The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.

Tutte le procedure sugli animali eseguiti in questo studio sono approvati dalla Keio University Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC - numero di omologazione: 09221) e seguire le linee guida istituzionali sulla sperimentazione animale presso la Keio University per l&#39;utilizzo degli animali nella ricerca. campioni umani sono stati isolati da un cadavere donato al Dipartimento di Anatomia, Keio University School of Medicine, e sono stati utilizzati in conformità con le normative istituzionali. 1. Isolamento di Auditory Bulla e Capsule <ol><li> Euthanize topi in un vaso contenente una piattaforma sopra asciugamani di carta imbevuti di isoflurano o sevoflurano fino ventilazione respiratoria cessa per più di un minuto e quindi eseguire dislocazione cervicale. Fare attenzione a evitare il contatto diretto dei topi con i tovaglioli di carta imbevuti. </li><li> Effettuare una piccola incisione trasversale al lato dorsale del collo e tirare la pelle a parte verso la testa e la coda utilizzando entrambe le mani per esporre sottostante mu collotessuto SCLE. </li><li> Decapitare topi alla regione cervicale con 14 cm forbici chirurgiche taglienti. </li><li> pelle a buccia completamente verso il naso. Tagliare tutta la pelle insieme con il muso e incisivi. </li><li> Inserire le forbici in bocca e tagliare i muscoli masseteri su entrambi i lati. </li><li> Aprire la ganascia attentamente e rimuovere la lingua e la mascella inferiore insieme. </li><li> Utilizzando forbici affilate, cranio spaccato e base del cranio in due metà lungo il piano sagittale mediano (Figura 1A, B). </li><li> Utilizzando pinze, rimuovere gli emisferi cerebrali e cerebellari e del tronco cerebrale. La bulla uditivo e la capsula si trovano lateralmente al cervelletto e tronco cerebrale. Si noti che la bolla uditiva è anche lateralmente alla capsula uditivo (Figura 1C, D). </li><li> Sezionare la bulla e capsula con il circostante ossa del cranio (Figura 1E). </li><li> Trasferire la provetta in un piatto contenente fosfato-Buffered Saline (PBS) pH 7,4 a temperatura ambiente. </li><li> Under una dissezione microscopio binoculare, usare il forcipe per separare le ossa e le forbici per tagliare circondano il confine allentato attorno alla bulla e la capsula (Figura 1F). Le ossa che circondano rimossi sono il basioccipital (confine ventrale), exoccipital (ventro-posteriore confine), sopraoccipitale (bordo posteriore), interparietale, parietale (dorsale di confine), squammoso (confine dorso-anteriore), alisphenoid (bordo anteriore), e basisfenoide (confine antero-ventrale) ossa. Si noti che il processo styliform (Sp), che sostiene l&#39;apertura timpanica del tubo di Eustachio 41, è distinto dal processo stiloideo dell&#39;osso temporale. </li></ol> 2. Isolamento di Auditory Ossicini: martello, incudine e la staffa <ol><li> Martello <ol><li> Con entrambe le piccole forbici e pinze, rimuovere la parte del canale laterale uditivo esterno al tympanicus solco in modo che la membrana timpanica è visibile (Figura 2A, B). </li><li> Rimuovere parte della membrana timpanica e l&#39;osso timpanica vicino al malleal processus brevis (apofisi orbicolare, vedi la discussione), sia a livello ventrale (tratteggiata) e posteriore (#) pareti (Figura 2C). Il muscolo tympani martello e tensore dovrebbe ora essere esposta (Figura 2D, E). </li><li> Sollevare il martello (Figura 2F) e tagliare il muscolo tensore del timpano con il bordo smussato di un ago G 27 (Figura 2G). Si noti che il manubrio malleal attacca saldamente alla membrana timpanica, come si vede in altri mammiferi. </li><li> Staccare la membrana timpanica con cura dal manubrio, che è fragile. Rimuovere l&#39;osso timpanica per rivelare i tre ossicini. </li><li> Dislocare il martello dal incudine in corrispondenza della giunzione degli ossicini (Figura 2H). </li><li> Isolare il martello dalla frattura del processo anteriore al goniale. </li></ol></li><li> Incudine e staffe <ol><li> isolare tegli incudine tagliando il legamento posteriore del dell&#39;incudine a breve crus (Figura 3A). </li><li> Isolare staffa tagliando l&#39;arteria stapediale prossimità della staffa con il bordo smussato di un ago G 27 (Figura 3B, C). Se necessario, tagliare il tendine del muscolo stapediale il processo muscolare della staffa con l&#39;ago. </li><li> Inserire un ago per cucire (o uno spillo marcatura) nei forame otturatorio della staffa e sollevare la staffa. Dopo aver rimosso la staffa, l&#39;apertura finestra ovale deve essere chiaramente visibile (Figura 3D). </li></ol></li></ol> 3. Integrazione di Auditory Bulla e Capsule <ol><li> Preparazione per l&#39;incorporamento in blocchi di paraffina <ol><li> Isolare la bulla e la capsula come descritto nella Sezione 1. </li><li> Tagliare l&#39;estremità anteriore della bolla (il processo styliform) al largo con le forbici, immergere la bulla e la capsula nel 4% paraformaldeide (PFA) in PBS a 4 °C, e consentire fissativo per entrare nel bulla. Se l&#39;aria rimane intrappolata nella bolla, rimuoverla con un ago e la siringa. Lasciare la bulla e capsule nel fissativo a 4 ° CO / N su un rotatore tubo. Attenzione: PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura. </li><li> Risciacquare una volta con PBS. </li><li> Decalcificare bulla e capsule per una settimana a 4 ° C in 10% etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato (EDTA-2Na), 100 base mM Tris, pH 7,0, in un tubo 2 mL. Modificare il buffer di ogni altro giorno. </li><li> Risciacquare una volta con PBS. I campioni possono essere conservati in etanolo al 70% in acqua a 4 ° C. Facoltativamente, il trasferimento al 70% di etanolo attraverso una serie graduata di alcool (30%, 50%, 70% in acqua). </li><li> Su un processore tessuto, disidrata esemplari in una serie graduata di soluzioni di etanolo (70%, 2x 95%, 3x 100%, ogni 1 h), xilene (4x, ogni 1 ora a 40 ° C), e infiltrarsi provini con cera di paraffina fusa 42. Opzionalmente, xilene sostituto con clearin tessuto commercialesoluzione g (per esempio, Histo-Clear). </li><li> Scaricare esemplari dal processore, e rimuoverli dalle loro cassette. </li><li> Su un sistema console tessuto embedding, luogo campioni in stampi riempiti di paraffina fusa. Procedere alla embedding (sezione 4). </li></ol></li><li> Preparazione per l&#39;incorporamento in blocchi congelati (metodo film di Kawamoto) 43 <ol><li> Isolare la bulla e la capsula come descritto nella Sezione 1. </li><li> Tagliare l&#39;estremità anteriore della bolla (il processo styliform) con forbici, immergere il bulla e capsule in fissativo (2% o 1% PFA anziché 4% in PBS per preservare antigenicità) a 4 ° C. Se l&#39;aria è intrappolato in bulla, rimuoverlo usando un ago e la siringa. Lasciare la bulla e capsule nel fissativo a 4 ° CO / N su un rotatore tubo. </li><li> Lavare bulla e la capsula rapidamente in PBS e subito immergere in compound crio-embedding liquido a 4 ° C. </li><li> Importante: rimuovere le bolle d&#39;aria eventualmente in mezzoed orecchio esterno attraverso l&#39;aspirazione da un ago, e aggiungendo il composto incorporamento con una pinza. Procedere alla embedding (sezione 4). </li></ol></li></ol> 4. Orientamento del campione e Embedding NOTA: L&#39;intero bulla e la capsula devono essere disposti in un particolare orientamento durante l&#39;incorporamento di tagliare sezioni desiderate. Le procedure descritte di seguito vengono utilizzate per la sezione martello in diversi orientamenti. <ol><li> Longitudinale (parasagittale) sezionamento del martello <ol><li> Mettere la parte laterale della bolla o condotto uditivo esterno basso in paraffina calda (o di composti crio-embedding). Regolare l&#39;orientamento in modo che il collo e trasversale lamina del martello sono parallele al fondo orizzontale del piatto incorporamento (Figura 4A - C). Si noti che la membrana timpanica è inclinata di un angolo di circa 30 ° rispetto alla verticale nella testa del mouse (Figura 4A; la figura 59 in Kampen <sup&gt; 44). </li></ol></li><li> Sezionamento orizzontale del martello <ol><li> Posizionare la cresta dorsale orizzontalmente in paraffina calda (o di composti crio-embedding). Regolare l&#39;orientamento della bolla e della capsula in modo che il collo e trasversale lamina del martello sono perpendicolari al fondo del piatto incorporamento (Figura 4D - F). </li></ol></li><li> Sezionamento frontale (sezioni) del manubrio e della membrana timpanica 5 <ol><li> Posizionare il manubrio malleal in paraffina calda (o di composti crio-embedding) tale che è perpendicolare al fondo del piatto incorporamento. </li></ol></li><li> Raffreddare il blocco a temperature adeguate per indurire paraffina su un sistema di console tessuto embedding (in alternativa, composto crio-embedding in ghiaccio / vasca esano secco). </li><li> blocco dei tessuti di processo e sezioni tagliate utilizzando procedure di routine. Ad esempio, le sezioni macchia paraffina con ematossilina e eosina (H &amp; #38; E), safranina O (per la cartilagine), o per il tartrato resistente attività fosfatasi acida (TRAP) (per osteoclasti) 3, o mediante immunoistochimica. Criosezioni Undecalcified sono adatti per l&#39;etichettatura delle ossa utilizzando fluorocromi 14, alizarin colorazione rosso per il calcio, ed immunofluorescenza 42. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Qui, vi presentiamo un metodo utile per isolare la bulla uditivo e la capsula nei topi postnatale. Prima di P12, i tessuti sono fragili e possono essere danneggiati durante l&#39;isolamento. Dopo P12, la bulla uditivo e capsule possono essere facilmente isolati dai tessuti circostanti. Sezionare la bulla dalla testa prima di sezionamento ha diversi vantaggi. In primo luogo, la cavitazione e la crescita della bolla uditiva postnatale si verificano più attivamente dal P6 in poi e sono completi da P14 50. Il tessuto mesenchimale tra la membrana timpanica e la parete cocleare viene sostituita da aria attraverso il processo di cavitazione. L&#39;aria risultante nella cavità dell&#39;orecchio medio può impedire il contatto tra i tessuti e liquidi durante la fissazione, decalcificazione e incorporamento. E &#39;più facile per eliminare l&#39;aria dal bulla uditivo isolato tagliando la fine (processo styliform) anterior piuttosto che cercare di farlo nel bulla non isolato. In secondo luogo, l&#39;orientamento del martello (e la membrana timpanica) non è verticalenella testa. È quindi più facile da parte del martello in piani desiderati incorporando isolate bulla uditivo e capsule in un determinato orientamento. Una volta isolato, bulla uditivo e le capsule sono utili per numerose analisi. Ad esempio, alta risoluzione a raggi X micro-CT può rivelare osso microstruttura morfologia come capillari osteogeniche del martello 14. Il stereofluorescence dissezione microscopio è un potente strumento per visualizzare le strutture nella valutazione topi indicatori che esprimono proteine fluorescenti nell&#39;orecchio medio o interno 33. Inoltre, vari in vivo o ex vivo fluorescenza metodi di etichettatura e di tutta la rilevazione immunofluorescenza monte possono essere intraprese. Luce microscopia a fluorescenza con è utile anche per l&#39;analisi tridimensionale 51. Anche se qui non descritto, diverse strutture anatomiche associate con la bolla uditivo e capsule come nervi periferici, vasi sanguigni, ela membrana timpanica nell&#39;orecchio medio può anche essere valutata utilizzando questo protocollo. Si noti che la paraffina sezionamento richiede la decalcificazione di tessuti ossei prima di incorporare e quindi non consentire l&#39;analisi di mineralizzazione. Al contrario, il metodo pellicola Kawamoto 43 utilizzato per preparare sezioni congelate può essere eseguita senza la decalcificazione ed è adatto per studi di mineralizzazione utilizzando tecniche in osso-etichettatura vivo o schegge speciali come alizarina colorazione. condizioni di Cryo-sezionamento devono essere ottimizzati in funzione in base all&#39;età del mouse. Ad esempio, una temperatura meno fredda all&#39;interno della camera criostato è raccomandato per esemplari più vecchi mouse per minimizzare i danni alle sezioni. Nel topo, il termine corretto per la sporgenza di primo piano semi-sferica del martello è &quot;apofisi orbicolare&quot;. Tuttavia, il termine &quot;processus brevis&quot; è stato ampiamente utilizzato per indicare all&#39;apofisi orbicolare per più thun ventennio, in particolare tra il mouse biologi dello sviluppo 16,20,22-25. &quot;Processus brevis&quot;, originariamente riferito al processo laterale (processus lateralis), che si differenzia dal apofisi orbicolare. Negli esseri umani, un processo laterale simile a una leggera sporgenza conica costituisce la linea generale di attacco alla membrana timpanica, che si estende dal manubrio (non visibile in figura 6B, vista mediale). Nei topi, il processo laterale è anche una proiezione del manubrio all&#39;estremità opposta al umbone 48. I pars flaccida della membrana timpanica è al di sopra del processo laterale del martello. apofisi orbicolare non è evidente nel martello umano.

I tre ossicini dell&#39;orecchio medio, vale a dire i martello, incudine e staffa, formano una catena uditivo-specific mammiferi che trasmette il suono dalla membrana timpanica all&#39;orecchio interno, o coclea 1,2. La funzione uditiva può essere valutata in topi misurando Auditory Brainstem Response (ABR) soglie 3-6, e le vibrazioni del martello dietro la membrana timpanica può essere monitorato tramite Laser Doppler Vibrometry (LDV) 7. Grazie alla combinazione di ABR, LDV, e misure di distorsione del prodotto Otoacoustic Emission (DPOAE), ipoacusia trasmissiva può essere discriminato da compromissione neurosensoriale 8. Modelli animali di condizioni per le orecchie sono necessari, data l&#39;importanza di ascoltare e di salute orecchio per il benessere dei pazienti di tutte le età. Ad esempio, l&#39;otite media è una infezione dell&#39;orecchio molto comune visto nei neonati e nei bambini umani, e gravi, otite media acuta e le sue complicazioni può verificarsi se il Condizione non è trattato con antimicrobici appropriati 9. Modelli murini di otite media potrebbero rivelarsi utili per la comprensione della patogenesi e nello sviluppo di trattamenti 10,11. Ossicini murini, che (ad eccezione della parte goniale del martello) sono formate da encondrale 12,13, sono molto importanti per lo studio del metabolismo osseo e la morfogenesi. Innanzitutto, le loro piccole dimensioni permette l&#39;analisi ad alta risoluzione di ossa con periostio intatti utilizzando raggi X o la microscopia a fluorescenza 14. In secondo luogo, il metabolismo osseo aberranti, come eccessiva o carente riassorbimento osseo, o interazioni con problemi tra le cellule ossee 15, può essere analizzato come un potenziale contributo alla perdita dell&#39;udito 3,4,7. In terzo luogo, anormale morfogenesi ossicino è riportato in diversi topi gene-deficienti, come gli animali privi Hoxa2 16-19, 20-22 Msx1, Prrx1 23, Goosecoid(GSC) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, FGFR1 29, recettore degli ormoni tiroidei (THRA, Thrb) 5, Bcl2 30 e altri 1,31, o nei topi che iperesprimono Hoxa2 32. Infine, nonostante le loro piccole dimensioni, le strutture associate a ossicini come i muscoli e le articolazioni 33 34,35 sono accessibili. ossicini del mouse sono più piccoli ossicini umani, ma è da notare che l&#39;orecchio centrale del mouse non è una versione in miniatura della sua controparte umana. Ad esempio, nei topi, l&#39;arteria stapediale, che passa attraverso l&#39;anello della staffa, persiste per tutta la vita 36, che negli esseri umani, l&#39;arteria stapediale embrionale scompare durante la gestazione. Inoltre, la morfologia del martello del mouse differisce da quello di the ossa umane (vedi figura 6). Nei topi, l&#39;uditivo (timpanica) bulla racchiude la cavità dell&#39;orecchio medio piena d&#39;aria, mentre negli esseri umani, le cellule mastoidee composto da osso trabecolare nell&#39;osso temporale ospita gli ossicini, piuttosto che una bulla 37. In entrambe le specie, la capsula uditivo (capsula otica, labirinto osseo) racchiude la coclea e canali semicircolari dell&#39;orecchio interno. Biologia comparativa ed evolutiva dell&#39;orecchio medio è stato ampiamente rivisto 38-40. Il protocollo di seguito prima spiega come sezionare la bulla uditivo e la capsula, che consistono principalmente l&#39;orecchio medio e orecchio interno, rispettivamente. Questo protocollo dimostra anche come isolare il martello, incudine e staffa dal bulla uditivo. Infine, si mostra come orientare la bulla uditivo e capsule per l&#39;incorporamento, in preparazione per il sezionamento del tessuto di ossicini uditivi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Tools/Equipment</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paper towel</td>
			<td>DAIO PAPER CORPORATION</td>
			<td>703347</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Jar</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">14cm surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>91400-14</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extra fine scissors-straight</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine Forceps Angled 45&#176;</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>11063-07</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td>for routine dissection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>for movies&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Injection needle 27G</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (1ml)</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marking Pin</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube rotator RT-50</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0000165-000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td style="width:259px;">http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TC-65 Tungsten blade</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14021626379</td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless containers</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cryofilm type IIC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silane coated slide (New Silane II)</td>
			<td>Muto Pure Chemicals</td>
			<td>511617</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue processor</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td style="width:124px;">VIP-5</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Embedding Console System</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td style="width:124px;">Tissue-Tek TEC 5&#160;</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sliding microtome for paraffin</td>
			<td>Yamato Kohki Industrial</td>
			<td>REM-710</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Path Blade+pro for hard tissue</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>PB3503C</td>
			<td>for paraffin section</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-CT</td>
			<td>RIGAKU</td>
			<td>R_mCT2</td>
			<td>http://www.rigaku.com/en</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence microscope</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane</td>
			<td>Maruishi pharmaceutical Co. Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>wako</td>
			<td>285-14</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4 12H2O</td>
			<td>wako</td>
			<td>196-02835</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td>wako</td>
			<td>287-21</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde(EM Grade)</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>P001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA-2Na</td>
			<td>wako</td>
			<td>15111-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Super Cryoembedding Medium</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry Ice</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hexane</td>
			<td>wako</td>
			<td>080-03423</td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Super Cryomouting Medium type R2</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraffin</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>781001A0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Histo-Clear</td>
			<td>NDS</td>
			<td>HS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcein</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>340-00433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin&#160;</td>
			<td>wako</td>
			<td>131-09665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin</td>
			<td>wako</td>
			<td>051-06515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the auditory bulla in postnatal mice: isolation of the middle ear bones and histological analysis

Nella maggior parte dei mammiferi, ossicini dell&#39;orecchio medio, tra cui il martello, l&#39;incudine e la staffa, sono le ossa più piccole. Nei topi, una struttura ossea chiamata bulla uditivo ospita gli ossicini, mentre la capsula uditivo racchiude l&#39;orecchio interno, vale a dire la coclea e canali semicircolari. ossicini murini sono essenziali per l&#39;ascolto e quindi di grande interesse per i ricercatori nel campo della otorinolaringoiatria, ma il loro metabolismo, lo sviluppo e l&#39;evoluzione sono molto importanti per altri campi. Metabolismo osseo Altered può influenzare la funzione dell&#39;udito nei topi adulti, e vari topi gene-carenti mostrano cambiamenti nella morfogenesi di ossicini uditivi in utero. Anche se murini ossicini sono piccoli, la loro manipolazione è fattibile se si comprende il loro orientamento anatomico e struttura 3D. Qui, descriviamo come sezionare la bulla uditivo e capsule di topi postnatale e quindi isolare i singoli ossicini rimuovendo parte della bolla. Discuteremo anche come emletto la bulla e la capsula in diversi orientamenti per generare paraffina o sezioni congelate adatto per la preparazione di sezioni longitudinali, orizzontali, o frontali sul martello. Infine, annoveriamo differenze anatomiche tra mouse e ossicini umani. Questi metodi sarebbero utile per analizzare gli aspetti patologici, di sviluppo e di evoluzione di ossicini e dell&#39;orecchio medio nei topi.

Questo protocollo presenta un metodo per isolare ossicini dalla bolla del mouse uditivo. Innanzitutto, la bolla e capsule sono sezionati come un unico pezzo dal cranio (Figura 1). La bolla sezionato viene poi utilizzata per preparare il martello (Figura 2) e l&#39;incudine e staffe (Figura 3). Punti di riferimento della bulla uditivo e capsule sono il processo styliform alla fine anteriore della bolla, la cresta dorsale, anteriore canale semicircolare, e la fossa subarcuate (Figura 1F). Microcomputed tomografia (CT) Imaging rivela ossicini della bolla uditiva nonché gli orientamenti ottimali per sezionamento longitudinale ed orizzontale di detti ossicini (Figura 4). Per longitudinale paraffina sezionamento del martello, la bolla e capsule sono state decalcificate in EDTA a 4 ° C per una settimana, incorporato in un pablocco Raffin con l&#39;orientamento mostrato in Figura 4 A - C, sezionato a 4 micron, e quindi colorato con H &amp; E. Il martello attaccato alla membrana timpanica in bolla uditiva rivelato corso encondrale a P14 (Figura 5A). Per visualizzare formazione di nuovo osso, calceina (30 mcg / g di peso corporeo) è stato peritoneally iniettato in un topo P20, e bulla e la capsula sono stati isolati 24 ore dopo a P21. Il campione senza decalcificazione stato incorporato congelato e poi cryosectioned a 6 micron utilizzando una pellicola adesiva sulla base del metodo di Kawamoto 43. Dopo la colorazione nucleare con DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo), la sezione è stata osservata sotto un microscopio a fluorescenza. Segnali calceina (verde) ha rivelato la formazione di nuovo tessuto osseo nel martello (m), Bulla e capsula (Figura 5B). Per il sezionamento orizzontale del martello, la bulla uditivo isolato da un topo 5 settimane di età è stato incorporato congelato senza decalcificazione (per laorientamento vedi Figura 4D - F), cryosectioned a 6 micron con il metodo Kawamoto, e macchiato con H &amp; E. Sezionamento orizzontale della brevis malleal processus (MPB) mostra anche la coclea (Figura 5C). Una vista mediale degli ossicini uditivi giusti isolati da un topo P31 presenta caratteristiche tipiche del martello del mouse, vale a dire, il &quot;volo a vela-gabbiano-ala-like&quot; (o persiano spada come 45) manubrio, un processus di primo piano brevis (apofisi orbicolare , vedi Discussione), e la lamina trasversale (Figura 6). Si noti che il processo anteriore (processus anterior) è stato fratturato nella procedura dissezione attorno al goniale ed è stato separato dal ring timpanica (ectotympanic). Questo campione rappresentativo presenta un giunto incudomalleolar intatta tra il martello e incudine, mentre l&#39;articolazione incudostapedial è dislocata. inserzioni tendinee nel malleal estapediali processi muscolari sono rilevabili (Figura 6A, asterischi). Figura 6B confronta mouse e ossicini umani allo stesso ingrandimento. differenze di specie, diverse dalla taglia, sono i seguenti. Il manubrio è malleal ala-come nei topi, ma club come negli esseri umani. L&#39;angolo tra l&#39;asse anatomico (o l&#39;asse di rotazione, la linea attraverso il processo anteriore del martello e processo breve dell&#39;incudine) ed il manubrio è molto più piccolo in topi ei due sono quasi parallele, al contrario di quasi perpendicolare negli esseri umani 6,46-48. In ossicini umani, gli studi vibrometrico rivelano che la joint-incudo malleolare è mobile, piuttosto che funzionalmente fisso 49. Il martello del mouse presenta un ampio, sottile e piatta lamina trasversale non evidente negli esseri umani 47. Nei topi, anteriore processus fonde alle ossa membranose, vale a dire la goniale e timpanianello c, mentre nell&#39;uomo anteriore processus è ridotta ad una piccola spicule di osso 41. La staffa di topi e gli esseri umani differisce anche: nei topi, la crus anteriore è curvo e la crus posteriore è più dritta, mentre negli esseri umani, la crus anteriore è più diretto rispetto al cru posteriore. Vale la pena notare che la testa martello rispetto alle dimensioni del corpo è massicciamente ampliato in specie come la talpa d&#39;oro, dimostrando una significativa variabilità nei rapporti allometriche dei &quot;più piccoli&quot; ossa 48. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig1.jpg" /> Figura 1. Dissezione del Auditory Bulla e della capsula. (A) Il cranio di un mouse P31 è diviso in due metà destra e sinistra. A, anteriore; P, posteriore; L, a sinistra; R, a destra. (B) superficie mediale della metà destra della tagliata in due, la testa pelata. Cx, corteccia cerebrale; Cb, cervelletto; Bs, Brainstem. D, dorsale; V, ventrale. (C) La rimozione del cervello con una pinza. (D) vista mediale della capsula uditivo nel cranio destra. La cresta dorsale (punte di freccia) si trova tra la fossa cranica mezzo (MCF) e posteriore del cranio fossa (PCF) e separa dorso-anteriore e superfici ventro-posteriore della capsula uditivo. Barra di scala, 2 mm. (E) maggiore ingrandimento di bulla uditivo e capsula (vista mediale). Co, coclea; VII, nervo facciale; VIII, nervo vestibolococleare; AC, anteriore (superiore) Canale semicircolare; Sf, fossa subarcuate, che ospita il paraflocculus cerebellare. Barra di scala, 1 mm. (F) Micrografia di isolati bulla uditivo e capsula (vista mediale). Sp, processo styliform. Barra di scala, 1 mm. (A - E), P31 mouse. (F), P33 mouse. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig2.jpg" /> Figura 2. La dissezione del Malleus. (A) Vista ventrolaterale di una bolla uditiva destra e capsula. Il tympanicus solco (ST, freccia tratteggiata) è il sito di attacco della membrana timpanica. Il laterali osso al ST è parte dell&#39;orecchio esterno e mediale osso al ST forma il pavimento della cavità dell&#39;orecchio medio. A, anteriore; P, posteriore; D, dorsale; V, ventrale. (B) Vista dopo la rimozione del condotto uditivo esterno per rivelare la membrana timpanica (TM), comprese le pars flaccida (Pf) e pars Tensa (Pt). (C) rimozione di parti di osso timpanica (linee tratteggiate e #) vicino al malleal processus brevis (MPB). m, malleus; mM, manubrio malleal. Freccia, bolla d&#39;aria nella cavità dell&#39;orecchio medio visto attraverso la membrana timpanica. (D) Malleus esposto. Malleus testa è indicato. punteggiatolinea indica la superficie articolare dell&#39;incudine. (E) tendine del muscolo tensore del timpano (TT) attaccato al martello. (F) La timpani tensore è tirato quando il martello è sollevato. *, Processo muscolare. (G) Tensor timpani è tagliato con un ago. (H) Tre ossicini dopo la rimozione della membrana timpanica. La joint-incudo malleolare è dislocato. m, malleus; Io, incudine; s, staffa; Go, goniale (fusa al martello e timpanica anello, TR). Tutte le barre di scala, 0,5 mm. (A, H), P33 mouse. (B - G), P31 mouse. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig3.jpg" /> Figura 3. La dissezione del incudine e staffe. (A) Incudine estaffa dopo la rimozione del martello. L&#39;arteria stapediale (SA) passa attraverso la staffa (s). La linea tratteggiata indica la superficie articolare dell&#39;incudine. Si noti che il breve crus (ICB, crus breve) dell&#39;incudine (i) è fissato dal legamento posteriore (non mostrata). Asterisk, processo muscolare della staffa. (B) della staffa dopo la rimozione dell&#39;incudine. punta dell&#39;ago viene utilizzato per tagliare l&#39;arteria stapediale (SA). Freccia, direzione del flusso ematico. La linea tratteggiata indica superficie articolare della staffa. (C) L&#39;arteria stapediale viene rimosso dalla staffa. X indica la fine del taglio dell&#39;arteria stapediale (SA). (D) La finestra ovale (Ow, ovalis Fenestra o vestibuli Fenestra) è visibile dopo la rimozione della staffa. Rw, finestra rotonda (finestra rotonda o coclee Fenestra). Barre di scala, 0,5 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa</a>figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig4.jpg" /> Figura 4. Orientamento uditivo Bulla e della capsula durante Incorporare per Longitudinale (parasagittale, A - C) e orizzontale (D - E) sezionamento del Malleus. (A - C) Il collo e trasversale lamina del martello sono posti parallelamente al fondo del piatto incorporamento. (A) Vista laterale: Immagine micro-CT per mostrare incorporamento del martello proprio in bolla (pseudocolored blu). Il martello e incudine sono pseudocolored verde. La linea tratteggiata, il piano di taglio desiderato. linea continua, fondo di incorporare piatto. m, malleus; punte di freccia, cresta dorsale. M, mediale; L, laterale; D, dorsale; V, ventrale. (B) Vista: immagine Micro-CT. Si noti che l&#39;estremità anteriore della bolla (processo styliform) è stato rimosso. Io, incudine. (C) Vista: microfotografia (prese con unafiltro colore). AC, anteriore (superiore) Canale semicircolare; Sf, fossa subarcuate; Sp, processo styliform. A, anteriore; P, posteriore; D, dorsale; V, ventrale. (D - F) Il brevis processus del martello è posizionato perpendicolare al fondo di incorporamento piatto. (D) Vista laterale: Immagine Micro-CT per mostrare incorporamento del martello destra. La linea tratteggiata, il piano di taglio desiderato. linea continua, fondo di incorporare piatto. (E) Vista: immagine Micro-CT. mM, manubrio malleal. (F) Vista dall&#39;alto: al microscopio (scattate con un filtro di colore). Barre di scala, 1 mm. Immagini Micro-TC sono stati ottenuti con una risoluzione voxel di 5 micron, come precedentemente descritto 7. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig5.jpg" /> FIGURA 5. Istologia. (A) colorazione H &amp; E. Sezione longitudinale (parasagittale) del martello in paraffina destra (m) nella uditivo bulla (linea tratteggiata) a P14. TM, membrana timpanica. Etichettatura ossea (B) calceina. Sezione longitudinale del, malleus congelato undecalcified sinistra (m) nella bolla uditiva a P21. Di contrasto, DAPI. (C) colorazione H &amp; E. Sezione orizzontale del brevis congelato, undecalcified sinistra malleal processus (MPB) nel bulla uditivo e capsula (5 settimane di età del mouse). Co, coclea. Barre di scala, 1 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig6.jpg" /> Figura 6. mediale Vista Auditory Ossicini. (A) Diritto ossicini di P31 del mouse. A, anteriore; P, posteriore; D, dorsale; V, ventrale. Barra di scala, 1 mm. malleus testa (Caput mallei, Capitulum mallei); collo (Collum mallei); lamina (lamina trasversale); mm (manubrio mallei); asterisco nero (processo muscolare del martello); MPa (Processus anteriore, Processus gracile); MPB (processus brevis); corpo incudine (Corpus incudis); ICB (breve Crus, breve crus, processo breve); ICL (longum Crus, lungo crus, lungo processo); IPL (Processus Lenticularis, processo lenticolare, Sylvian apofisi); testa della staffa (Caput stapedis); asterisco bianco (processo muscolare della staffa); sca (Crus anterius, crus anteriore); SCP (Crus posterius, posteriore crus); di base (stapedis base, pedana); SOF (forame otturatorio, forame intercrural). (B) destra ossicini di un 76-year-old femmina umana (Per gentile concessione del Dipartimento di Anatomia, Keio University School of Medicine). Gli ossicini di topo P31 (in basso a destra) vengono esposte allo stesso ingrandimento di quello usato per ossicini umani. curvfrecce cati indicano l&#39;angolo tra l&#39;asse anatomico e il manubrio (linee tratteggiate). Barra di scala, 2 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

La dissezione del Auditory Bulla nei topi postnatale: Isolamento delle ossa dell&#39;orecchio medio e l&#39;analisi istologica

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

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29.9K Views.  Keio University School of Medicine. We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis. 

Video: Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissezione lordo e Arti di epiteli sensoriali dell&#39;orecchio interno in adulti Zebrafish ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Ricerca

Biologia

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell&#39;Organo murini di Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolamento dei neonatale extraepatico colangiociti

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolamento di cellule murine endoteliali Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

L&#39;isolamento di filtrazione di acidi nucleici: DNA metodo di estrazione semplice e veloce

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Colorazione delle goccioline per nidi e lipidi degli ovociti nelle larve di Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white preadipocyte cell lines. These cultured cell lines, however, have limitations. They do not fully capture the diverse functional spectrum of the heterogenous adipocyte populations that are now known to exist within white adipose depots. To provide a more physiologically relevant model to study the complexity of white adipose tissue, a protocol has been developed and optimized to enable simultaneous isolation of primary white and brown adipocyte progenitors from newborn mice, their rapid expansion in culture, and their differentiation in vitro into mature, fully functional adipocytes. The primary advantage of isolating primary cells from newborn, rather than adult mice, is that the adipose depots are actively developing and are, therefore, a rich source of proliferating preadipocytes. Primary preadipocytes isolated using this protocol differentiate rapidly upon reaching confluence and become fully mature in 4-5 days, a temporal window that accurately reflects the appearance of developed fat pads in newborn mice. Primary cultures prepared using this strategy can be expanded and studied with high reproducibility, making them suitable for genetic and phenotypic screens and enabling the study of the cell-autonomous adipocyte phenotypes of genetic mouse models. This protocol offers a simple, rapid, and inexpensive approach to study the complexity of adipose tissue in vitro.

This report describes a protocol for the simultaneous isolation of primary brown and white preadipocytes from newborn mice. Isolated cells can be grown in culture and induced to differentiate into fully mature white and brown adipocytes. The method enables genetic, molecular, and functional characterization of primary fat cells in culture.

Isolamento e differenziazione dei preadipociti bianchi e marroni primari dai topi appena nati

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>Dissezione del sacco endolinfatico da topi

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

Dissezione del sacco endolinfatico da topi

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...