Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una ricerca di sostegno i fondi delle sovvenzioni (RSFG) da Indiana University-Purdue University, Indianapolis, e in parte da un premio dalla American Heart Association 14GRNT20390154, di ARK

1. Espressione batterica. Nota: plasmidi di espressione utilizzati in questo studio sono descritti nella Tabella 1. Soluzioni, media e tamponi utilizzati in questo studio sono descritti nella tabella 2. La clonazione di geni proteasoma subunità archeali e la generazione di plasmidi di espressione sono descritte altrove 18,20. In breve, i plasmidi per coexpression ricombinante di subunità impiegano una strategia operone bicistronico che aiuta a ottenere livelli di espressione comparabili di singole subunità 18,20. I parametri di espressione elencati di seguito sono stati empiricamente determinato per essere ottimale per le subunità del proteasoma in questo studio. Potrebbe essere necessario ottimizzare espressione per altri mutanti proteasoma, per proteasomi da altre specie archeali, o per altri complessi di proteine ​​ricombinanti (vedi la discussione). <ol><li> Trasforma plasmide di espressione di interesse in chimicamente competente E. coli BL21 (DE3) cellule. </li><li> Aggiungere 1 - 2 microlitri di plasmide (tipicamente 50 - 100 ng) ad una aliquota di cellule DE3 che sono stati appena scongelati su ghiaccio, e continuano ad incubare su ghiaccio per 20 min. </li><li> shock termico le cellule a 42 ° C per 45 s e tornare tubo di ghiaccio per 2 minuti aggiuntivi. </li><li> Aggiungere 1 ml di terreno LB e incubare a 37 ° C con agitazione (150 rpm) per 1 h. </li><li> Distribuire 100 - 200 ml di miscela trasformazione su LB-kan piastre (piastre contenenti mezzi LB solidi, integrati con kanamicina (tutti plasmidi utilizzati in questo studio di resistenza a questo antibiotico encode)). Incubare le piastre a 37 ° C O / N. </li><li> La mattina dopo, inoculare una singola colonia dalla piastra LB-kan in 3 ml di liquido mezzi LB-kan in un tubo di vetro cultura. Incubare a 37 ° C con agitazione (150 rpm) per circa 2,5 - 3 h, o fino a quando si osserva torbidità. </li><li> Misurare la densità ottica della coltura a 600 nm (OD 600) in uno spettrofotometro. Diluire il culto delle celluleure con una quantità appropriata di mezzi LB-kan preriscaldata ad una OD 600 di 0,4 in un volume finale di 6 mL. Riprendere agitazione a 37 ° C per 40 min. </li><li> Indurre l&#39;espressione della proteina nelle colture liquide aggiungendo IPTG da una soluzione madre ad una concentrazione finale di 1 mM. Incubare a 37 ° C con agitazione (150 rpm) per circa 6-7 ore. </li><li> Raccolto colture di cellule batteriche nella loro interezza in provette da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Aggiungere 1,5 ml di una cultura in provetta. Centrifugare a 10.000 g per 1 min. </li><li> Eliminare il surnatante e aggiungere altri 1,5 ml di una stessa cultura al pellet. Centrifugare a 10.000 g per 1 min. </li><li> Ripetere il passaggio 1.11 fino a quando l&#39;intera coltura è raccolta nella provetta. </li><li> Conservare il pellet indotti a -80 ° C fino lisi. </li></ol> 2. batterica Lisi e lisato di miscelazione. Nota: </strong&gt; Per i campioni studiati tramite coexpression, seguire la sezione 2.1 (e le sue sottosezioni). Per i campioni che richiedono lisato di miscelazione, seguire la sezione 2.2 (e le sue sottosezioni). L&#39;analisi TSP (Total, solubile, pellet) che è incluso nel protocollo è utile per ottimizzare l&#39;espressione della proteina che può aiutare a garantire che circa la stessa quantità di alfa e beta subunità sono unite durante lisato di miscelazione (vedi la discussione). Fornisce inoltre un controllo importante, se non sono come previsto risultati a valle (cioè verifica che la proteina era espresso e solubile). Così, si consiglia vivamente compresa l&#39;analisi TSP inizialmente. Una volta che un protocollo ottimale è stato raggiunto per una particolare combinazione subunità, analisi TSP non è richiesto rigorosamente è per questo che è descritto come optional di seguito. <ol><li> Lisi delle cellule batteriche e la preparazione di frazioni solubili. <ol><li> Scongelare il pellet cellulare indotta in ghiaccio per 5 min. Risospendere il pellet in 600 ml di tampone di lisi. </li><li> IncUbate la sospensione a 30 ° C con agitazione (150 rpm) per 30 min per generare lisato grezzo totale. Nota: Il passo successivo e la sottosezione che segue sono opzionali. </li><li> Rimuovere due aliquote 25 microlitri dal lisato grezzo totale in provette da microcentrifuga da 1,5 ml separati ed effettuare analisi TSP come segue. <ol><li> Per una delle due aliquote 25 microlitri, aggiungere tampone campione SDS 5X ad una concentrazione finale di 1X. Etichettare la provetta con &quot;T&quot; per &quot;lisato grezzo totale&quot;. </li><li> Incubare il campione &quot;T&quot; a 100 ° C per 5 minuti per denaturare le proteine ​​completamente. </li><li> Nel frattempo, prendere la seconda aliquota 25 microlitri e centrifugare è a 10.000 g per 10 min. rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare la piccola pallina, e trasferirlo ad un nuovo 1,5 ml provetta. Etichettare questo nuovo tubo &quot;S&quot; per &quot;frazione solubile&quot;. </li><li> Per i behi piccola pallina di sinistraND nel passaggio precedente, aggiungere 25 ml di tampone di lisi e vortex per risospendere. Etichettare questo tubo &quot;P&quot; per &quot;frazione pellet&quot;. </li><li> Aggiungere 6 tampone campione ml di 5X SDS ai tubi e &quot;S&quot; &quot;P&quot; e incubare a 100 ° C, come descritto sopra. Nota: se non saranno utilizzati i campioni TSP quel giorno per analizzare l&#39;espressione, possono essere congelati a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Una volta scongelate, devono essere reincubate a 100 ° C, come descritto sopra, immediatamente prima di essere caricati su un gel SDS-PAGE standard di 12% e / o del 15%. </li></ol></li><li> Mentre l&#39;analisi TSP viene effettuata, centrifugare il restante 550 ml di lisato grezzo totale (o l&#39;intero 600 ml di lisato grezzo totale se l&#39;analisi TSP non viene effettuata) a 10.000 g per 10 min. Raccogliere il surnatante in una fresca 1,5 ml provetta. Questo è il lisato solubile che verrà utilizzato per la purificazione. </li></ol></li><li> Lisato miscelazione. <ol><li> Effettuare lisi come descritto ai punti 2.1.1 e 2.1.2 di cui sopra. </li><li> Mescolare 600 ml di lisato grezzo totale dai batteri che esprimono la subunità α desiderato con 600 ml di lisato grezzo totale dai batteri che esprimono la subunità β desiderato. Incubare a 37 ° C con lenta agitazione per 30 min. Nota: Potrebbe essere necessario ottimizzare il tempo di incubazione per ottenere il massimo assemblaggio durante lisato di miscelazione (vedi la discussione). Il tempo e la temperatura qui presentati sono ottimali per le proteine ricombinanti in questo studio e sono stati determinati altrove 18. </li><li> Centrifugare il lisato mista a 10.000 g per 10 minuti per separare materiale solubile da pellet insolubili. Trasferire il surnatante in un nuovo 1,5 ml provetta. Utilizzare questo lisato solubile mista per la purificazione della proteina. </li></ol></li></ol> 3. purificazione della proteina tramite Immobilized Cobalt Affinity Resina(ICAR). <ol><li> Equilibrare la resina. <ol><li> Accuratamente risospendere la resina capovolgendo il flacone e trasferire 50 ml di liquame di una provetta da microcentrifuga da 1,5. Centrifugare a 700 g per 2 minuti per resina pellet. Con attenzione aspirare il surnatante. Nota: Effettuiamo aspirazione pipetta utilizzando una punta blu 1 ml pipetta per rimuovere la massa del liquido. Un bianco tip 2 microlitri viene utilizzato per la regolazione fine della rimozione del surnatante rimanente, lasciando uno strato molto sottile di liquido che copre le perline. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone A. Mescolare delicatamente per risospendere resina e centrifugare a 700 g per 2 minuti per far sedimentare resina. Con attenzione aspirare il surnatante e ripetere questo passaggio di lavaggio ancora una volta. </li></ol></li><li> Applicare lisato solubile ottenuto in precedenza nella sezione 2.1 o 2.2 alla resina equilibrata. Incubare la provetta con rotazione dolce a 4 ° C per 60 min. Centrifugare la provetta a 700 × g &lt;/ Em&gt; per 5 minuti e con attenzione aspirare il surnatante. </li><li> Lavare la resina come segue per rimuovere le proteine ​​non specifico legato. <ol><li> resina risospendere con 1 ml di tampone A e incubare con dolce dondolio a 4 ° C per 10 min. Centrifugare la provetta a 700 g per 5 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta. </li><li> resina risospendere con 1 ml di tampone B (tampone A con 5 mM imidazolo) e incubare con dolce dondolio a 4 ° C per 5 min. Centrifugare la provetta a 700 g per 5 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta. </li><li> resina risospendere con 1 ml di tampone C (tampone A con 10 mM imidazolo) e incubare con dolce dondolio a 4 ° C per 5 min. Centrifugare la provetta a 700 g per 5 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante. </li></ol></li><li> Eluire la proteina con l&#39;aggiunta di 400 ml di tampone E (tampone A con 200 mm imidazolo) to la resina. Incubare con dolce dondolio a 4 ° C per 5 min. Centrifugare a 700 g per 5 min. </li><li> Trasferire il surnatante contenente proteina purificata in un 1,5 mL provetta da centrifuga. </li><li> Dissalare la proteina purificata mediante centrifugazione seriale come segue. <ol><li> Per 400 ml di proteina purificata, aggiungere 100 microlitri tampone A (questo riduce la concentrazione Imidazole da 200 mm a 160 mm). Applicare proteina purificata a 0,5 ml filtri ultracentrifugo con un 10 peso molecolare kDa cut-off. Centrifugare a 14.000 g per 5 min. </li><li> Eliminare il filtrato e aggiungere 400 microlitri tampone A per diluire il retentato e centrifugare di nuovo. Continuare i cicli di centrifugazione / diluizione fino concentrazione imidazolo scende al di sotto di 4 mm. Ad esempio, se ogni centrifugazione concentra 500 microlitri fino a ~ 70 microlitri (o circa 7 volte), poi due cicli ridurrà l&#39;avvio 160 mM imidazolo concentrazione (7 x 7 = 49 volte) per approximately 3,3 mm. </li><li> Misurare la concentrazione di proteine del campione dissalato utilizzando il saggio BCA 21. Nota: Dissalazione è necessaria per ridurre i livelli imidazolici di sotto del limite di tolleranza per il saggio BCA, come descritto nelle istruzioni del produttore. Il nostro laboratorio preferisce il saggio BCA perché è sensibile, ha un ampio range dinamico, e presenta molto meno variazione proteina-to-proteine. Tuttavia, altri metodi per determinare la concentrazione di proteine ​​possono essere sostituiti per il saggio BCA. La chiave è essere consapevoli dei vantaggi e dei limiti di ciascun metodo. </li></ol></li><li> Aggiungere 5X tampone campione nativo ad una concentrazione finale di 1X e procedere ad elettroforesi. In alternativa, conservare i campioni a -20 ° C per una successiva analisi. </li></ol> 4. nondenaturing SDS-PAGE (PAG). Attenzione: secondo le normative vigenti acrilamide è una neurotossina. Indossare adeguata protezione gear. <ol><li> Preparare il gel PAGE nondenaturing come segue. <ol><li> Preparare la cassetta del gel per la fusione con lastre di vetro puliti e la colata stand. Mettere produttore di pendenza sulla cima di un piccolo agitatore magnetico e posizionare una piccola ancoretta in ciascuna camera. </li><li> Utilizzando 40% (w / v) acrilammide e 2% (w / v) soluzioni stock bisacrylamide, preparano 5% e il 10% (w / v) soluzioni gel di acrilammide in un buffer risoluzione nativa. Assicurarsi che il rapporto di acrilamide totale bisacrylamide è 37,5: 1. Freddo sul ghiaccio prima di versare. Nota: Il sistema nondenaturing PAGE usato qui è sostanzialmente identico al sistema SDS-PAGE Laemmli, con SDS omessa 22. </li><li> Aggiungere persolfato di ammonio (da 10% (w / v) soluzione madre preparata in acqua) alle soluzioni di acrilammide per iniziare la polimerizzazione. concentrazione finale di ammonio persolfato è 0,1% (w / v). </li><li> Versare le soluzioni di acrilamide nelle due camere del creatore di gradiente. Con il tubo di uscita b inseritara le piastre della cassetta gel, attivare l&#39;agitatore magnetico e si aprono le valvole gradiente creatore. Versare il 5 - gel non denaturante pendenza del 10%. </li><li> Una volta versato, sovrapporre il gel con un sottile strato di isopropanolo e consentire il gel polimerizzare per 30 min. Durante questo tempo, preparare la soluzione di gel di acrilammide fresco 5% in tampone risoluzione nativa. Dopo i set di gel, travasare isopropanolo e sciacquare la parte superiore del gel con acqua deionizzata da una spruzzetta. </li><li> Per la soluzione di gel 5% preparata sopra, aggiungere ammonio persolfato (esattamente come descritto in 4.1.3) e versare sulla superficie del gel polimerizzato fino lastre di vetro sono pieni. Inserto in gel pettine. Lasciare il gel sovrapposto polimerizzare per altri 30 min. </li><li> Una volta che il gel è polimerizzato, assemblare cassette gel in apparato di elettroforesi. In alternativa, conservare il gel a 4 ° C, avvolti in tovaglioli di carta inumidito e l&#39;involucro di plastica fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Una volta nondenaturing gel PAGE è assemblato in eletApparecchio trophoresis, riempire il serbatoio con 1X tampone esecuzione nativa preparato fresco da un buffer in esecuzione nativa 10X magazzino. </li><li> Carico 10 ug di proteina purificata, ottenuto alla fine della sezione 3, in ogni pozzetto usando una siringa di vetro. </li><li> Carico 2 ml di alto livello peso molecolare nativa delle proteine ​​(diluito in 1X buffer di esecuzione nativa) in uno dei pozzi. </li><li> Eseguire gel a 55 V e 4 ° C fino a quando il fronte del colorante scappa il gel (circa 4-4,5 ore). </li><li> In aggiunta al gel non denaturante, analizzare aliquote della proteina purificata dalla norma SDS-PAGE 22. <ol><li> Mescolare aliquote (10 ug) dei campioni di proteine ​​purificate, ottenuti alla fine della sezione 3, con tampone 5X SDS-campione ad una concentrazione finale di 1X. </li><li> Incubare a 100 ° C per 5 minuti e caricare su standard di 12% e / o del 15% gel SDS-PAGE 22. </li><li> Eseguito a 80V per 20 minuti e poi a 120 V fino a quando il fronte del colorante corre il gel (questo è approssimativamente un addtransi- 75 min per un gel al 12%, e 120 min per un gel 15%). </li></ol></li></ol> 5. Visualizing attività e proteine ​​di colorazione. <ol><li> Dopo elettroforesi, lastre di vetro accuratamente separati e trasferire il gel non denaturante ad un vassoio gel contenente 50 mL di acqua deionizzata. Risciacquare gel con dolce dondolio per 5 min. Eliminare l&#39;acqua e ripetere l&#39;operazione di lavaggio per tre volte. </li><li> Eseguire test overlay substrato come segue. <ol><li> Aggiungere 1 mL di sviluppare tampone contenente il peptide substrato fluorogenico Suc-LLVY-AMC e diffondere uniformemente su gel. Incubare a 37 ° C per 30 min. Nota: Una bacchetta di vetro o un releaser gel (piccolo cuneo di plastica usata per lastre di vetro separate) possono essere utilizzati per diffondere il liquido sul gel. </li><li> Trasferire accuratamente il gel sul transilluminatore UV del gel sistema di imaging e osservare la fluorescenza a causa del substrato peptidico spaccati. immagine Record. trasferire accuratamente l&#39;ba gelck al vassoio gel. </li><li> Lavare il gel due volte con 50 ml di acqua deionizzata per 5 minuti con dolce dondolio. </li><li> Colorare il gel con 10 ml di una colloidale reattivo Coomassie macchia per 60 minuti con il dolce dondolio. Gel Decolorare con 50 ml di acqua fino a sfondo diventa chiara. Questa fase di colorazione applica ai gel SDS-PAGE standard così. </li></ol></li></ol>

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R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Subunit+appendages+promote+20S+proteasome+assembly+by+overcoming+an+Ump1-dependent+checkpoint.">beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint.</a> EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).</li><li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimeric+assembly+factor+controls+the+formation+of+alternative+20S+proteasomes.">A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dimostriamo il vantaggio di un approccio combinato di analizzare il montaggio proteasoma da nondenaturing pagina utilizzando proteasomi archeali ricombinanti. Il metodo usuale 9,11 di coexpression batterica subunità del proteasoma permette una rapida analisi, ma non può rivelare intermedi chiave di montaggio. Vi proponiamo la combinazione coexpression con lisato di miscelazione per sviluppare un quadro più ampio di eventi di assemblaggio. Il vantaggio di questo approccio combinato è che pur richiedendo espressione separata del α e ß subunità per lisato miscelazione, è ancora relativamente lavoro-friendly. I risultati possono anche essere semiquantitativa se si assicura i livelli di espressione comparabili e coerenti delle singole proteine. A tal fine, si consiglia di effettuare la consueta ottimizzazione di espressione della proteina ricombinante per determinare le condizioni che consentano livelli comparabili di proteine ​​espresse prima di lisato di miscelazione. L&#39;ottimizzazione può includere o meno induzione time, la temperatura di induzione, densità ottica a induzione, batterica ceppo espressione, e così via, fino a ottenimento di livelli desiderati di proteina solubile. Ciò è particolarmente importante quando si confrontano versioni WT e mutanti di una proteina perché a volte il mutante può presentare livelli di espressione comparabili, ma è diminuito solubilità. Abbiamo inoltre sottolineare l&#39;importanza di determinare le concentrazioni di proteine ​​dei campioni ICAR-purificata prima di caricamento della pagina nondenaturing. Anche con ottimizzazione espressione in posto, e con la migliore cura di assicurare che i campioni paralleli vengono elaborati attraverso i passaggi di purificazione nello stesso modo, la varianza può ancora essere introdotto inavvertitamente. Una misura della concentrazione assicura che la stessa quantità di proteina totale viene caricato per pozzetto. Questo rende i confronti di corsia a corsia di intensità di banda per un determinato la migrazione delle specie più significativo. Se i livelli comparabili e coerenti di espressione della proteina non possono essere raggiunti per LysaTE miscelazione, si può sempre purificare tutti i componenti in anticipo e portare a termine la miscelazione esperimenti con proteine ​​pure. Questo ha il vantaggio di consentire determinazioni delle proteine ​​più precisi e quindi rende quantitativa approccio. Tuttavia, l&#39;inconveniente di purificazione pieno è che il processo diventa notevolmente più manodopera, che può impedire una rapida analisi di mutanti multipli simultaneamente 18. Un avvertimento finale degno di nota è che a volte separano espressione di α e subunità beta potrebbero non essere possibile. Ciò può verificarsi se una mutazione provoca una subunità insolubile in E. coli quando espresso da sola, ma permette solubilità per essere recuperato quando il mutante è espressa con il partner legante. Se ciò si verifica, si limiterà analisi di coespressione soltanto. Tuttavia, questo è un avvertimento che possono sorgere durante l&#39;espressione della proteina ricombinante in generale, e non è specifico per subunità del proteasoma archeali 24,25. Abbiamo scelto di GeneRate derivati ​​his-tag delle nostre proteine ​​del proteasoma a causa della facilità di purificazione e la convenienza della resina ICAR. Altre categorie epitopi sono possibili, compresi quelli per la purificazione a base di anticorpi, e abbiamo espresso con successo e purificati versioni Flag-tag dei nostri subunità del proteasoma (non mostrato). Tuttavia, se è richiesta la purificazione all&#39;omogeneità (o aumentando la scala di produzione), le versioni suo-targhette forniscono i mezzi più veloci e più conveniente di farlo. E &#39;un dato di fatto che i risultati ottenuti con le proteine ricombinanti, siano essi archeali o proteine eucariotiche prodotte nei batteri, guadagnerà ulteriore significato quando è seguito con osservazioni in vivo. Tuttavia, un approccio in vivo può non essere sempre immediatamente accessibili sperimentalmente. Questo è particolarmente vero quando il soggetto di studio è un grande, multisubunit complesso come il proteasoma. proteina ricombinante avvicina fornire un importante punto di lancio per Future esperimenti. Nel caso del proteasoma, l&#39;associazione di produzione archeali proteasoma ricombinante con PAGINA nondenaturing continuerà ad essere molto efficace nel chiarire le caratteristiche fondamentali di assemblaggio proteasoma, che sono condivisi tra le specie archeali e eucarioti 9,11,12,18. Tale approccio può essere utile per studiare l&#39;assemblaggio di altri grandi complessi multiproteici pure. Recentemente, abbiamo usato questa strategia per dimostrare che proteasomi archeali possono assemblare con più di un percorso, e che alfa-ring non sono gli intermedi obbligati durante il montaggio che sono stati pensati per essere 18. Resta da stabilire se lo stesso vale per proteasomi eucariotiche.

Complessi multiproteici svolgono numerose attività cellulari critiche 1. Per molti di questi complessi, molto di più si sa sulla loro struttura e la funzione di circa il loro montaggio 2,3. Il proteasoma è un tale complesso e si trova in tutti i campi della vita. In eucarioti, questa macchina molecolare è alla base del sistema Proteasome / ubiquitina (UPS) e fornisce la principale via di degradazione delle proteine intracellulari 4. Il proteasoma eucarioti (indicato come il proteasoma 26S) è composto da due grandi gruppi di sub: un proteasoma 20S, o Core Particle (CP) 5, che può essere limitato a una o entrambe le estremità da una particella regolamentazione 19S (RP) 6. Il proteasoma 20S è un grande proteasi compartimenti stagni. La sua struttura quaternaria è assolutamente conservata in tutti i domini della vita e consiste in una pila di quattro anelli di sette membri contenente due tipi di subunità strutturalmente correlati, α; e ß 5,7,8. Negli eucarioti, i due anelli esterni sono ciascuna costituite da sette subunità alfa distinti e due anelli interni sono ciascuna costituite da sette subunità beta distinti; attività proteolitica risiede entro tre delle subunità beta. Per contro, gli anelli di CP archaea e batteri sono generalmente costituiti da un solo tipo di α e un tipo di subunità β. Proteasomi archaeal hanno fornito un sistema importante modello per lo studio di montaggio proteasoma sia per la loro semplicità compositiva e la loro condivisione di un meccanismo di montaggio comune con le loro controparti eucariotiche 9-13. In breve, subunità alfa assemblano in anelli alfa prima, che servono da impalcatura su cui beta subunità assemblare. I risultanti mezze proteasomi (α β 7 7) dimerizzano, dando luogo ad assemblare completamente CP (α β 7 7 β α 7 7). Durante dimerizzazione, i propeptidi presenti su subunità betasono autocatalytically rimossi, esponendo i catalitici threonines N-terminale. L&#39;uso dei proteasomi archeali per modellare il montaggio prende frequentemente vantaggio della produzione di proteine ricombinanti proteasoma archeali in Escherichia coli. Questo è un approccio interessante perché consente subunità essere prodotte in varie combinazioni, sia come WT e versioni mutanti, in un organismo ospite che non produce i propri proteasomi. Monitorare l&#39;assemblaggio di complessi multi-proteina richiede biochimicamente un qualche tipo di metodo di frazionamento che separa i complessi completamente assemblati da intermedi di assemblaggio e precursori. Grazie alla sua capacità di risoluzione superiore, nondenaturing SDS-PAGE (PAGINA) ha dimostrato di essere particolarmente utile nel frazionamento di varie grandi complessi multiproteici 14-17. La combinazione di produzione proteasoma archaeal ricombinante e PAGE nondenaturing è diventato un approccio potente dissecting assemblaggio proteasoma 9,11,12,18. Tuttavia, il metodo usuale con cui questo approccio viene applicato (es. Tramite la coespressione ricombinante di alfa e beta subunità) ha un importante inconveniente. Le reazioni di montaggio sono cooperativa e fortemente dipendente dalla concentrazione 3. Dato che la concentrazione di proteine all&#39;interno delle cellule è molto alta 19, a causa di effetti di volume escluso, reazioni di assemblaggio siano effettuati rapidamente in vivo. Quindi è possibile perdere importanti intermedi di montaggio quando alfa e beta subunità sono coexpressed. Qui, sosteniamo un approccio combinato nello studio di assemblaggio proteasoma usando ricombinanti subunità del proteasoma archeali. In questo approccio, entrambi i metodi di miscelazione coespressione e lisato sono impiegati. Il primo permette per l&#39;analisi rapida di assemblaggio, perché coexpression è meno laborioso. Quest&#39;ultimo dipende espressione separata di alfa e beta subunità, seguita da miscelazione. Anche se questo requires un po &#39;più sforzo che coexpression, è più che compensata dalla capacità di individuare prodotti intermedi che sono mancati durante coexpression. Insieme, questi due metodi in grado di fornire un quadro più completo di montaggio proteasoma.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="701">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:165px;">Acrylamide (40%) solution</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td style="width:105px;">1610104</td>
			<td style="width:309px;">Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters</td>
			<td style="width:123px;">EMDMillipore</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">ATP</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">A7699</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">BCA assay kit</td>
			<td style="width:123px;">Pierce</td>
			<td style="width:105px;">23225</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Bisacrylamide (2%) solution</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td style="width:105px;">1610142</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">B8026</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">DNaseI</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">DN25</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">BP172</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">E.coli BL21 competent cells</td>
			<td style="width:123px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:105px;">69450</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">GelCode Blue</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">24592</td>
			<td style="width:309px;">Colloidal coomassie stain reagent for gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Gel doc EZ system</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td>1708270</td>
			<td style="width:309px;">Gel documentation system</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:165px;">Gel releasers</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td>1653320</td>
			<td style="width:309px;">Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Glass rod</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td>11-380B</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Glycerol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">49767</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Glycine</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">BP3865</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td>14-813-38</td>
			<td style="width:309px;">Glass syringe for loading gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">US Biologicals</td>
			<td style="width:105px;">H2010</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">HMW Native calibration kit</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:105px;">170445-01</td>
			<td style="width:309px;">High molecular weight protein standards</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Hoefer SG30</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">03-500-277</td>
			<td style="width:309px;">Gradient maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Imidazole</td>
			<td style="width:123px;">US Biologicals</td>
			<td style="width:105px;">280671</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">IPTG</td>
			<td style="width:123px;">US Biologicals</td>
			<td style="width:105px;">I8500</td>
			<td style="width:309px;">For induction of protein expression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">BP26181</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:123px;">US Biologicals</td>
			<td style="width:105px;">K0010</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">L6876</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:165px;">MgCl2</td>
			<td style="width:123px;">Fluka analytical</td>
			<td style="width:105px;">630680</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td style="width:105px;">1658002EDU</td>
			<td style="width:309px;">Gel electrophoresis apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">S640-3</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">NaOH</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">S318-1</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Pefabloc SC</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:105px;">11429876001</td>
			<td style="width:309px;">Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">pET42</td>
			<td style="width:123px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:105px;">70562</td>
			<td style="width:309px;">Expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Precision plus all blue standard</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td style="width:105px;">1610373</td>
			<td style="width:309px;">Molecular protein standard for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Quickchange mutagenesis kit</td>
			<td style="width:123px;">Agilent technologies</td>
			<td style="width:105px;">200521</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">BP166</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Suc-LLVY-AMC</td>
			<td style="width:123px;">Enzo lifesciences</td>
			<td style="width:105px;">BML P802-0005</td>
			<td style="width:309px;">Fluorogenic substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Talon Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:123px;">Clontech</td>
			<td style="width:105px;">635502</td>
			<td style="width:309px;">Immobilized-cobalt affinity resin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">TEMED</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">T7024</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Tris</td>
			<td style="width:123px;">US Biologicals</td>
			<td style="width:105px;">T8600</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">93426</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Tryptone</td>
			<td style="width:123px;">Bacto BD</td>
			<td style="width:105px;">211699</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">UV sample tray</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td>1708271</td>
			<td style="width:309px;">For UV imaging of gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:123px;">Bacto BD</td>
			<td style="width:105px;">212720</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining proteasome assembly with recombinant archaeal proteasomes and nondenaturing page:  the case for a combined approach

Proteasomi si trovano in tutti i campi della vita. Essi forniscono la principale via di degradazione delle proteine ​​intracellulari negli eucarioti, anche se il loro montaggio non è completamente noto. Tutti i proteasomi contengono una particella strutturalmente conservato nucleo (CP), o 20S proteasoma, contenente due anelli subunità beta heptameric a sandwich tra due anelli α subunità heptameric. Archaeal 20S proteasomi sono compositivo semplice rispetto alle loro controparti eucariotiche, ma entrambi condividono un meccanismo di montaggio comune. Di conseguenza, archaeal 20S proteasomi continuano ad essere modelli importanti per il montaggio del proteasoma eucariotica. In particolare, l&#39;espressione ricombinante della 20S archeali proteasomi accoppiato con nondenaturing gel di poliacrilammide (PAGE) ha prodotto molti importanti intuizioni proteasoma biogenesi. Qui, si discute un mezzo per migliorare la solita strategia di coexpression di α proteasoma archeali e subunità beta prima nondenaturing PAGINA. Abbiamo dimostrato che, anche se rapido ed efficace, un approccio coexpression solo può mancare intermedi chiave di montaggio. Nel caso del proteasoma, coexpression potrebbe non consentire il rilevamento del semi-proteasoma, una contenente una α-anello completo intermedio e una β-anello completo. Tuttavia, questo intermedio è facilmente rilevata tramite lisato di miscelazione. Si suggerisce che la combinazione coexpression con lisato di miscelazione produce un approccio più completo per l&#39;analisi di assemblaggio, ma rimane non intensiva del lavoro. Questo approccio può essere utile per lo studio di altri complessi multiproteici ricombinanti.

Assemblaggio proteasoma (Figura 1) inizia quando subunità alfa si combinano per anelli di forma 9. Ciò può essere illustrato quando alfa subunità dalla archaeon Methanococcus maripaludis S2 sono espressi in E. coli come C-terminale hexahistidine tag (His-tag) derivati (Tabella 1). Quando la α-la proteina ricombinante è stata purificata dall&#39;ICAR e analizzata mediante nondenaturing PAGE, due bande sono state osservate (Figura 2A, corsia 1). Abbiamo precedentemente dimostrato che questi corrispondono a Squillo unico alfa (SR) e doppio alfa-ring (DR) 18. Il DR è una specie dead-end che non è produttivo per il successivo assemblaggio 9,18. Quando alfa-le sue subunità sono stati coexpressed con subunità beta, che rappresenta il solito metodo con cui il montaggio dei proteasomi archeali ricombinanti viene analizzato, è stata osservata una specie di romanzo la migrazione presso lo stand 670 dimensioni kDaard (Figura 2A, corsia 3). Questa specie è stata proteoliticamente attiva (Figura 2B, corsia 3) e conteneva subunità beta solo completamente maturi (mβ) i cui propeptidi sono stati rimossi (Figura 2C, corsia 3). Questa specie è il CP pienamente maturo. Questo campione conteneva anche alcune specie SR, che è stato previsto perché SR è un assemblaggio noto intermedio, ma nessuna specie DR. La mancanza di DR, quando alfa-lui e subunità beta sono coexpressed suggerisce che il corretto montaggio stava avvenendo abbastanza rapidamente in modo tale che l&#39;incorporazione della subunità beta è stato in grado di outcompete la formazione non produttiva di DR (per un&#39;analisi più dettagliata si veda 18). Per dimostrare la limitazione del metodo coespressione e sostenere l&#39;utilità di un approccio combinato, α-la e subunità beta sono stati espressi separatamente in E. coli. Dopo lisi, le frazioni solubili sono stati miscelati e proteine ​​sono stati purificati dall&#39;ICAR primaanalisi PAGE nondenaturing. Completamente proteasomi funzionali sono stati generati mediante la miscelazione lisato approccio (Figura 2A e 2B, corsia 2), e le specie SR è stato anche osservato come previsto. La ricomparsa della specie DR del lisato campione miscelazione indica che una volta formato, subunità beta sono in grado di smontare reversibilmente esso; Ciò sottolinea la natura vicolo cieco del DR. È interessante notare che una nuova specie è apparso anche nel campione di miscelazione lisato, la migrazione appena sotto la CP (definito &quot;mezzo&quot;). Recentemente, abbiamo dimostrato che questa specie corrisponde alla metà-proteasoma (alfa 7 β 7) 18. Per illustrare questo qui, è stato impiegato un mutante β subunità (R166W). Questa mutazione distrugge interazione anello β-β, che porta alla compromissione dimerizzazione mezza proteasomi 18. Dal momento che le mezze proteasomi sono i precursori immediati per CP, la mutazione R166W dovrebbe portare sia l&#39;accumulo di mezze proteasomi unda diminuzione della formazione di CP. Quando lisato miscelazione con alfa-beta e le sue (R166W) subunità è stata effettuata, sono stati osservati livelli più bassi di CP e aumento dei livelli di specie &quot;metà&quot; (Figura 2A, corsia 4). Questo è coerente con un rapporto precursore prodotto per queste due bande, e conferma l&#39;identità della specie &quot;mezze&quot; come meta-proteasoma. La migrazione leggermente più veloce del mezzo-proteasoma nel campione mutante (corsia 4 contro corsia 2) è probabilmente dovuto alla mutazione R166W alterare il rapporto di massa-a-carica della subunità β. La possibilità di visualizzare meta-proteasoma durante lisato miscelazione è dovuto principalmente a concentrazioni proteiche molto bassi nel lisato rispetto alle concentrazioni elevate di proteine ​​all&#39;interno delle cellule. Concentrazioni inferiori producono meno efficiente assemblaggio (cioè più lenta), che consente intermedi a diventare più popolato e quindi rilevabile. Inoltre l&#39;aspetto del mezzo-proteasoma,<html> un&#39;osservazione ulteriore evidenzia l&#39;efficienza di assemblaggio diminuito durante lisato di miscelazione: subunità beta non trasformati, che mantengono le loro propeptidi, diventano rilevabili (proβ). Dal momento che l&#39;elaborazione propeptide non si verifica fino a quando proteasomi mezzo dimerizzano, l&#39;aspetto del modulo proβ immatura è correlata con il livello di accumulo di mezza proteasoma (confrontare Figura 2C, corsia 3 contro corsia 2 contro corsia 4). Nel caso del mutante R166W, il fallimento trasformazione propeptide durante lisato miscelazione è assoluta, anche se una piccola quantità di CP si forma. Questo perché l&#39;elaborazione propeptide non solo richiede dimerizzazione metà proteasoma, ma anche un corretto formata interfaccia anello β-β 23 che la mutazione R166W non offre. Una narrazione più dettagliata di coexpression contro lisato di miscelazione, in quanto riguarda il montaggio proteasoma ricombinante, può essere trovato qui 18. figura 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54860 / 54860fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Uno schema semplificato di core Particle (CP) Assembly. Le subunità alfa possono assemblare in un unico α-primo anello (SR) che serve come modello per l&#39;inserimento di subunità beta. Questo porta alla generazione del semi-proteasoma intermedia (metà) che dimerizza rapidamente. In concomitanza con dimerizzazione, i propeptidi β subunità (non mostrate) vengono rimossi autocatalytically dando origine alla particella nucleo completamente funzionale (CP). Doppia alfa-ring (DR) possono sorgere da SR e non sono competenti per il montaggio in CP. La loro formazione rappresenta un percorso di montaggio non produttiva (freccia tratteggiata) in contrasto con eventi di assemblaggio produttive (frecce solidi). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54860/54860fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54860 / 54860fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2: un approccio combinato per il saggio di montaggio del proteasoma. Coexpression (C) e lisato di miscelazione (L) sono stati impiegati per studiare montaggio di proteasomi ricombinanti dal archaeon M. maripaludis. Le proteine ​​sono stati purificati da Immobilized Cobalt Affinity resina (ICAR). (A, B) proteine purificate (10 mcg) sono stati caricati su-denaturanti non 5 - 10% gel gradiente. Dopo elettroforesi, attività peptidasi stato visualizzato sovrapponendo il gel con una soluzione tampone contenente il peptide substrato fluorogenico Suc-LLVY-AMC (B) prima della colorazione del gel con Coomassie colloidale reagente macchia (A). frecce nere indicano le posizioni del nucleo particella 20S assemblati (CP), semi-proteasoma intermedia (metà), α-doppio anello (DR) e α-ring singola (CS). La migrazione di diversi standard di dimensioni molecolari (in kDa) è indicato a destra. (C) </strong&gt; proteine purificate (10 mcg) da un sono stati caricati anche sul 15% gel SDS-PAGE. Dopo l&#39;elettroforesi, gel sono stati colorati con un reagente colloidale Coomassie macchia. La migrazione di α-sua subunità e pienamente matura (mβ) e immaturi (proβ) subunità beta è indicato. La posizione dello standard dimensione molecolare 25 kDa è mostrato a destra. L&#39;asterisco indica un tronco α-suo frammento subunità derivanti dalla proteolisi non specifico durante la lisi. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54860/54860fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> plasmidi </td><td> Genotipo </td><td> fonte </td></tr><tr><td> AKB191 </td><td> pET42 PSMA-suo </td><td> Kusmierczyk et al., (2011) </td></tr><tr><td> AKB464 </td><td> pET42 PSMA-suo psmB </td><td> Kusmierczyk et al., (2011) </td></tr><tr><td> AKB946 </td><td> pET42 psmB </td><td> Panfair et al., (2015) </td></tr><tr><td> AKB952 </td><td> pET42 psmB (R166W) </td><td> Panfair et al., (2015) </td></tr></tbody></table> Tabella 1: plasmidi batterici utilizzati in questo studio. PSMA è il gene α subunità archaeal e psmB è il gene β subunità archaeal. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tampone A </td><td> 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2. </td><td> Buffer B, C ed E, sono derivati ​​di tampone A contenente imidazolo. È utile aggiungere imidazolo da un magazzino 2 M preparato in acqua e conservata al buio. </td></tr><tr><td> buffer di risolvere Native </td><td> 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% (v / v) tetrametiletilendiammina (TEMED) e 0,1% (w / v) di ammonio Perulfate (APS). </td><td> Preparato fresco non più di un&#39;ora prima del gel è da polimerizzare e tenuti in ghiaccio. Nel preparare soluzioni gel di acrilammide in tampone risoluzione nativa, è utile aggiungere il Tris-HCl da uno stock 4X (1,5 M Tris-HCl, pH 8.8). L&#39;APS viene aggiunta immediatamente prima della polimerizzazione. </td></tr><tr><td> buffer di esecuzione nativa 10X magazzino </td><td> 250 mm Tris, 1,92 M glicina, non aggiustare il pH. </td><td></td></tr><tr><td> 5X tampone campione nativo </td><td> 0.5 M Tris-HCl, pH 8,8, 50% (v / v) glicerolo, tracce di blu di bromofenolo. </td><td> Tracce si riferisce a una quantità molto piccola, di solito alcuni grani trasferiti tramite spatola. </td></tr><tr><td> 5X SDS-campione del buffer </td><td> 0.3 M Tris-HCl, pH 6.8, 600 mM ditiotreitolo (DTT), 10% (w / v) di SDS, 50% (v / v) di glicerolo e tracce di blu di bromofenolo. </td><td> Tracce si riferisce a una quantità molto piccola, di solito alcuni grani trasferiti tramite spatola. </td></tr><tr><td> Lo sviluppo del buffer </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 1 mM ATP, 50 mM Suc-LLVY-AMC. </td><td> Suc-LLVY-AMC è un substrato peptidico fluorogenico utilizzato per saggiare l&#39;attività del proteasoma. </td></tr></tbody></table> Tabella 2: Soluzioni, Media, e tamponi utilizzati in questo studio.

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Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Questo protocollo utilizza sia coexpression subunità e postlysis subunità miscelazione per un esame più approfondito di assemblaggio proteasoma ricombinante.

Esaminando Assemblea Proteasome con ricombinante archeali proteasomi e nondenaturing PAGINA: il caso di un approccio combinato

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

examining-proteasome-assembly-with-recombinant-archaeal-proteasomes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.6K Views.  Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI).  Questo protocollo utilizza sia coexpression subunità e postlysis subunità miscelazione per un esame più approfondito di assemblaggio proteasoma ricombinante. 

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A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Un approccio Facile ed efficiente per la produzione di micelle reversibile Disulfide Croce-linked

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Ricerca

Biochimica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

Un approccio G-quadruplex del DNA-affinità per purificazione di enzimaticamente attiva G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rilevamento di fosforilazione di Rab10 di LRRK2 attività mediante SDS-PAGE con un Tag di fosfato-binding

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

Cristalli della proteina crescente con dimensioni distinte utilizzando automatizzato cristallizzazione accoppiato con In Situ dispersione della luce dinamica

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

Ricostituzione assistita da detergenti della Drosophila ricombinante Atlastin in Liposomi per i saggi che mescolano i lipidi

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall process costs. Alternative, cost-effective capture steps are therefore valuable for industrial-scale manufacturing, where large quantities of a single mAb are produced. Here we present a method for the immobilization of a DsRed-based epitope ligand to a cross-linked agarose resin allowing the selective capture of the HIV-neutralizing antibody 2F5 from crude plant extracts without using Protein A. The linear epitope ELDKWA was first genetically fused to the fluorescent protein DsRed and the fusion protein was expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants before purification by immobilized metal-ion affinity chromatography. Furthermore, a method based on activated cross-linked agarose was optimized for high ligand density, efficient coupling and low costs. The pH and buffer composition and the soluble ligand concentration were the most important parameters during the coupling procedure, which was improved using a design-of-experiments approach. The resulting affinity resin was tested for its ability to selectively bind the target mAb in a crude plant extract and the elution buffer was optimized for high mAb recovery, product activity and affinity resin stability. The method can easily be adapted to other antibodies with linear epitopes. The new resins allow gentler elution conditions than Protein A and could also reduce the costs of an initial capture step for mAb production.

In this procedure, a DsRed-based epitope ligand is immobilized to produce a highly selective affinity resin for the capture of monoclonal antibodies from crude plant extracts or cell culture supernatants, as an alternative to Protein A.

Agarose cross-linked attivata per lo sviluppo rapido delle resine di maromtagrafia di affinità - Cattura anticorpale come caso di studio

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Un approccio personalizzabile per la produzione e la purificazione esulta dei prodotti naturali Diterpenoid

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human cancers, is processed by farnesylation and carboxymethylation due to the presence of a &#39;CAAX&#39; box motif at the C-terminus. An engineered baculovirus system was used to express farnesylated and carboxymethylated KRAS4b in insect cells and has been described previously. Here, we describe the detailed, practical purification and biochemical characterization of the protein. Specifically, affinity and ion exchange chromatography were used to purify the protein to homogeneity. Intact and native mass spectrometry was used to validate the correct modification of KRAS4b and to verify nucleotide binding. Finally, membrane association of farnesylated and carboxymethylated KRAS4b to liposomes was measured using surface plasmon resonance spectroscopy.

Prenylation is an important modification on peripheral membrane binding proteins. Insect cells can be manipulated to produce farnesylated and carboxymethylated KRAS4b in quantities that enable biophysical measurements of protein-protein and protein-lipid interactions

KRAS4b ricombinante completamente elaborato: isolamento e caratterizzazione delle proteine di Farnesylated e Metylated

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...