Riconosciamo Austin Cyphersmith e Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Istituto di Biologia Genomica, University of Illinois a Urbana-Champaign) per l&#39;assistenza con la microscopia e generosamente accogliere schermo e cattura video al centro di microscopia.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Nei nostri esperimenti, abbiamo trovato che i guasti più comuni sono legati alla qualità di array fabbricati e poco caratterizzati risposta del sistema biologico che interessa. Rimandiamo il lettore alla Tabella 1 per modalità di guasto comuni in esperimenti di microarray cellulare e procedure di risoluzione associati. Per quanto riguarda la qualità delle matrici, in particolare, si raccomanda quanto segue. Confermare la qualità tecnica e la robustezza di arraying programmi, parametri e tamponi utilizzando molecole fluorescente come destrano rodamina-coniugati. perni Pulire accuratamente prima o dopo arraying secondo le istruzioni del produttore e inoltre visivamente controllare che i canali di pin sono chiari di detriti utilizzando un microscopio ottico. Confermare la ritenzione biomolecola Arrayed con macchie di proteine ​​generali o immunomarcatura. Notare che biomolecole con peso molecolare inferiore a 70 kDa spesso non sono mantenute nel idrogel 23, </<html> sup&gt; 31. Convalida Arrayed biomolecola cella-funzionalità utilizzando più tipi di cellule. Si noti che solo le cellule aderenti sono compatibili con gli array; Inoltre, l&#39;adesione ad array dipende sia proprietà specifiche delle celle (ad esempio, integrina profilo di espressione) e le proteine ECM selezionati. A causa di spazio limitato, non abbiamo fornito una vasta trattamento di disegno matrice, il layout e la fabbricazione qui e di rimandare il lettore a lavori precedenti 23, 25. Usiamo generalmente 100 sottoarray Spot (150 micron di diametro posto, 450 micron da centro a centro distanza) composti da 10-20 condizioni di biomolecole unici (cioè, 5-10 punti / condizione). Il numero di sotto-array in un array varia a seconda del numero di condizioni biomolecole di interesse, che può essere scalata comodamente fino a 1.280 su un 25 x 75 mm di traslazione microscopio (~ 6.400 punti in 64 sottoarray)xref &quot;&gt; 25, 31 I parametri sopra ulteriormente variare a seconda delle dimensioni del motivo di interesse;. perni atti a generare i motivi da 75 - 450 micron sono facilmente disponibili. esperimenti di array sono meglio integrate da validazione di alta punteggio condizioni schierati di interesse utilizzando altri formati di cultura, letture di analisi e sistemi modello biologico. In particolare, si consiglia di un&#39;ulteriore validazione effetti di selezionare le condizioni disposte utilizzando colture di massa in combinazione con tecniche di biologia molecolare standard (ad esempio, qRT-PCR, immunoblotting) o di serie TFM. La manipolazione genetica (ad esempio, l&#39;abbattimento o sovraespressione) del fattore di interesse per un adeguato sistema di modello biologico può anche servire per confermare gli effetti osservati negli array. In vivo modelli animali rappresentano un altro mezzo di convalida e sono stati recentemente utilizzati, per esempio, per confermare il ruolo centrale di galectin-3 e galectin-8il tumore del polmone metastatico nicchia, come inizialmente identificato tramite microarray cella 31, 49. Un certo numero di altri metodi sono stati usati per sondare regolazione microambientali di funzioni cellulari, compresa una varietà di bidimensionali sistemi microfabbricati 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 e tridimensionali sistemi biomateriale ingegnerizzati 56, 57, 58 , 59, 60, 61. In confronto con altri metodi, i particolari vantaggi della piattaforma microarray cellule descritte qui costituiti da: (1) produzione finocentinaia o migliaia di diverse combinazioni di fattori, consentendo analisi degli effetti di interazione; (2) accessibili, imaging e analisi automatizzata; (3) l&#39;integrazione di entrambe le letture biochimici e biofisici con presentazione controllata di fattori schierati; (4) capacità di variare le proprietà del materiale del substrato; e (5) l&#39;analisi singola cella ad alta contenuto di destino delle cellule e la funzione. In sintesi, la combinazione di microarrays cellulari con TFM su substrati di sintonizzabile rigidità substrato consente caratterizzazione approfondita dei segnali biochimici e biofisici. Come presentato qui, questa piattaforma è generalizzabile e può essere facilmente applicata ad una varietà di tipi di cellule aderenti e dei contesti di tessuto verso una migliore comprensione della regolazione microambientali combinatoria di differenziazione cellulare e meccanotrasduzione.

Le interazioni tra cellule e fattori circostanti microambiente mediare una grande varietà di processi biologici durante lo sviluppo, l&#39;omeostasi, e patogenesi della malattia 1, 2, 3, 4. Queste interazioni microambientali includono la consegna di fattori solubili alle cellule, vincolante cellula-matrice, e le interazioni cellula-cellula tramite legame ligando-recettore. In aggiunta alle considerazioni biochimiche precedenti, i parametri biofisici, come le proprietà meccaniche del substrato (ad esempio, il modulo di Young, porosità) e la forma delle cellule, e meccanotrasduzione valle associati hanno sempre ottenuto il riconoscimento come mediatori chiave del differenziamento cellulare 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. I segnali derivanti da tali interazioni microambientali servono come input per reti geniche e vie di segnalazione. Inoltre, questi componenti cellulari intrinseca anche fornire un feedback al microambiente tramite fattori secreti ed enzimi che degradano matrice, completando un ciclo di coregolamentazione complesso tra i programmi genetici di cellule-intrinseca e dei fattori del microambiente delle cellule-estrinseca 5, 11, 12. L&#39;utilizzo di sistemi ingegnerizzati per la presentazione controllata di fattori microambientali è dimostrato utile in una varietà di contesti diversi 13, 14, 15. Sistemi di microfabbricazione, in particolare, hanno facilitato preciso patterning spaziale delle proteine e cellule, nonché l&#39;analisi altamente parallelo tramite la miniaturizzazione 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Microarrays cellulari rappresentano un tale sistema microfabbricazione in cui combinazioni di biomolecole sono contatti stampati su una poliacrilammide idrogel elastica substrato 23, 24, 25. L&#39;inclusione di componenti cellulari-adesivo (cioè proteine ​​della matrice) consente l&#39;adesione sostenuta delle cellule e la cultura su microarray, che è spesso seguita da analisi a valle tramite immunocitochimica e giornalisti fluorescenti. Microarrays cellulari sono stati produttivo orientato verso il raggiungimento di una migliore comprensione del fenotipo delle cellule del fegato 23, 26, neural precursore differenziazione 27, Mammardecisioni y progenitore destino 28, sulle cellule staminali embrionali di manutenzione / differenziazione 23, 29, 30, cancro al polmone metastasi 31, e la risposta terapeutica nel melanoma 32. Abbiamo recentemente dimostrato l&#39;utilizzo di microarray cellulari per definire il ruolo di matrice extracellulare (ECM) composizione proteica nella specifica endoderma 33, fegato progenitore differenziazione 34, 35, e tumori polmonari risposta farmacologica cellule 36. In questi lavori, ci siamo concentrati sulle estendere le capacità combinatorie della piattaforma matrice e ad esplorare le intersezioni di segnalazione cellulare-intrinseco con la composizione della matrice extracellulare e della biomeccanica. Inoltre, abbiamo implementato letture biofisici in questa piattaforma matrice per fornire la capacità di quantitativamente caratterize il ruolo della contrattilità cellulare nel differenziamento elabora 35. Per fare ciò, abbiamo integrato la forza di trazione microscopia (TFM) con microarray cellulari per consentire la valutazione high-throughput di trazione cellule generate. TFM è un metodo ampiamente utilizzato per misurare le forze di trazione cellule generate e fornisce analisi significative circa il coordinamento di singola cellula e la funzione a livello dei tessuti con la composizione e biomeccanica del microambiente locale 37, 38, 39, 40. Così, combinando TFM con microarray cellulari fornisce un sistema high-throughput per la misura chiave, fisiologicamente rilevanti parametri biofisici. La piattaforma microarray cellule qui descritto si compone di quattro sezioni: la fabbricazione di substrati poliacrilammide, fabbricazione di array, colture cellulari e test di lettura e analisi dei dati. VedereFigura 1 per una sintesi schematica delle prime tre sezioni sperimentali; vedi figura 2 per una sintesi schematica della sezione finale con una particolare attenzione per l&#39;analisi dei dati di immunofluorescenza. Al fine di adattare la piattaforma microarray cella per studi di biomeccanica interazioni cellula-substrato, abbiamo utilizzato substrati poliacrilammide di sintonizzabile modulo di Young ma porosità simili, per Wen et al. 41. Per consentire misurazioni TFM delle forze esercitate da cellule sulla loro substrato, abbiamo implementato un Petri formato piatto fondo di vetro in aggiunta al microscopio in vetro spessore diapositive frequentemente utilizzata da altri gruppi. Così, questa piattaforma microarray cellulare è in grado di misurazioni parallele di differenziazione cellulare tramite immunofluorescenza su vetrini da microscopio e le forze di cellule generate tramite TFM sui piatti con fondo di vetro separate. Abbiamo inoltre applicato diversi miglioramenti per l&#39;approccio analitico comunemente utilizzato con microarrays di cellule. specificalmente, invece di parametrico Z-scoring di intensità complessiva dell&#39;isola, si misura l&#39;intensità cella singola e applicare la normalizzazione quantile al fine di tenere conto di distribuzioni non normali e più accuratamente descrivere il comportamento cellulare. Riteniamo che questi miglioramenti forniscono particolare utilità nei confronti indagini dei processi biologici in cui spunti sia biochimici e biofisici giocano importanti ruoli, che si intersecano. Inoltre, i nostri miglioramenti analitici consentono l&#39;applicazione di microarray cellulari per gli studi di una serie di funzioni cellulari per i quali a cella singola e il comportamento a livello di popolazione divergono.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4433</td>
			<td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; penicillin&#8211;streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22&#215;60 mm coverglasses</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>63765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159</td>
			<td>Store under inert gas per manufacturer&#39;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td>Cell E&#38;G</td>
			<td>GBD00002-200</td>
			<td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1823-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well polystyrene microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>08-115MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen III, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker, 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1841</td>
			<td>Used as a marker for array location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (HyClone)</td>
			<td>SH3001302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5026-DL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-40A-0145-C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant JAG1, rat</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>599-JG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope, inverted</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 &#176;C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure 2959</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td>55047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin, mouse</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>GenePix</td>
			<td>4000B</td>
			<td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarrayer</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td>Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 25&#215;75 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X25</td>
			<td>~0.9&#8211;1.1 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A/G, recombinant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex drying tray, 2000 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-242B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4-chambered culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific (Nunc)</td>
			<td>12-565-495</td>
			<td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin for arraying</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&#8211;450 microns) as suited to your particular application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

microarrays cellulari microfabbricazione, che consistono in combinazioni di contatti stampati di biomolecole su una superficie elastica idrogel, forniscono un elevato throughput di sistema ingegnerizzato strettamente controllato per misurare l&#39;impatto dei segnali biochimici schierati sulla differenziazione delle cellule. I recenti sforzi utilizzando microarray di cellule hanno dimostrato la loro utilità per gli studi combinatorie in cui molti fattori microambientali sono presentati in parallelo. Tuttavia, questi sforzi si sono concentrati principalmente sulla studio degli effetti di segnali biochimici su risposte delle cellule. Qui vi presentiamo una piattaforma microarray cella con le proprietà del materiale regolabili per valutare sia la differenziazione cellulare mediante immunofluorescenza e biomeccanico cellula-substrato interazioni con la forza di trazione microscopia. Per fare questo, abbiamo sviluppato due diversi formati utilizzando idrogel di poliacrilamide di varia il modulo di Young fabbricato su entrambi i vetrini da microscopio o piatti con fondo di vetro Petri. Forniamo best pratiche e risoluzione di problemi per la realizzazione di microarray su questi substrati idrogel, la successiva coltura cellulare su microarray, e l&#39;acquisizione di dati. Questa piattaforma è particolarmente adatto per l&#39;utilizzo nelle indagini di processi biologici per i quali sia biochimica (ad esempio, la composizione della matrice extracellulare) e biofisica (ad esempio, il substrato rigidità) spunti possono svolgere significativo, si intersecano ruoli.

Utilizzando questa piattaforma, abbiamo studiato il ruolo di entrambi i segnali biochimici e biofisici nella specifica sorte dei progenitori del fegato 34, 35. Proteina A / G Notch coniugato ligandi hanno mostrato una migliore ritenzione e il clustering in idrogel di poliacrilamide (figura 3A) e sono stati, inoltre, in grado di pilotare la differenziazione dei progenitori del fegato verso un destino delle cellule del dotto biliare (Figura 3B). Utilizzando l&#39;analisi singola cellula, abbiamo quantificato la risposta ai ligandi Notch per le proteine ECM collagene, collagene III, collagene IV, fibronectina e laminina (Figura 3C), trovando che la risposta dei progenitori epatici al ligando dipende anche dalla contesto ECM. Ultimo, abbiamo utilizzato shRNA atterramento di generare progenitori epatici senza i ligandi DLL1 e JAG1. La risposta al ligando Notch schierati variava a seconda del presence di entrambi ligando, confermando che la risposta allo ligando cellulare estrinseco è anche una funzione dell&#39;espressione ligando cellulare intrinseca (Figura 3D). Inoltre, abbiamo osservato una sottopopolazione distinto di doppio-positivo (ALB + / + OPN) cellule nel atterramento DLL1 (Figura 3D). Insieme, questi risultati mostrano rappresentative: (1) le capacità combinatorie del formato array, come esemplificato dalla coppia di molteplici schierati proteine ​​ECM e ligandi Notch con l&#39;atterramento di singoli leganti; (2) la funzionalità non solo schierato proteine ​​ECM ma anche schierato ligando cellula-cellula con Proteina A / coniugazione G-mediata; e (3) l&#39;attuazione della nostra analisi singola cellula e la sua capacità di discernere sottopopolazioni unici. Abbiamo anche osservato che la differenziazione di progenitori epatici dipende sia la rigidità del substrato e la composizione ECM (Figura 4A </str<html> ong&gt;), in particolare trovando che il collagene IV è favorevole differenziazione su supporti morbidi e rigidi, mentre fibronectina supporta solo differenziazione su substrati rigidi (Figura 4B). Mappe di calore di misurazioni rappresentative TFM ha suggerito che lo stress prolungato di trazione a bassa rigidità del substrato sul collagene IV provocato differenziazione in cellule del dotto biliare (Figura 4C), un risultato confermato da valori medi di root-mean-square (Figura 4D). Insieme, questi risultati mostrano rappresentative: (1) il successo dell&#39;integrazione di TFM con microarrays di cellule su substrati con una rigidità sintonizzabile per valutare sia il fenotipo cellulare e lo stress di trazione; (2) il coordinamento del destino cellule progenitrici epatiche sia con la composizione della matrice e la rigidità del substrato; e (3) l&#39;attuazione della nostra analisi e tipici profili di stress trazione TFM in microarray cellulari. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Schema che mostra le prime tre sezioni sperimentali. Nella sezione 1, substrati di vetro vengono puliti e silanizzate per facilitare la realizzazione di idrogel di poliacrilamide. Nella sezione 2, le combinazioni di biomolecole di interesse sono preparati in una micropiastra fonte 384 pozzetti. Un Arrayer robotica viene poi caricato con perni pulito, la micropiastra fonte e gli idrogel di poliacrilamide e inizializzato, fabbricare le matrici sulle idrogel. Nella sezione 3, le cellule vengono seminate su domini Arrayed e ha permesso di aderire, al termine del quale viene eseguito il protocollo di cultura di interesse. Al punto finale, le cellule sono fissate per immunoistochimica / immunofluorescenza o analizzati utilizzando TFM. Barre di scala sono 75 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> entro-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Figura 2: elaborazione ed analisi dei dati da immunofluorescenza Array. (A) piastrella, immagini RGB composito a 32 bit vengono prima cestinate e poi suddiviso in singoli canali a 8 bit. Utilizzando una combinazione di marcatori fluorescenti disposte e isole cellulari, sono identificati tre angoli della matrice per consentire l&#39;orientamento automatico e gridding degli array. (B) di dati Single-cellula è generato per ogni canale delle matrici di ingresso. Al fine di tenere conto di deriva sperimentale, la normalizzazione quantile viene applicata da replicare biologica, la produzione di un singolo di distribuzione condivisa in tutte le repliche. Quantile dati normalizzati viene successivamente tracciata ed interpretato tramite calcolo delle misure Ensemble (ad esempio, cellule / isola, intensità media, le cellule percentuale positiva per un etichetta) o di analisi diretta di distribuzioni unicellulari.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Figura 3: Notch Ligand Presentazione Mediazione di fegato Progenitor differenziazione. (A) ligandi Notch Fc-ricombinante Jagged-1 (JAG1) e Delta-simile 1 (DLL1) espone una migliore ritenzione e il clustering, quando schierato con proteina A / G. barra della scala è di 50 micron. Progenitori (B) del fegato differenziate in cellule del dotto biliare al momento della presentazione con Notch ligando. 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) è un marchio di nucleare, l&#39;albumina (ALB) è un marker delle cellule epatiche, e osteopontina (OPN) è un marker biliare cellule del condotto. barra della scala è di 150 micron. (C) Quantificazione della percentuale di cellule positive per OPN per i ligandi Notch JAG1, DLL1, e Delta-like 4 (Dll4) sulle proteine ECM collagene I, collagen III, IV collagene, fibronectina e laminina. T -test di Student sono state eseguite contro IgG di controllo per ogni ligando Notch disposte all&#39;interno di ogni proteina ECM con valori di p indicato per P &lt;0,05 (*). (D) Imaging citometria di ALB e OPN per le cellule su collagene III presentati con i ligandi Notch JAG1, DLL1, e Dll4. Progenitori fegato senza il Notch ligandi DLL1 e JAG1 (vale a dire, shDll1 e shJag1) sono stati generati utilizzando shRNA atterramento. Dati in (C) presentati come media ± sem Questa figura è stata modificata da Kaylan et al. 34. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Figura 4: Matrice Composizione e substrato Rigidità Coordinate Fegato Progenitor differenziazione. (A) differenziazione fegato progenitrici biliari cellule del dotto dipende sia composizione ECM e substrato rigidità. DAPI è un&#39;etichetta nucleare, ALB è un marker delle cellule epatiche, e OPN è un marcatore biliare cellule del condotto. (B) Quantificazione della percentuale di cellule positive per OPN su substrati di modulo di Young 30 kPa, 13 kPa, e 4 kPa per il collagene I (C1), collagene IV (C4), fibronectina (FN), e tutti bidirezionali combinazioni di quelle proteine ​​ECM. (C) lo stress cellulare trazione dipende sia rigidità substrato e la composizione ECM. (D) Quantificazione dei valori root-mean-square di stress di trazione su substrati di modulo di Young 30 kPa e 4 kPa per il collagene I (C1), il collagene IV (C4), fibronectina (FN), e tutte le combinazioni a due vie di coloro proteine ​​ECM. In (B) e (D), i dati sono stati presentati come media ± SEM e allievo di t -testsono stati eseguiti contro 30 kPa per ogni combinazione ECM con valori di P indicato per P &lt;0,05 (*), P &lt;0,01 (**), e P &lt;0.001 (***). Barre di scala sono 50 micron. Questa cifra è stata modificata da Kourouklis et al. 35. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Sezione </td><td fo:width="1.5in"> Problema </td><td fo:width="1.5in"> possibili cause </td><td> Soluzione </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. Realizzazione di Polyacrylamide substrato. </td><td> Coprioggetti non può essere rimosso da idrogel. </td><td> Overpolymerization. </td><td> Ridurre il tempo di polimerizzazione a &lt;10 minuti (4 W / m 2). Controllare che crossli UVuscita nker è nel raggio d&#39;azione previsto. </td></tr><tr><td> Povero polimerizzazione poliacrilammide idrogel. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Aumentare il tempo di polimerizzazione a&gt; 10 minuti (4 W / m 2). Controllare che l&#39;uscita reticolante UV si trova nel raggio previsto. </td></tr><tr><td> idrogel poliacrilammide sono danneggiati dopo la rimozione del coprioggetti. </td><td> idrogel poliacrilammide morbide sono facili da danneggiare. </td><td> Osserviamo diminuendo la resa idrogel fabbricazione (~ 50%) per il più morbido (ad esempio, 4 kPa) idrogeli in particolare. Maneggiare idrogel delicatamente e aumentare il numero di partenza per raggiungere il rendimento desiderato. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. Realizzazione di array. </td><td rowspan="2"> Scarsa o incoerenti morfologia posto. </td><td> funzione di umidificatore incoerente. </td><td> Controllare che umidificatore e reometro un funzionale nel corso di ogni tiratura e di mantenere il 65% di umidità relativa. </td></tr><tr><td> Pins bloccato in testina o intasareGED. </td><td> Pulire la testina di stampa per consentire il movimento del perno libero. perni Pulire accuratamente prima o dopo ogni tiratura per rimuovere aggregati dai canali pin. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. cellulare cultura e test di esecuzione. </td><td rowspan="2"> il distacco delle cellule morte o sugli array dopo il collegamento iniziale. </td><td> Semina e la proliferazione eccessiva. </td><td> Ridurre la densità di semina iniziale e il tempo. Utilizzare &quot;manutenzione&quot; o media &quot;differenziazione&quot; durante la cultura di matrice per ridurre la proliferazione cellulare. </td></tr><tr><td> Rilascio di monomero acrilammide tossici idrogel. </td><td> Immergere idrogel in dH 2 O per almeno 3 d per permettere la diffusione / rilascio di acrilammide monomero e ridurre la tossicità cellulare. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Le cellule non attribuiscono ad array. </td><td> Underseeding. </td><td> Aumentare la densità di semina iniziale e il tempo. Utilizzare un tipo di cellula più fortemente aderente. </td></tr><tr><td> Scarsa deposizione dimatrix o condizione biomolecole. </td><td> Pulire perni di particelle e aggregati, confermano i parametri di stampa, e valutare individuazione di marcatori fluorescenti, ad esempio, rodamina-destrano coniugato. </td></tr><tr><td> Specificità delle interazioni cellula-matrice. </td><td> Differenti tipi di cellule aderiscono specificamente per alcuni, ma non altre proteine ​​ECM. Prova più proteine ​​ECM differenti con le vostre cellule. </td></tr><tr><td> Storage Array non ottimale dopo la fabbricazione. </td><td> Si consiglia di conservare le matrici fabbricati durante la notte a 65% di umidità relativa e temperatura ambiente, in parte per evitare cambiamenti di fase durante il congelamento. L&#39;adesione cellulare è sensibile sia umidità, temperatura e tempo di conservazione; assicurarsi che questi parametri siano coerenti / ottimizzati per i vostri esperimenti. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Il distacco di idrogel dal substrato di vetro durante la coltura cellulare. </td><td> pulizia scivolo poveri e silanizzazione. </td><td> Sostituire le soluzioni di lavoro per la pulizia e la slittasilanizzazione. </td></tr><tr><td> idrogel Overdehydrated. </td><td> Non lasciare idrogel disidratanti su un piatto caldo per più di 15-30 minuti. </td></tr><tr><td> 4. Analisi dei dati. </td><td> Alta variabilità tra i punti replicare e diapositive. </td><td> La variabilità della matrice fabbricazione. </td><td> Controllare che i perni e le testine di stampa siano puliti. Confermare la funzione umidificatore. Visualizzare e quantificare posto e la matrice qualità utilizzando marcatori fluorescenti. array conservarlo come raccomandato sopra. </td></tr></tbody></table> Tabella 1: risoluzione dei problemi.

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A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

differenziazione delle cellule è regolata da una serie di fattori microambientali, tra cui entrambe le proprietà composizione della matrice e materiale del substrato. Descriviamo qui una tecnica che utilizza microarrays di cellule in combinazione con una forza di trazione microscopio per valutare sia la differenziazione cellulare e biomeccaniche interazioni cellula-substrato in funzione del contesto microambientali.

Una piattaforma cellulare microarray high-throughput per l&#39;analisi correlativa cellulare Differenziazione e forze di trazione

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K Views.  University of Illinois at Urbana–Champaign.  differenziazione delle cellule è regolata da una serie di fattori microambientali, tra cui entrambe le proprietà composizione della matrice e materiale del substrato. Descriviamo qui una tecnica che utilizza microarrays di cellule in combinazione con una forza di trazione microscopio per valutare sia la differenziazione cellulare e biomeccaniche interazioni cellula-substrato in funzione del contesto microambientali. 

Video: A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Ricerca

Bioingegneria

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcapsule di alginato come piattaforma 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) per diverse linee

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays polimerici per Discovery High Throughput di Biomateriali

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

High-throughput generatore di espressione delle proteine ​​Utilizzando una piattaforma microfluidica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

High Throughput singola cellula e cellula Multiple-Micro-incapsulamento

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Microscopia correlativa per l&#39;analisi strutturale 3D di Interazioni Dinamiche

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

Una piattaforma automatizzata versatile per micro-scala Cellulari esperimenti di stimolazione

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

Una piattaforma Novel Stretching per applicazioni in cellule e tessuti mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Un nuovo metodo per la localizzazione Reporter perline fluorescenti vicino alla superficie coltura cellulare per la trazione microscopia a forza

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...