This work was supported by the French National Research Agency through the Laboratory of Excellence ARBRE (ANR-11-LABX-0002-01), the Plant-Microbe Interfaces Scientific Focus Area in the Genomic Science Program, and the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. Oak Ridge National Laboratory is managed by UT-Battelle, LLC, for the United States Department of Energy under contract DE-AC05-00OR22725.

1. Preparazione di batteri e funghi Culture <ol><li> Preparazione delle colture fungine <ol><li> Preparare membrane cellophane con lo stesso diametro dei piatti Petri e bollire in EDTA (1 g / l in acqua deionizzata) per 30 min. Lavare le lenzuola con acqua deionizzata e autoclave per due volte. </li><li> Preparare una fungina pre-cultura inoculando fungina agar spine sul agar adeguato ricoperta da una membrana di cellophane con EDTA pre-trattati. Incubare alla temperatura crescita ottimale per ottenere colonie circa 1 cm di diametro. <ol><li> Per L. bicolor S238N, incubare a 25 ° C per 5 giorni su agar Pachlewski P5, fatti di 0,5 g di diNH4 tartrato, 1 g di KH 2 PO 4, 0,5 g di MgSO 4 .7H 2 O, 5 g di maltosio D + , 20 g di glucosio D +, 1 ml di 10% tiamina-HCl, 1 ml di soluzione diluita 1/10 micronutrienti (6 g / L di solfato ferroso; 0,27 g / L di molibdeno trioxyde; 8.45 g / L acido borico; 5 g / L uomosolfato di manganese; 5 g / L rameico solfato; 2.27 g / L di solfato di zinco) si porta a 1 litro con acqua deionizzata; e 20 g di agar; pH 5.5. </li></ol></li><li> Dal fungina precoltura, inoculare una nuova piastra di agar coperto con l&#39;EDTA pretrattato membrana cellophane contenente un terreno di agar a basse emissioni di promuovere l&#39;espansione radiale delle colonie. <ol><li> Per inoculare la piastra di Petri, graffiare delicatamente la zona esterna (in cui le cellule hanno lo stesso stato fisiologico) di una colonia fungina dal pre-coltura con un bisturi e trasferire le ife alla nuova piastra di agar. </li><li> Incubare a temperatura di crescita ottimale finché le nuove colonie sono circa 1 cm di diametro. Per L. bicolor S238N, incubare a 25 ° C per 5 giorni in media P20 agar (0,25 g di 4 Dinh tartrato; 0,5 g di KH 2 PO 4; 0,25 g di MgSO 4 .7H 2 O, 1 g di Glucosio D + ; 0,5 ml di 10% tiamina-HCl, 0,5 ml di soluzione 1/10 di micronutrienti diluito (cfr 1.1.2.1), costituito da 1 L con acqua deionizzata; e 20 g di agar; pH 5,5). Nota: A causa della precoltura sul cellophane, la seconda coltura non conterrà agar nelle spine centrali. Le spine di agar devono essere rimossi per ulteriori analisi dei biofilm, dal momento che queste spine introducono agar e sostanze nutritive che possono creare distorsioni nell&#39;analisi. Questo passo riguarda solo fungine specie che sono custoditi e propagata su piastre di agar, e non è necessario per i funghi che si propagano da spore o scorte congelate. </li></ol></li></ol></li><li> Preparazione delle colture batteriche <ol><li> Utilizzare un&#39;ansa sterile per raccogliere 2 o 3 singole colonie batteriche da una coltura su terreno agarizzato appropriata e inoculare 25 ml di terreno liquido Luria-Bertani (LB) (o qualsiasi altro mezzo appropriato, a seconda del ceppo utilizzato). Per P. fluorescens BBC6, incubare una cultura durante la notte a 28 ° C con un leggero scuotimento (~ 150 rpm). Nota: Utilizzando un ceppocontrassegnati con proteina fluorescente come GFP, è preferibile, perché questo evita di eseguire una doppia colorazione (funghi e batteri) prima osservazioni microscopiche. I tempi, la velocità di agitazione, e la temperatura di incubazione dipendono dal ceppo utilizzato, con l&#39;obiettivo di ottenere una coltura in crescita tardiva esponenziale. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di N in vitro biofilm di batteri sulla Fungal Colony <ol><li> Centrifugare la coltura batterica a 5.000 xg per 3 min e sospende il pellet in 25 ml di tampone sterile 0,1 M fosfato di potassio (25 g / L KH 2 PO 4 e 2,78 g / LK 2 HPO 4, pH 5.8). Ripetere questo passaggio una volta e regolare la concentrazione batterica finale a 10 9 cellule / ml con lo stesso tampone. </li><li> Riempire una micropiastra da 6 pozzetti con 5 ml della sospensione batterica (o sterile 0,1 M tampone fosfato di potassio per il controllo negativo). </li><li> Tagliare la membrana di cellophane del fungcultura al con una lama di rasoio sterile per ottenere quadrati di cellophane con una singola colonia fungina su ciascuna membrana. Rimuovere con attenzione le piazze di cellophane contenenti ife dal terreno solido con pinze e trasferire il quadrato di cellophane contenente ife di un pozzo della micropiastra contenente la sospensione batterica. </li><li> Agitare delicatamente la micropiastra mentre le colonie fungine sono ancora attaccati al cellophane; quindi, rimuovere la pellicola di cellophane, lasciando le colonie fungine nella piastra. </li><li> Incubare la micropiastra con agitazione (~ 60 rpm) ad una temperatura adatta ai microrganismi studiati. Nota: Il tempo di incubazione dipende dalla velocità di stabilimento del biofilm e la fase da analizzare. Per P. fluorescens BBC6 / L. bicolor, incubare a 20 ° C per 30 minuti per avere biofilm in fase iniziale e fino a 16 ore per ottenere biofilm maturi. </li></ol> 3. confocale analisi al microscopio del formato biofilmione <ol><li> preparazione del campione <ol><li> Per rimuovere batteri planctonici e batteri elettrostaticamente iscritti alla ife, risciacquare il fungo trasferendolo ad un nuovo 6 pozzetti micropiastra riempito con 5 ml di una soluzione concentrata di sale (NaCl, 17 g / L) 17; agitare delicatamente per 1 min. </li><li> Trasferire il fungo in un 6-pozzetti micropiastra contenente 5 ml di tampone fosfato sterile 0,1 M di potassio, agitare delicatamente per 2 minuti, e trasferire il fungo di tampone fosfato di potassio fresco. </li><li> Tagliare la parte della colonia fungina per essere ripreso con un bisturi mantenendolo in tampone fosfato di potassio, in modo tale che la sezione ottenuto contiene circa metà della colonia fungina. </li><li> Per macchiare il campione, trasferirlo un piatto Petri riempita con acqua sterile contenente un colorante fluorescente (in funzione dello scopo dell&#39;analisi), ed incubare al buio. <ol><li> Per visualizzare la rete fungina, utilizzare, per esempio, Rosso Congo (0,1% co finalencentration, 5 min di incubazione), germe di grano agglutin (WGA) lectina coniugata con Alexa Fluor 633 (10 mg / ml concentrazione finale, 10 min di incubazione) o TIM 1 (10 micron concentrazione finale, 10 min di incubazione). </li><li> Se si utilizza un batterio non fluorescente-tag, di contrasto le cellule batteriche con una sonda fluorescente specifica per il DNA tra le numerose tinte di DNA di cellule permeanti disponibili in commercio. Ad esempio, utilizzare DAPI (/ ml concentrazione finale di 0,25 mg, 10 min di incubazione). </li><li> Per visualizzare le proteine della matrice, utilizzare una macchia proteica 21. </li></ol></li><li> Dopo la colorazione, lavare il campione trasferendolo ad un coperchio piatto di Petri contenente 10 ml di sterile fosfato 0,1 M di potassio e agitare delicatamente per 1 min. </li><li> La metà immergere una diapositiva nel coperchio capsula di Petri e delicatamente portare la sezione di taglio galleggiare sopra la diapositiva. Poi, rimuovere lentamente il vetrino dalla soluzione tampone, permettendo il campione di stabilirsi delicatamente sul vetrino. <li> Infine, aggiungere 10 ml di anti-sbiadimento mezzo di montaggio per il campione e coprire con un coprioggetto di vetro. Nota: Una volta che la slitta viene preparato, l&#39;analisi microscopica deve essere eseguita appena possibile (entro al massimo 30 min) per evitare modifiche nella struttura biofilm. </li></ol></li><li> Analisi al microscopio confocale <ol><li> Esaminare i vetrini al microscopio laser confocale con una lente obiettivo 10X o 40X accoppiato al software di imaging. Nota: Qui, un multi-raggio di scansione microscopio confocale dotato di 405, 488 e 561 nm laser di eccitazione, un rivelatore Gaasp PMT, e 10X 0.3 NA e 40X 1.2 obiettivi NA è stato utilizzato. <ol><li> Eseguire immagini utilizzando parametri adeguati al tipo di dati richiesti e ai vincoli di tempo. Utilizzare laser lunghezze d&#39;onda di eccitazione / emissione in base alla macchia utilizzato e recommendati del produttoreons. Utilizzare una combinazione di scansione piastrelle e le funzioni di Z-stack per ottenere una vista globale 3D della colonia fungina e biofilm. Nota: Immagini su Figura 3 sono state acquisite utilizzando i seguenti parametri: 8-bit / pixel, con una media = 2, sosta pixel = 1.58 msec, piastrelle scansione di immagini 5x5 con cuciture online (copertura del 10%, soglia = 0.7); Z-step = 2 micron. </li></ol></li><li> Per la visualizzazione di dati 3D, utilizzare uno dei tanti software gratuiti o commerciali (questi offrono molte opzioni per il rendering 3D). <ol><li> Ad esempio, per visualizzare i dati Z-stack come 2D proiezioni di massima intensità, sottrarre il canale in campo chiaro, regolare la luminosità e il contrasto, e unire i canali per creare un&#39;immagine composita. Se sono presenti, eliminare fette senza segnale alle estremità Z-stack. Quindi, eseguire una proiezione massima intensità 2D e convertire il risultato in colore RGB. Utilizzare la funzione &quot;Progetto Z&quot; nel software ImageJ 22 per ottenere il immagini prisentito qui da 2D proiezioni massima intensità. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Electron Microscopy Analisi <ol><li> Preparare i campioni come descritto per LSCM, tranne che in fase 3.1.2, trasferire i biofilm di acqua sterile invece di tampone fosfato di potassio, dopo le fasi di risciacquo. Questo evita la formazione di cristalli di sale durante la fase di disidratazione, che perturbano immagini SEM. </li><li> Trasferire i biofilm a un porta-campioni e rimuovere l&#39;acqua in eccesso; consentire solo una piccola pellicola di acqua per coprire il campione. </li><li> Trasferire il campione nella camera di un microscopio elettronico a scansione a pressione variabile (VP-SEM); congelare a -50 ° C su un palcoscenico Peltier di raffreddamento; e permettono di liofilizzare lentamente, direttamente nella camera di SEM, con 100 Pa di pressione variabile impostata per 15 ore. </li><li> Dopo il completamento della liofilizzazione, recuperare il campione e trasferirlo in un sistema di deposizione di film alto vuoto. Rivestire il campione con 2 nm di platinatm (misura quarzo) in plasma di argon (2,5 x 10 -2 mbar, 35 mA). </li><li> Osservare il campione rivestito con un SEM attrezzato con una pistola ad emissione di campo (FEG) utilizzando il rilevatore alta risoluzione &quot;in lente&quot; e un&#39;elevata tensione elettronica di 1 kV. </li></ol>

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	<li>Frey-Klett, P., Burlinson, P., Deveau, A., Barret, M., Tarkka, M., Sarniguet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial-Fungal+Interactions:+Hyphens+between+Agricultural,+Clinical,+Environmental,+and+Food+Microbiologists.">Bacterial-Fungal Interactions: Hyphens between Agricultural, Clinical, Environmental, and Food Microbiologists.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 75 (4), 583-609 (2011).</li><li>Scherlach, K., Graupner, K., Hertweck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+bacteria-fungi+interactions:+effects+on+environment,+food,+and+medicine.">Molecular bacteria-fungi interactions: effects on environment, food, and medicine.</a> Annu. Rev. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microplate+spectrofluorometric+assay+for+bacterial+biofilms.">A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms.</a> J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34 (1), 1-4 (2007).</li><li>Berne, C., Ducret, A., Hardy, G. G., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesins+Involved+in+Attachment+to+Abiotic+Surfaces+by+Gram-Negative+Bacteria.">Adhesins Involved in Attachment to Abiotic Surfaces by Gram-Negative Bacteria.</a> Microbiol. Spectr. 3 (4), 1-45 (2015).</li><li>Schlafer, S., Garcia, J. E., Greve, M., Raarup, M. K., Nyvad, B., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+with+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Daddi Oubekka, S., Briandet, R., Fontaine-Aupart, M. P., Steenkeste, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+time-resolved+fluorescence+microscopy+to+assess+antibiotic+diffusion-reaction+in+biofilms.">Correlative time-resolved fluorescence microscopy to assess antibiotic diffusion-reaction in biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 56 (6), 3349-3358 (2012).</li><li>Almeida, C., Azevedo, N. F., Santos, S., Keevil, C. W., Vieira, M. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Biofilm batterici vengono recuperati in molti ambienti e sono stati studiati dal 1950, portando allo sviluppo di una serie di metodi per analizzarli 24. I metodi classici per quantificare e biofilm del monitor comprendono saggi di micro-titolazione e, il metodo più diffuso, viola cristallo (CV) colorazione. Questi metodi sono veloci, a basso costo, e maneggevole 25 e sono particolarmente utili per quantificare biomassa totale biofilm o per eseguire saggi di vitalità e matrice di quantificazione. Su un altro lato, metodi &quot;omiche&quot; sono anche utili in studi biofilm, consentendo analisi quantitative e funzionali di biofilm 26, 27. Nonostante i vantaggi della piastra micro-titolazione e &quot;omiche&quot; metodi, diverse caratteristiche essenziali del biofilm non possono essere catturate con queste tecniche, ostacolando una completa comprensione di questo processo. Tali caratteristiche comprendono struttura a matrices, architetture colonia batterica, le interazioni delle cellule / cellulari e modelli di colonizzazione, che sono i dati fondamentali per comprendere sia il funzionamento dei biofilm e le dinamiche della loro formazione. Nonostante la capacità della microscopia a catturare queste caratteristiche, l&#39;analisi al microscopio di biofilm batterici su funghi filamentosi sono ancora scarse. Ciò è dovuto principalmente alla crescita di funghi filamentosi, che spesso forma colonie di spessore, complessi, reti tridimensionali. La formazione di biofilm batterici su funghi è comune in ambienti diversi ed è significativamente coinvolto in vari campi 4 (ad esempio, la medicina, l&#39;agricoltura e l&#39;ambiente.); di conseguenza, è fondamentale per lo sviluppo di nuovi metodi per facilitare la loro indagine. A questo scopo, abbiamo combinato un metodo per generare colonie fungine molto sottili con immagini microscopiche dei biofilm batterici. Inoltre, abbiamo proposto una serie di strumenti per l&#39;analisi di microscopia qualitativamente questi biofilm. Il successo del metodo si basa sula capacità di produrre colonie ifali molto sottili e di applicare le tinture appropriate. Questi punti sono discussi di seguito. A causa delle complesse strutture dei biofilm, la comprensione della loro funzione richiede un approccio multi-scala 28, 29. Modelli di distribuzione dei biofilm, architettura batteriche colonia, e struttura a matrice e la composizione vengono analizzati a diverse scale (cioè, meso-scala e di micro-scala). Inoltre, la risoluzione nanoscala consente l&#39;accesso alle interazioni fisiche cellule / cellulari e nano-struttura della matrice. Così, il metodo sviluppato permette facilmente una analisi multi-scala dei biofilm batterici formate sulla colonia fungina. Nella maggior parte degli studi, LSCM analisi dei biofilm sono limitati al micro-scala, il meso-scala di solito viene eseguita da tomografia a coerenza ottica 30, 31, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 32. Il metodo presentato qui permette sia micro- e meso-scala analisi per LSCM. Ciò dimostra l&#39;utilità di combinare entrambe le analisi nella stessa regione del campione e anche sulla stessa immagine utilizzando microscopi confocali nuova generazione con alta risoluzione (Figura 3). Così, le questioni legate ai dati raccolti raccolti alle diverse scale con metodi diversi sono qui evitate. Questa combinazione di analisi dato accesso concomitanza alla ripartizione biofilm sulla colonia fungina, l&#39;architettura colonia batterica lungo il biofilm sviluppo, e la struttura a matrice. L&#39;analisi meso scala ha mostrato una distribuzione eterogenea dei biofilm batterici sulle colonie fungine (figure 2 e 3). Questa osservazione non sarebbe stato possibile con protocolli che permettono solo l&#39;imaging di una piccola porzione della colonia fungina, che non è necessariamente rappresentativo dell&#39;intera colonia. Così, mentrespesso trascurato, l&#39;analisi meso-scala può dare preziose informazioni su modelli di distribuzione biofilm. Infine, il metodo sviluppato può essere utilizzato per analizzare campioni con diverse tecniche di microscopia, compresa la microscopia elettronica a scansione. Qui, SEM è stato utilizzato per raggiungere la nano-scala e di ottenere l&#39;organizzazione spaziale dei batteri all&#39;interno del biofilm. Si è comportato molto bene con le colonie fungine sottili, mentre SEM permesso solo di immagini di superficie. In contrasto LSCM, SEM, tuttavia, disidratazione campione necessario e, molto spesso, rivestimento con un metallo conduttivo. Questo processo di disidratazione può alterare strutture biologiche quando non è eseguita correttamente, e può richiedere l&#39;ottimizzazione. Qui, la disidratazione campione utilizzando lenta liofilizzazione è stato utilizzato 33. Tuttavia, l&#39;applicazione sia LSCM e SEM ai campioni consentirà le prestazioni della microscopia correlativa nella stessa posizione del campione. Nonostante i vantaggisopra descritto, esistono alcune limitazioni. In primo luogo, potrebbe non essere applicabile a tutti i tipi di funghi. Infatti, questo metodo incubazione viene sviluppato per funghi diffusione radialmente sulla superficie del supporto solido. Questo metodo può non essere adatto per i funghi che formano ife principalmente antenna (ad esempio, Fusarium sp.) O per i funghi micro-aerobico diffusione principalmente all&#39;interno agar. Inoltre, i funghi degradanti cellophane può essere problematico pure (ad es., Trichoderma sp.). In secondo luogo, è importante notare che la strategia di colorazione è un punto critico e la scelta della macchia deve essere fatta con attenzione, come la macchia non deve disturbare il biofilm. Ad esempio, abbiamo notato che Calcofluor bianco causato interruzione biofilm parziale (dati non mostrati), probabilmente a causa del pH elevato di questa macchia. Inoltre, alcuni coloranti prodotti colorazione eterogenea (ad es., Rosso Congo), mentre altri hanno prodotto una colorazione omogenea (ad es., Colorazione parete cellulare con WGA lectina), dando una qualità d&#39;immagine eterogenea.Inoltre, è importante notare che alcuni coloranti potrebbero non essere pienamente specifico. Ad esempio, macchie WGA non solo le pareti cellulari fungine, ma anche acido N-acetilneuraminico nelle pareti cellulari batteriche gram-positivi e adesine prodotte da batteri gram-positivi e quelli negativi durante la formazione di biofilm 34, 35. Pertanto, usando batteri proteine ​​fluorescenti tag e / o si raccomanda funghi per evitare di macchiare multipla. Se si utilizzano più coloranti, non devono interferire chimicamente, e il loro spettri di emissione non devono sovrapporsi. Meso-scala analizza richiedere una grande area di scansione, e quindi, LSCM può richiedere molto tempo (40 min a 1 h, a seconda dello spessore del campione) e bottleneck l&#39;analisi di un gran numero di campioni. Tuttavia, le regolazioni possono essere effettuate a seconda del tipo di dati richiesti. È possibile ridurre il tempo di acquisizione e dimensioni dell&#39;immagine alterare la qualità dell&#39;immagine. Ad esempio, alta risoluzionenon è necessario analizzare la ripartizione generale biofilm. Infine, alcune limitazioni devono essere considerati quando si sceglie di visualizzare i dati di stack Z- come proiezioni 2D o 3D. proiezioni bidimensionali sono un buon modo per riassumere i dati, ma le informazioni di profondità è perso, e le strutture sovrapposte diventano nascosta. D&#39;altro canto, le proiezioni 3D consentono la visualizzazione da diversi punti di vista, ma spesso rendono poco in caso di complessità spaziale. In conclusione, abbiamo riportato un metodo per la caratterizzazione di biofilm batterici sulla ife a livello strutturale. La metodologia può essere estesa ad altre applicazioni. Infatti, questo metodo permette di effettuare caratterizzazione funzionale o chimica di biofilm batterici che formano sulla ife fungine. A causa della grande varietà di sistemi reporter fluorescente esistenti, analisi LSCM può essere utilizzato per diversi scopi 29. Ad esempio, il microfono a fluorescenzaroscopy potrebbe essere usato per monitorare il pH gradiente di 36 o diffusione molecola nel biofilm 37. Inoltre, il metodo consente di analizzare comunità in biofilm multispecie. Ad esempio, ibridazione in situ fluorescente mira gruppi di batteri specifici è particolarmente utile per studiare specifica ripartizione dei batteri nel biofilm multispecie 38, 39. Ultimo numerosi coloranti fluorescenti possono essere utilizzati per caratterizzare la composizione della matrice dei biofilm 21. Qui, le proteine sono stati designati con Sypro, che colora una vasta gamma di proteine, tra cui proteine della matrice (figura 4), ma altri coloranti consentono la visualizzazione di altre importanti costituenti della matrice, come esopolisaccaridi o DNA extracellulare. È interessante notare che tutte queste analisi potrebbero essere eseguite alla meso-scala utilizzando il metodo descritto. Poiché LSCM può essere eseguita su campioni di vita,è anche possibile ottenere immagini time-lapse utilizzando, ad esempio, camere, particolarmente adatto per colonie fungine sottili coverwell. Questa opzione è particolarmente interessante, in quanto la formazione di biofilm è un processo complesso e dinamico. Infine, per uno scopo quantitativa, il metodo riportato può migliorare l&#39;accuratezza dell&#39;analisi quantitativa automatica rendendo possibile questa quantificazione sulle immagini meso-scala. Questo può superare biofilm eterogeneità e questioni statistiche 29.

Funghi e batteri hanno molte opportunità di interagire con l&#39;altro, perché convivono nella maggior parte degli ambienti terrestri. A causa della loro diversità e la loro ubiquità, queste interazioni sono importanti in molti campi biologici, compresa la biotecnologia, agricoltura, industria alimentare, e la medicina 1, 2. Interazioni molecolari richiedono un certo grado di prossimità per consentire scambi tra le parti, e in alcuni casi, una associazione fisica dei partner è necessario per una interazione funzionale 3. Una associazione fisica comune tra batteri e funghi è la formazione di biofilm batterici sulle superfici fungine 4. Questo contatto diretto tra le cellule batteriche e ife fungine permette interazioni intime che sono coinvolti in vari processi biologici. Ad esempio, in medicina, lo studio della formazione di biofilm di Pseudomonas aeruginosa sul opportunistic funghi patogeni Candida albicans potrebbero fornire approfondimenti il legame tra la formazione di biofilm e virulenza 5. In agricoltura, studi suggeriscono che pianta-promotori della crescita rizobatteri e biocontrollo batteri hanno una maggiore efficienza quando associato ad un fungo in un biofilm misto. Ad esempio, elkanii Bradyrhizobium hanno migliorato N 2 attività -fixing quando associata con Pleurotus ostreatus in un biofilm misto 6. Infine, nel biorisanamento, batteri-fungine biofilm misti sono stati utilizzati per la bonifica dei siti inquinati 7, 8. LSCM è particolarmente adatto per studiare biofilm quanto consente un&#39;osservazione tridimensionale di biofilm idratati con pretrattamenti vita minimo, mantenendo così la struttura biofilm e di organizzazione. Così, l&#39;analisi biofilm da LSCM è molto istruttivo, soprattutto per detERMELLINO l&#39;andamento temporale della formazione di biofilm e la rilevazione di stadi caratteristici 9, 10, dalla fase di adesione allo sviluppo di un biofilm maturo. E &#39;inoltre particolarmente adatto per visualizzare la struttura biofilm e la matrice 11, 12 o quantificare la dimensione biofilm 13, 14. Anche se questo metodo è adatto per studiare biofilm su superfici biotici abiotici o sottili, studiando biofilm batterico su una colonia filamentosa fungina è ancora molto impegnativo. In effetti, la maggior parte dei funghi filamentosi costruire spessi, complessi, reti tridimensionali nella cultura. Anche se gli oggetti spessi possono essere esposte al microscopio confocale, l&#39;attenuazione della penetrazione laser e l&#39;emissione di fluorescenza spesso diminuiscono la qualità delle immagini finali su una profondità di 50 micron 15. Inoltre, perché colonie fungine non sono rigidi, it è difficile da gestire i microrganismi senza disturbare i biofilm. A causa dello spessore dei campioni, le poche analisi microscopiche di biofilm batterici su ife fungine sono di solito eseguite solo su una piccola parte della colonia fungina, contenente quindi solo poche ife 16, 17, 18. Tutto questo limita la nostra capacità di descrivere la distribuzione biofilm sulla colonia fungina e quindi può portare distorsioni nell&#39;analisi in caso di distribuzione eterogenea del biofilm all&#39;interno della colonia fungina. Per superare queste difficoltà, riportiamo un metodo per la crescita e l&#39;analisi del biofilm batterico sulle ife fungine. Questo metodo è stato applicato per studiare la formazione di biofilm in Pseudomonas fluorescens BBC6 sul ife del basidiomicete ectomicorrizici Laccaria bicolor S238N. Questi due microrganismi foresta-suolo sono stati precedentemente descritti a forma mistastrutture biofilm-come 19, 20. Questo metodo può essere facilmente ulteriormente adattata ad altri sistemi fungine / batterica filamentosi. Il metodo qui presentato si basa sulla combinazione di un metodo di coltura fungina, permettendo la crescita di colonie fungine molto sottili, con LSCM e immagini SEM. Ciò ha permesso di ottenere micro- (range micron) e meso (range mm) scala vista della interazione tra i due microrganismi, consentendo la caratterizzazione qualitativa del biofilm. Abbiamo anche dimostrato che i campioni possono essere osservati al SEM, permettendo l&#39;analisi strutturale del biofilm a livello di nanoscala (range nm).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1069">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">6 well Falcon Tissue Culture Plates</td>
			<td style="width:381px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">08-772-33</td>
			<td style="width:141px;">Used in 2.2 &#38; 3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Congo Red</td>
			<td style="width:381px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">C580-25</td>
			<td style="width:141px;">Used in 3.1.4.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">FUN 1 Cell Stain</td>
			<td style="width:381px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">F7030</td>
			<td style="width:141px;">Used in 3.1.4.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate</td>
			<td style="width:381px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">W21404</td>
			<td style="width:141px;">Used in 3.1.4.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">DAPI solution</td>
			<td style="width:381px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">62248</td>
			<td style="width:141px;">Used in 3.1.4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:381px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P3566</td>
			<td style="width:141px;">Used in 3.1.4.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain</td>
			<td style="width:381px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">F10318</td>
			<td style="width:141px;">Used in 3.1.4.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td>
			<td style="width:381px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">OB100-01</td>
			<td style="width:141px;">Used in 3.1.7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">LSM780 Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:381px;">Zeiss</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:141px;">Used in 3.2.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZEN 2.1 lite black software&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Zeiss</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:141px;">Used in 3.2.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">High Vacuum Coater Leica EM ACE600</td>
			<td style="width:381px;">Leica</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:141px;">Used in 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">GeminiSEM-FEG</td>
			<td style="width:381px;">Zeiss</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:141px;">Used in 4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new method for qualitative multi-scale analysis of bacterial biofilms on filamentous fungal colonies using confocal and electron microscopy

biofilm batterici si formano frequentemente sulle superfici fungine e possono essere coinvolti in numerosi processi di interazione batteri-fungine, come la cooperazione metabolico, la concorrenza o predazione. Lo studio dei biofilm è importante in molti campi biologici, tra cui scienze ambientali, la produzione di cibo e medicine. Tuttavia, pochi studi si sono concentrati su tali biofilm batterici, in parte a causa della difficoltà di indagare. La maggior parte dei metodi di biofilm qualitativa e quantitativa analisi descritti in letteratura sono adatti solo per biofilm formano sulle superfici abiotici o su superfici biotici omogenee e sottili, come un monostrato di cellule epiteliali. Mentre scansione laser confocale (LSCM) è spesso usato per analizzare in situ ed in vivo biofilm, questa tecnologia diventa molto difficile quando applicato a biofilm batterici su ife fungine, a causa dello spessore e le tre dimensioni della propria rete ifaleOrchi. Per ovviare a questo inconveniente, abbiamo sviluppato un protocollo che combina microscopio con un metodo per limitare l&#39;accumulo di strati ifali in colonie fungine. Utilizzando questo metodo, siamo stati in grado di studiare lo sviluppo di biofilm batterici su ife fungine a scale multiple utilizzando sia la microscopia elettronica a scansione e LSCM (SEM). Questo rapporto descrive il protocollo, tra le culture di microrganismi, le condizioni di formazione di biofilm batterici, biofilm colorazione, e LSCM e visualizzazioni SEM.

La procedura schematica complessiva della cultura fungina e preparazione biofilm sono indicati nella figura 1. Il metodo di cultura ha permesso di ottenere colonie fungine da 20 a 50 micron di spessore contenenti alcuni strati di ife, permettendo micro- e meso-scala analisi del biofilm vita idratato utilizzando LSCM. L&#39;applicazione del metodo consentito l&#39;acquisizione di immagini di alta qualità di P. fluorescens biofilm BBC6 su L. bicolor ife lungo la formazione del biofilm (figure 2 - 4). L&#39;analisi meso-scala biofilm dimostrato la distribuzione eterogenea del biofilm di P. fluorescens BBC6 sulla ife di L. bicolor S238N (figure 2 e 3). Analisi meso-scala ha consentito anche per il monitoraggio della formazione di biofilm nel tempo (Figura3) dai primi passaggi, in cui solo alcuni batteri sono stati attaccati ife (figura 3a), per la formazione di uno spesso, biofilm maturo (Figura 3b). L&#39;alta risoluzione delle immagini meso scala permesso di effettuare analisi micro-scala sulle stesse immagini per ottenere le architetture colonia (Figura 3c - d). L&#39;analisi micro-scala combinata con l&#39;etichettatura specifica ci ha permesso di fare un passo ulteriore nella caratterizzazione di biofilm. Qui, SYPRO rubino 23, che etichette maggior parte delle classi di proteine, è stato applicato ai campioni (Figura 4) e mostra la presenza di proteine nella matrice. Infine, ulteriori dettagli della struttura biofilm sono stati ottenuti mediante SEM imaging stesso campione dopo disidratazione e rivestimento (Figura 5). immagini SEM fornitoaccesso al livello di nanoscala, dando così l&#39;accesso alla struttura a matrice. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig1.jpg" /> Figura 1: procedura generale schematica della cultura fungina e la preparazione biofilm. Questa figura descrive le principali fasi del metodo, dalle culture di microrganismi di analisi dei campioni. Maggiori dettagli sono riportati nel protocollo. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54771/54771fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig2.jpg" /> Figura 2: BBC6 biofilm ripartizione sulla colonia fungina. Il campione è stato ripreso dopo 18 ore di interazione a 10X di ingrandimento. L&#39;immagine è stata ottenuta tramite 2D proiezione massima intensità delle immagini microscopia confocale in 3D. La griglia grigio sul figure raffigura le posizioni mosaico. L. bicolor ife sono macchiati con il Congo Red (rosso) e batteri sono GFP-tagged (verde). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54771/54771fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig3.jpg" /> Figura 3: fasi precoci e tardive di formazione di biofilm BBC6 su L. bicolor ife. Questa immagine è stata ottenuta tramite 2D proiezione massima intensità delle immagini microscopia confocale in 3D. Imaging è stata effettuata a 40X di ingrandimento. (A) biofilm ripartizione dopo 2 ore di interazione. (B) biofilm ripartizione dopo 14 ore di interazione. (C) L&#39;allargamento del rettangolo bianco in (a). (D) L&#39;allargamento del rettangolo bianco in (b). ife fungine sono macchiati con il Congo Red (rosso) e batteri sono GFP-tagged (verde). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54771/54771fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig4.jpg" /> Figura 4: Matrice colorazione di BBC6 biofilm su L. bicolor ife. (A) biofilm dopo 16 ore di interazione. (B) L&#39;allargamento del rettangolo bianco in (a). Imaging è stata eseguita a 40X di ingrandimento, e queste immagini sono state ottenute tramite 2D proiezione massima intensità delle immagini microscopia confocale in 3D. I batteri sono GFP-tagged (verde), il fungo è macchiato con Fun1 (verde scuro), e le proteine ​​vengono colorate con S. rubino (rosso). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54771/54771fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 5: SEM imaging biofilm BBC6 su L. bicolor ife. SEM Imaging è stata effettuata a 2360X, EHT: 1 kV. Prima di imaging, il campione è stato lentamente liofilizzato nella camera SEM e rivestito con platino. Le frecce verdi indicano biofilm batterici e frecce gialle indicano ife fungine. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54771/54771fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per crescere e qualitativamente analizzare biofilm batterici su ife fungine mediante microscopia confocale ed elettronica.

Un nuovo metodo per l&#39;analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

a-new-method-for-qualitative-multi-scale-analysis-bacterial-biofilms

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.4K Views.  INRA Université de Lorraine.  Questo protocollo descrive un nuovo metodo per crescere e qualitativamente analizzare biofilm batterici su ife fungine mediante microscopia confocale ed elettronica. 

Video: A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Forno a microonde Assist diagnosi rapida di malattie virali piante da microscopia elettronica a trasmissione

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

Visualizzazione delle risposte tossina batterica provocata con diretta microscopia a fluorescenza cellulare

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Valutare l&#39;attività anti-fungina isolato Alveolar macrofagi dal Microscopia confocale

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologie per lo studio<em&gt; B. subtilis</em&gt; I biofilm come modello per Caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Immagini dal vivo di antifungini attività da Human neutrofili e monociti primaria in risposta a<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Visualizzazione del macrofago trappole extracellulari mediante microscopia confocale

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.