazione di lipofilia (logP) utilizzando 19F NMR spettroscopia

Fluorination has become an effective tool to optimize physicochemical properties of bioactive compounds. One of the applications of fluorine introduction ...