This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).

1. Scheda membrana Preparazione e fissaggio <ol><li> Preparare fogli di membrana etichettati con IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 <ol><li> Preparare il DNA codifica plasmide IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 23 utilizzando tecniche standard di biologia molecolare. </li><li> Cultura INS-1 le cellule su # 1.5 18 mm coprioggetto tondo pre-rivestito con 30 ug / ml fibronectina al 50-70% di confluenza seguente INS-1 protocolli standard di coltura cellulare 38,39. Trasfezione delle cellule un giorno dopo viene raggiunto dal 50 al 70% di confluenza. </li><li> Cellule trasfezione con IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 utilizzando liposomi reagente di trasfezione seguendo protocolli del produttore. Dopo trasfezione, permettono alle cellule di crescere per 48 ore. </li><li> Il giorno dell&#39;esperimento, coprioggetto cappotto (su un lato) con ~ 0.5 - 1 ml della 500 ug / ml poli-D-lisina (PDL, diluiti in dH 2 O) per 1-2 ore. Poi scolare PDL mettendo un carta velina suil bordo del vetrino. Posizionare i coprioggetti su una (C 4 °) piastra metallica pre-raffreddata per un uso successivo. </li><li> Lavare pre-transfettate cellule INS-1 che crescono su vetrini con ~ 0,5-1 ml ghiacciata PBS (PBS) contenente 1 mM EGTA. Ripetere il lavaggio tre volte e scarico PBS. </li><li> Posizionare il coprioggetto con cellule in coltura (cella sul lato rivolto verso il basso) sui vetrini PDL-rivestito su una lastra di metallo pre-raffreddata con un paio di pinzette. Lasciare il piatto in frigorifero (4 ° C) per 7 - 10 minuti per consentire alle cellule di allegare ai vetrini PDL rivestite (Figura 2). NOTA: Il tempo di incubazione dovrebbe essere nell&#39;intervallo di 7 - 10 min per una migliore attacco delle cellule alla superficie PDL rivestite. L&#39;ambiente frigorifero è asciutto e incubazione non dovrebbe essere troppo lungo. </li><li> Rimuovere la piastra metallica dal frigorifero. Delicatamente staccare il vetrino contenente le cellule pre-trasfettate con una pinzetta. Questo produce un sottile strato di foglio di membrana cellulare sullavetrino PDL-rivestito. lavare delicatamente i fogli di membrana con ~ 0,5-1 ml ghiacciata PBS e poi fissare con ~ 0,5-1 ml ghiacciata% paraformaldeide 4 (PFA) + 0,2% glutaraldeide (GA) in PBS per 15 minuti a 4 ° C. Attenzione: Paraformaldeide e glutaraldeide sono tossici. gestirli in una cappa aspirante con la pelle e protezione per gli occhi. </li><li> Dopo la fissazione, l&#39;immagine dei fogli di membrana immediatamente (vedere paragrafo 3) o conservare in ~ 0,5-1 ml di PBS a 4 ° C. NOTA: Dopo aver sistemato il foglio di membrana, non ci sarà alcun legame di sonde PH dal citoplasma al PI (4,5) P2 equilibrio. Le sonde PH legati gradualmente dissociarsi dal foglio di membrana e diffondere nella soluzione (anche se potrebbe richiedere giorni o settimane). Pertanto, si raccomanda di immagine i campioni fissati subito dopo la preparazione del campione. </li></ol></li><li> Preparare fogli di membrana per PI (4,5) P2 specifica etichettatura degli anticorpi <ol><li> Cultura INS-1 celle # 1.5, 18 mm coprioggetto tondo pre-rivestito con 30 &amp;# 181; g / ml fibronectina al 50% -70% di confluenza. cellule trasfezione con DNA plasmidico il giorno successivo come descritto al punto 1.1.3. </li><li> Ripetere i passaggi da 1.1.4 a 1.1.7 come descritto sopra. NOTA: Eseguire le seguenti procedure a 4 ° C. </li><li> Lavare i coprioggetti contenenti fogli PM fisse per tre volte con ~ 0,5-1 ml ghiacciata PBS contenente 50 mM NH 4 Cl. Placare i fogli con ~ 0,5 - boroidruro di sodio 1 ml di 0,1% in PBS per 7 minuti, e lavare con ~ 0,5 - 1 ml di PBS (senza 50 mM NH 4 Cl). </li><li> Bloccare i campioni con ~ 0,5 - 1 ml soluzione bloccante (soluzione PBS contenente 5% (v / v) di siero normale di capra, 5% (v / v) albumina di siero bovino e 50 mM NH 4 Cl) per 45 min. Poi, incubare con ~ 0,5 - 1 ml PI primario (4,5) P 2 anticorpo (1: 300 diluizione) in soluzione bloccante per 1 ora. Lavare tre volte (10 min) di volta in volta con ~ 0,5 - 1 ml di PBS contenente 50 mM NH 4 Cl. </li><li> Incubare i campioni con ~ 0,5 - 1 ml secondaria F (ab &#39;) 2-capra-anti-topoanticorpi coniugati con fluorofori (1: 300) in tampone di bloccaggio per 1 ora. Lavare tre volte con ~ 0,5-1 ml di PBS. </li><li> campioni post-fix 4% PFA + 0,2% GA per 15 minuti, poi lavare campioni tre volte con PBS (7 min ogni volta). Procedere alla Sezione 3 per l&#39;imaging o conservare in ~ 0,5 ~ 1 ml di PBS a 4 ° C per un uso successivo. NOTA: Preparare i campioni a 4 ° C. Utilizzare 4% PFA + 0,2% GA fissativo per preservare la distribuzione fisiologica del fosfoinositidi nel PM. RT preparazione o di fissazione con 4% PFA sola possono causare artefatti significativi (Figura 4). </li></ol></li></ol> 2. Preparazione coltura cellulare per live-cell imaging con mEOS3.1-PH PLC δ1 <ol><li> Preparare il plasmide DNA codificante il δ1 mEOS3.1-PH PLC come descritto in precedenza 23. </li><li> Cultura INS-1 le cellule su # 1.5 18 millimetri rotonda coprioggetto pre-rivestita con 30 ug / ml di fibronectina fino a raggiungere il 50% -70% ConfLuency seguente INS-1 protocolli standard di coltura cellulare 38,39. </li><li> Il giorno seguente, trasfezione le cellule INS-1 con il mEOS3.1-PH PLC δ1 plasmide DNA utilizzando liposomi reagente di trasfezione seguendo il protocollo del produttore. Incubare per 48 ore prima di imaging. </li></ol> 3. PALM Acquisizione di immagini di fogli di membrana e cellule vive <ol><li> PALM acquisizione di immagini di fogli di membrana NOTA: Qui, una riflessione di fluorescenza interna (TIRF) sistema basato SMLM microscopio totale (olio 100X, APO, NA = 1,49, WD 0,12 millimetri) 23 viene utilizzato per tutti l&#39;acquisizione delle immagini. <ol><li> Prima di imaging, diluire 1 ml di soluzione di perline fluorescenti in 10 ml di PBS + 50 mM MgCl 2. Aggiungere 200 ml diluito soluzione nei campioni di cellule contenenti camera di imaging (da passaggi 1.1.8 / 1.2.6) per 10 min. Poi, lavare con PBS per tre volte. </li><li> Avviare il sistema di imaging PALM. Nel software di imaging associato, selezionare il &quot;canale IRFP &amp;# 34; tasto (642 nm laser di eccitazione, 700/75 nm di emissione). Trova la membrana cellulare che esprime sonde PH nel canale IRFP. NOTA: Il foglio membrana deve avere un tallone fluorescente nelle vicinanze. Questo è necessario per la correzione della deriva tardi. </li><li> Utilizzare il pulsante &quot;cattura&quot; per raccogliere un&#39;immagine TIRF convenzionale della membrana cellulare in canale IRFP come riferimento per la futura ricostruzione dell&#39;immagine. Impostare un angolo TIRF normale (vale a dire, dopo aver raggiunto l&#39;angolo critico, girare un altro 1,5 gradi) digitando nel 2140 in un angolo TIRF impostazione per l&#39;imaging. Utilizzare questa impostazione per tutte le fasi, salvo diversa indicazione angolo. NOTA: Nel sistema TIRF qui descritto, 3500 è l&#39;angolo verticale fino, 2200 è l&#39;angolo critico TIRF e 2140 è l&#39;angolo TIRF normale, che è 1,5 gradi più dopo TIRF angolo critico. L&#39;angolo TIRF stretto di seguito indicate in 3.2.3 è 2120, che è un altro 2 gradi dopo aver raggiunto TIRF angolo critico. </li><li> Passare al canale PAmCherry1 cliccando °pulsante del canale RFP e (561 nm di eccitazione, 600/50 filtro per le emissioni nm). Regolare la barra di scorrimento nel pad &quot;AOTF&quot; tutta la strada per il diritto di avere il potere di illuminazione piena di laser 561 nm per 10-20 secondi per sbiancare la fluorescenza di fondo membrana. </li><li> Impostare l&#39;impostazione ottimale della telecamera (binning 2x2) nella scheda &quot;Formato&quot; e il protocollo di acquisizione veloce nella scheda &quot;acquisizione sequenza ND&quot; (tipicamente 10,000-40,000 immagini a 20 Hz). </li><li> Inizia l&#39;acquisizione di immagini PAmCherry1 (561 nm laser a piena potenza, 50 msec / telaio) con contestuale attivazione del laser 405 nm ad un livello basso (0,1% - 1%), facendo clic sul pulsante &quot;Esegui ora&quot;. Regolare l&#39;intensità del laser 405 nm in modo che spazialmente isolati singoli punti in ogni frame sono facilmente identificabili. NOTA: Il numero di molecole PAmCherry1 attivabili diminuisce gradualmente durante l&#39;acquisizione. 405 nm intensità del laser dovrebbe essere gradualmente aumentata per mantenere la densità ottimale dei singoli segnali molecola in ciascunatelaio. </li><li> Continuare fino a quando l&#39;acquisizione di immagini viene attivato alcun segnale PAmCherry1 singola molecola. </li></ol></li><li> l&#39;imaging PALM in cellule vive <ol><li> Prima di imaging, diluire perline fluorescenti nella camera di imaging per 10 minuti come descritto al punto 3.1.1. Quindi avviare l&#39;imaging PALM aprendo il software di imaging associato. NOTA: Utilizzare un magnetico a sgancio rapido camera di imaging per l&#39;imaging dal vivo di cellule. Mantenere il centro del campo dell&#39;imaging a 35 ° C con un regolatore di temperatura sotto costante perfusione con tampone extracellulare (extracellulare Soluzione: 135 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,6 mM CaCl 2, 1.2 mM MgCl 2, 3 mM di glucosio, e 20 mM HEPES, pH = 7.3). </li><li> Scegliere il pulsante del canale GFP (525/50 nm di emissione). Identificare la membrana cellulare che esprime sonde fluorescenti in base fluorescente verde da mEOS3 sotto 488 nm eccitazione laser. Assicurarsi che perline fluorescenti nelle vicinanze sono inclusi anche durante l&#39;imaging come questo sono necessari in seguito per dri in lineaCorrezione ft. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Capture&quot; per raccogliere un&#39;immagine TIRF della membrana cellulare in mEOS3 (verde) canale come immagine di riferimento. Utilizzare un superficiale evanescente illuminazione d&#39;onda di eccitazione (dopo aver raggiunto l&#39;angolo critico, girare un altro 2 gradi) digitando nel 2120 in un angolo TIRF impostazione per l&#39;imaging dal vivo di cellule. NOTA: Questo minimizza la fluorescenza dal non legato mEos3-PH nella adiacente citosol alla membrana plasmatica. </li><li> Passare al &quot;canale di RFP&quot; pulsante (561 nm di eccitazione, 600/50 nm di emissione). Utilizzare la piena potenza del laser 561 nm di candeggina fluorescenza di fondo dei fogli di membrana per 10 ~ 20 sec con la barra di scorrimento nella &quot;pad AOTF&quot; (vedi 3.1.4). </li><li> Inizia l&#39;acquisizione di immagini facendo clic sul pulsante &quot;Esegui ora&quot; nel canale rosso (561 nm piena potenza, fissato a 10 msec / frame nella &quot;camera&quot; impostazione scheda), con contestuale attivazione del laser 405 nm. Regolare l&#39;intensità del laser 405 nm per attivare punti spazialmente separatiin ogni frame. NOTA: Come procede di acquisizione, un convertito mEOS3.1-PH PLC δ1 numero molecola diminuisce lentamente. Aumentare gradualmente la potenza del laser 405 nm per ottimizzare il segnale singola molecola. La lunghezza acquisizione immagini dipende dallo scopo sperimentale. Acquisire immagini in modo continuo per 5 minuti in condizioni normali. Se è necessaria una acquisizione più lungo, raccogliere più pile di immagini al posto di un unico, grande serie di immagini. La dimensione del file di ogni pila di immagini non deve superare i 4 GB o interesserà l&#39;analisi del software in seguito. </li></ol></li></ol> 4. SMLM Image Processing e la ricostruzione <ol><li> Trasferire i file di immagine (.tif immagine pile) a una stazione di analisi delle immagini. Avviare il programma di ricostruzione delle immagini (su scritta) in Matlab come descritto in precedenza 37 e caricare la pila di immagini facendo clic sulla scheda &quot;File&quot; nel menu principale, quindi &quot;aperto&quot;, quindi &quot;nuovo file&quot;. </li><li> Identificare e LocaLize singoli eventi molecolari da ogni fotogramma. Impostare filtraggio soglia intensità con un numero di soglia (1-10) nella &quot;wavelet&quot;. Verificare le impostazioni dei parametri ottimali per il rilevamento punto visivamente prima della ricostruzione. Poi vai alla scheda &quot;PALM&quot; e fare clic su &quot;un processo graduale&quot; per avviare la ricostruzione delle immagini. NOTA: soglia di intensità per la rilevazione punto è arbitraria e dipende dall&#39;esperienza personale. Diversi studi può essere richiesto di generare una soglia di rilevamento ottimale che ne raccoglie troppi non qualificato (dim) punti e dell&#39;elemento filtrante troppo molti punti qualificati (chiaro). Regolare gli altri parametri per ottimizzare l&#39;analisi dei dati. Qui, la distanza quartiere (punti di fluorescenza nei fotogrammi vicini all&#39;interno di una distanza vengono combinati) è impostato come 65 nanometri (1/2 larghezza in pixel) e montato come una singola molecola. telai Gap (eventi singoli molecola che si sono verificati all&#39;interno di queste cornici e quartiere distanza sono stati combinati e montato come un singolo evento molecola) èimpostato come 26 fotogrammi (1,3 sec) per l&#39;imaging PAmCherry1 40. Regolare questi parametri in base alle proprietà di sonde di singola molecola e la velocità di acquisizione per evitare un eccesso di conteggio 40 in SMLM. Applicare correzione della deriva con perline fluorescenti durante le ricostruzioni. <ol><li> Per l&#39;imaging i fogli di membrana fissi etichettati da IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1, ricostruire l&#39;intero stack di immagini provenienti dallo stesso foglio di membrana di una singola immagine super-risoluzione 37 in. </li><li> Per campioni di cellule vive etichettati da mEOS3.1-PH PLC δ1, separano l&#39;intera pila di immagini in diversi piccoli stack di 1.000 fotogrammi in modo che pila 1,000 consecutivi-frame viene ricostruita come immagine super-risoluzione singolo, che ha una risoluzione temporale 10 sec. Alla fine, combinare tutte le immagini serie temporali nella serie pila tempo finale 23. NOTA: In immagini PALM live-cella, un piccolo numero di sonde attivati ​​può muovere o dissociarsida PI (4,5) P 2 nel PM prima sbianca. Per spiegare il sovracampionamento delle sonde, si combinano i segnali singola molecola nei fotogrammi vicini all&#39;interno di 130 nm (invece di 65 nm) in un unico evento di emissione durante l&#39;analisi delle immagini. </li></ol></li><li> Dopo aver ottenuto le immagini ricostruite, effettuare ulteriori analisi di immagine con il programma personalizzato scritto in Matlab per quantificare la densità molecola, la densità micro-dominio / dimensioni, e l&#39;analisi cluster con coppia di correlazione 41. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Per la risoluzione dei problemi, due processi hanno bisogno di attenzione in più: la produzione di fogli di membrana e la fissazione del campione. Come descritto nel protocollo, il tempo di incubazione dei vetrini al punto 1.1.6 è importante per la produzione di fogli di membrana. Tempo di incubazione ottimale sotto la nostra condizione sperimentale è 7-10 min (Figura 2). Più di 10 min di incubazione produrrà cellule intatte invece dei fogli di membrana su vetrini PDL e di incubazione più breve porterà a meno o nessun fogli di membrana sui vetrini PDL-rivestite. Come descritto nel protocollo, i fissativi e la temperatura durante la fissazione sono fondamentali per il mantenimento della PI (4,5) Distribuzione P 2 nel PM. Fissazione a temperatura ambiente o l&#39;uso del solo 4% -PFA potrebbero distorcere la distribuzione normale dei lipidi nel PM. Applicando la microscopia PALM alla membrana lipidica di ricerca, siamo in grado di osservare la distribuzione scala nanometrica di PI (4,5) P2, un phosphoinositide chiave che media mtutte le attività cellulari fondamentali. Questa distribuzione spaziale di PI (4,5) P2 con gradienti di concentrazione limitati in INS-1 le cellule fornisce un quadro per ripensare le interazioni lipidi-proteine e gli eventi di segnalazione locali di PI (4,5) P2 in queste cellule. Inoltre, i metodi sviluppati in questo lavoro possono essere applicati anche ad altre ricerche fosfolipidi di membrana con sonde adeguate, in tal modo, offrendo nuovi strumenti per studiare fosfoinositidi nei processi biologici. L&#39;uso di fogli di membrana in questo lavoro bypassa due principali preoccupazioni negli studi morfologici fosfolipidi: trattamento detergente e il potenziale di contaminazione del segnale dal citoplasma. I detersivi sono spesso causa di clustering e significativa perdita di segnale PM fosfolipidi. La contaminazione del segnale citosolico è particolarmente problematico nel caso di basse fosfoinositidi abbondanza sulla PM 23, come PI (3,4,5) P 3 e PI (3,4) P 2. campioni foglio di membrana sono in grado di Circumvent questi problemi senza interrompere significativamente strutture associate con la membrana plasmatica, come corticale reticolo actina e pozzi clathrin rivestite 42,43. La distribuzione omogenea relativa del PI (4,5) P2 nel PM è in buon accordo con altri studi di congelamento rapido EM utilizzando sonde δ1 GST-PH PLC nella membrana dei fibroblasti 44. E &#39;importante notare che le condizioni di trattamento dei campioni impropri possono generare risultati fuorvianti. Innanzitutto, è fondamentale per eseguire le operazioni di fissaggio ad una temperatura inferiore (4 ° C) e usare il fissativo GA per la produzione di fogli di membrana. Come mostrato in figura 3, temperatura calda e fissazione PFA senza GA non è sufficiente fissare fosfoinositidi in PM cellule. Questo potrebbe distorcere il PI intatto (4,5) P 2 di distribuzione e generare cluster taglienti che non sono osservati in cellule vive in condizioni fisiologiche. In secondo luogo, l&#39;uso di PAmCherry1 comela sonda SMLM, piuttosto che altre sonde, è fondamentale per l&#39;imaging PALM quantitativa. Il beneficio dell&#39;applicazione PAmCherry1 proviene da sue singole foto-fisiche molecolari ben caratterizzati 35,40,45, quali luminosità, alta efficienza fotoattivazione e soprattutto, molto limitato foto-lampeggiante. Queste proprietà ci permettono di eliminare potenziali artefatti cluster da foto-lampeggiare e quantitativamente analizzare la densità molecolare di PI membrana (4,5) P 2. Questo approccio ha anche i suoi limiti. Innanzitutto, il metodo foglio membrana utilizzata in questo studio non può simulare perfettamente la distribuzione fisiologica di PI (4,5) P 2 perché la cella viene interrotto prima di imaging. Tuttavia, il nostro l&#39;imaging dal vivo PALM mostra simile distribuzione relativamente omogenea di PI (4,5) P2, sostenendo i risultati osservati con i campioni foglio membrana. In secondo luogo, come abbiamo discusso nel nostro precedente lavoro 23, SMLM richiede competenze di imaging e in più atenzione per evitare artefatti di imaging che potrebbero derivare da diversi processi, tra cui le sonde utilizzate, preparazione del campione e di fissazione, di campionamento di immagine e di ricostruzione. Infine, se sonde e anticorpi basato il dominio PH sono stati ampiamente utilizzati in studi fosfoinositide 46,47 rimane possibile che non tutte PI (4,5) P 2 nella membrana può essere rilevato da questo approccio. Ad esempio, PI (4,5) P 2 vincolato da altre proteine endogene potrebbe non essere accessibile a sonde pH o anticorpi, e questo può causare una sottostima della PI (4,5) P 2 causa l&#39;ostacolo spazio di sonda stessi. Un modo alternativo di etichettatura PI (4,5) P 2 sarebbe utilizzando Top-Fluor PI (4,5) P 2 48, un PI pre-marcato (4,5) P 2 analogico con una modifica sulla coda originale PI (4,5) P 2. Tuttavia, può essere convertito rapidamente in altri sottotipi di fosfoinositide veloce metabolismo cellulare in diretta dal suo anello inositolo è lo stesso di endogenous PI (4,5) P 2. Ciò solleva la preoccupazione se questo PI pre-marcato (4,5) P 2 analogici in cellule vive può rappresentare fedelmente PI (4,5) P2, piuttosto che i suoi prodotti metabolici. Pertanto, nonostante alcune limitazioni, le sonde a base di dominio PH sono ancora tra i migliori sonde che sono stati ampiamente utilizzati per monitorare la distribuzione PI (4,5) P2 e dinamiche sul PM delle cellule. La futura di tale metodologia può essere estesa ad altri studi fosfoinositide, come PI (3,4,5) P 3 e PI (3,4) P 2. In sintesi, l&#39;approccio SMLM romanzo qui utilizzato apre nuovi modi di studiare phosphoinositide nelle cellule. Utilizzando PI (4,5) P 2 come esempio, dimostriamo le proprietà uniche dell&#39;imaging PALM nello studio morfologico e quantitativa di molecole di membrana cellulare, così come i suoi svantaggi. Questo approccio può essere adattato ad altre molecole di interesse ed avrà ampie applicazioni in biologia cellulare.

Fosfoinositidi contribuiscono ad una piccola porzione dei lipidi totali di membrana, ma giocano ruoli critici in una varietà di processi cellulari. Essi comprendono sette membri derivati da fosforilazione reversibile o defosforilazione degli anelli inositolo il 3, 4 ° e 5 ° posizione 1. Phosphatidylinositol 4-fosfato (PI4P) e fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PI (4,5) P2) sono due importanti fosfoinositidi che funzionano in modo relativamente indipendente come i lipidi determinante della membrana plasmatica delle cellule (PM) 2,3. Fosfatidilinositolo (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) è molto meno abbondante rispetto PI4P e PI (4,5) P2, ma ha funzioni esclusive situate in diversi processi cellulari tra cui il cancro e il diabete 4 5. Questi lipidi sono interazioni molecolari complesse con i loro effettori e molte altre proteine. Pertanto, è fondamentale per comprendere l&#39;organizzazione spaziale di questi phosphoinositides nel PM su scala nanometrica. Prove di montaggio ha dimostrato che i complessi proteici o cluster molecola nelle aree PM ristretti possono servire come un segnale hotspot 6. Ad esempio, syntaxin 1a, una proteina chiave che regola la fusione delle membrane 7-9, visualizza organizzazione cluster nel PM. Distinto dal punto di vista del consenso dell&#39;organizzazione gruppo di syntaxin 1a, la distribuzione spaziale della fosfoinositidi nel PM è controversa. Modelli di distribuzione PI (4,5) P2 vanno da uniforme 10-12, grandi macchie 13,14, a densi ammassi 14-18, a seconda del tipo di cellule e dei metodi sperimentali utilizzati. L&#39;organizzazione spaziale di PI (4,5) P2 a più alta risoluzione è anche incoerente. Uno studio utilizzando stimolata emissione-deplezione (STED) microscopia 19 ha rivelato un gran numero di denso PI (4,5) P 2 nano-cluster (~ 73 nm di diametro) in fogli PM del PC-12 celle 20 </sup&gt;. Questo risultato è diverso da studi che utilizzano la microscopia congelamento rapido elettronica (EM) 21,22, un approccio che conserva la struttura intatta PM di cellule vive molto meglio di fissaggio chimico. Quest&#39;ultimo ha mostrato pool distinti di PI (4,5) P2; PI relativamente concentrato (4,5) P 2 in caveolae e rivestiti pozzi nonché distribuzione uniforme sulla regione PM piatta. Inoltre, PI scala nanometrica (4,5) P 2 organizzazione in fogli di membrana può differire in cellule vive e fissi. Il nostro recente lavoro ha studiato questo problema nelle cellule sia fisse e vivere INS-1 utilizzando singola molecola di localizzazione microscopia (SMLM) 23. SMLM si riferiscono al stocasticamente accendere solo un piccolo sottoinsieme di fluorofori in ogni momento in modo che i singoli fluorofori possono essere localizzati con alta precisione. Molti approcci di imaging super-risoluzione sono stati sviluppati usando principi simili a superare il limite di diffrazione di microscopia ottica convenzionale, come uns fotoattivazione localizzazione microscopia (PALM) 24, a fluorescenza fotoattivazione localizzazione microscopia (FPALM) 25, stocastico ricostruzione microscopia ottica (Storm) 26,27 e la tempesta diretta (dSTORM) 28. Con foto-commutabile o fluorofori fotoattivabile (coloranti o proteine fluorescenti), tecniche di SMLM permettono agli scienziati di strutture biologiche di immagini a risoluzione nanometrica 24,29,30 con il video-rate nelle cellule viventi 31,32. Utilizzando PI (4,5) P2 a titolo di esempio, abbiamo introdotto l&#39;approccio SMLM per studiare la distribuzione su scala nanometrica di fosfoinositidi sul PM. Il dominio PH di PLCδ1 (fosfolipasi C δ1) che si lega specificamente a PI (4,5) P2 è una sonda consolidata per l&#39;imaging PI (4,5) P2 sub-cellulare di distribuzione e la dinamica 33,34 nel PM . Abbiamo geneticamente etichettato questo dominio con due proteine fluorescenti, PAmCherry1 35 e 36 IRFP </sup&gt; per la produzione di un dual-colore proteina di fusione (IRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (Figura 1A-B). PAmCherry1 funge da sonda fotoattivabile di dominio PH per Palm e IRFP serve come un indicatore generale per identificare le cellule trasfettate prima dell&#39;acquisizione PALM . Applichiamo questa sonda fluorescente a due colori per l&#39;imaging SMLM nei fogli di membrana fissi. Per l&#39;imaging PALM vivo, abbiamo tagged mEOS3 37 anziché PAmCherry1 al dominio PH PLCδ1 per generare la sonda PLCδ1 mEOS3.1-PH per la migliore efficienza fotoni e la luminosità (Figura 1C-D). Imaging SMLM con queste nuove sonde nel PM di secernono insulina cellule INS-1 38 ha scoperto etichettatura omogenea di PI (4,5) P 2 nella maggior parte delle regioni PM e PI concentrato (4,5) P 2 microdomini che sono scarsamente mescolati nel PM piatto e alcune strutture filopodi simile 23. il nala distribuzione noScale di PI (4,5) P2 offre una base strutturale per ripensare come funziona nelle cellule viventi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="791">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;">Ti-U</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:199px;">Andor</td>
			<td style="width:184px;">Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning disk</td>
			<td style="width:199px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:184px;">CSU X-1, 10,000 rpm&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">&#160;High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers.</td>
			<td style="width:199px;">Agilent</td>
			<td style="width:184px;">MLC400</td>
			<td style="width:193px;">laser original powers &#38; powers at the end of optical fiber) 
			405nm: 15 mW &#38; 13 mW; 
			488nm: 45 mW &#38; 42 mW; 
			561nm: 45 mW &#38; 40 mW; 
			640nm: 35 mW &#38; 16 mW.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100X Objective</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nikon acquisition and analysis software(NIS Element)</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matlab</td>
			<td style="width:199px;">MathWorks</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coverslip</td>
			<td style="width:199px;">Warner</td>
			<td style="width:184px;">64-0714</td>
			<td>Round 18mm coverslip, #1.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td style="width:184px;">FC010-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Lipofectamin 3000(transfection reagent)</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:184px;">#16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PI(4,5)P2 1st antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">secondary antibody&#160; F(ab&#8217;)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetraspeck beads</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">magnetic quick release imaging chamber&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:184px;">Cat#641994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">temperature controller</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td>TC-344C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">3780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat serum</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2*2H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgCl2*6H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldyhyde</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule super-resolution imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the plasma membrane with novel fluorescent probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

L&#39;incertezza di localizzazione (σ) del nostro sistema di super-risoluzione è di 14.73 nm 23. Confronti diretti tra TIRF e immagini PALM dimostrato un significativo miglioramento della risoluzione spaziale. Figura 3A-B mostra il PI rappresentante (4,5) P 2 immagini TIRF etichettati con PI (4,5) P2 anticorpi e IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 in fogli tipici membrana e cellule vive. Le immagini con la microscopia TIRF convenzionale in fogli di membrana sono molto simili a quelle in cellule vive intatte etichettati con la proteina fluorescente verde maggiore (EGFP) tagged domini PH (EGFP-PH PLCδ1) (Figura 3C). Tutti i campioni hanno mostrato una distribuzione uniforme di sonde. Al contrario, la fissazione non ottimale dei campioni provocato PI densa tagliente (4,5) P 2 grappoli e una diminuzione dell&#39;intensità del segnale (figura 4). In condizioni ottimali di fissaggio, tsi immagini super-risoluzione di PI (4,5) P 2 in cellule fissate (Figura 5) ha rivelato una distribuzione omogenea di sonde in una porzione significativa del PM con solo gradienti di concentrazione limitato. Alcune patch di membrana arricchiti di PI (4,5) P 2 sonde sono state scarsamente distribuito e aveva varie dimensioni. Cellule vive immagini PALM mostrano una distribuzione spaziale simile a cellule fissate (Figura 6). L&#39;analisi dettagliata di PI (4,5) P 2 segnali oltre i risultati di orario a dinamiche veloci in aree locali, senza variazioni significative della loro abbondanza in vaste aree. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di sonde fluorescenti utilizzati in questo studio. Sonda (AB) IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 utilizzato negli esperimenti foglio membrana fissi. Durante l&#39;imaging TIRF convenzionale (A), una 640 nm<html> laser viene utilizzato per eccitare il IRFP (Es: 692 nm; em: 713 nm). Immagine TIRF preso in questa condizione serve come immagine di riferimento per TIRF imaging super-risoluzione ottenuta mediante imaging PALM (B). Un laser 405 nm viene utilizzata per foto-attivare il fluoroforo PAmCherry1 e un laser 561 nm viene utilizzato per eccitare PAmCherry1 (Es: 564 nm; em: 595 nm) per l&#39;imaging PALM. (CD) Sonda PLCδ1 mEos3.1-PH utilizzato negli esperimenti cellule vive. (C) durante l&#39;imaging TIRF convenzionale, un laser a 488 nm viene utilizzato per eccitare mEOS3.1 (Es: 506 nm; em: 519 nm). (D) Dopo fotoconversione da un laser 405 nm, mEos3.1 si trasforma in forma rosso (Es: 573 nm; em: 584 nm). E un laser a 561 nm viene utilizzato per le acquisizioni PALM <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande questa figura.</a> s / ftp_upload / 54466 / 54466fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Schema per la preparazione del foglio di membrana da INS-1 le cellule. (A) Posizionare il vetrino con cellule in coltura rivolti verso il basso su un vetrino PDL rivestite e attendere 7 ~ 10 minuti a 4 ° C per permettere l&#39;adesione delle cellule al PDL- vetrino rivestito. (B) Staccare il vetrino superiore con una pinzetta e fissare il foglio di membrana collegata al PDL coprioggetto pre-rivestito. (C) L&#39;immagine dei campioni con TIRFM e palme. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig3.jpg" /> Figura 3. PI (4,5) P 2 organizzazione spaziale è simile tra fogli di membrana e cellule vive intatte al microscopio TIRF convenzionale. (A) Atipica immagine TIRF di fogli di membrana fissata al 4 ° C con 4% PFA e 0,2% GA. PI (4,5) P2 è stato etichettato con PI (4,5) P2 anticorpo specifico. (B) Un foglio di membrana dalla cella INS-1 che esprimono IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1. Immagine (C) TIRF delle due cellule vive intatte che esprimono EGFP-PH PLCδ1 a diversi livelli. Barre di scala: (A): 3 m; (B) e (C):. 5 micron <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig4.jpg" /> Figura 4. PI (4,5) P 2 organizzazione spaziale in fogli di membrana è sensibile alle condizioni di fissazione comuni. (A) fogli di membrana fissata a 37 ° C con 4% PFA solae marcato con PI (4,5) P 2 anticorpo specifico (come nella Figura 3A). Strato (B) membrana fissata a RT con sola PFA ed etichettato con PI (4,5) P 2 anticorpo specifico. Si noti che i densi ammassi di PI (4,5) P 2 sonde sono chiaramente visibili sotto TIRF microscopio, in contrasto con le molto più anche immagini di fluorescenza mostrati nella Figura 3A. Barre di scala: AB:. 3 micron <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig5.jpg" /> Figura di imaging 5. palmo della PI (4,5) P 2 sonde rivela la loro distribuzione su scala nanometrica in un PM INS-1 delle cellule. (A) IRFP TIRF immagine di un foglio di membrana da una cellula INS-1 che esprimono IRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1. (B) immagine Palma di PM corrispondente nella stessa regione sulla base di ricostruzione del segnale PAmCherry1. Si noti il PI omogeneo (4,5) P 2 distribuzione spaziale nelle principali regioni pm e diversi PI (4,5) P 2 microdomini. (C) una vista ingrandita della zona di scatola in (B). Le frecce indicano scarsamente distribuiti microdomini PM arricchite con PI (4,5) P 2 sonde. Barre di scala: A e B: 3 micron; C: 500 nm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig6.jpg" /> Figura di imaging 6. PALM in vivo INS-1 le cellule. (A) immagine TIRF di PI (4,5) P2 in un live INS-1 delle cellule che esprimono mEos3.1-PH PLCδ1. L&#39;immagine è stata acquisita rapidamente nel canale verde prima acquisizione PALM (35 ° C). (B) live-cell immagini sequenziali di palma a 10 intervalli sec. Insets mostrano i profili di intensità della PI locale (4,5) P 2 densità lungo la stessa retta 1 posizione in tempi diversi in (B) e (C). Nota loro grandi variazioni di intensità locali entro 10 sec. (D) Tempo corso delle variazioni medie di intensità di PI (4,5) P 2 nella grande area (box2, 3x3 micron) e piccoli cerchi (3, 4, e 5, 500 nm di diametro) in (B) durante 5 min di immagini PALM (frame / 10 sec). Si notino le fluttuazioni di intensità rapidi di PI locale (4,5) P 2 sonde (cerchio 3, 4 e 5) rispetto a piccolissime variazioni della vasta area (riquadro 2). Immagini (E) ingrandita palmo della regione box2 a (B), a volte indicato. Le frecce indicano (4,5) P 2 di membrana arricchiti PI sotto pcondizioni hysiological. Barre di scala: C: 3 micron; E: 500 nm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

PI (4,5) P2 regola diverse funzioni cellulari, ma la sua organizzazione su scala nanometrica nella membrana plasmatica delle cellule è poco conosciuta. Etichettando PI (4,5) P2 con una sonda fluorescente a due colori fusa al dominio Pleckstrin omologia, si descrive un nuovo approccio per studiare il PI (4,5) P2 distribuzione spaziale nella membrana plasmatica su scala nanometrica .

Singolo-molecola di Super-Resolution Imaging di fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato nella membrana plasmatica con il romanzo fluorescenti Sonde

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

single-molecule-super-resolution-imaging-phosphatidylinositol-45

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.4K Views.  University of Wisconsin-Madison.  PI (4,5) P2 regola diverse funzioni cellulari, ma la sua organizzazione su scala nanometrica nella membrana plasmatica delle cellule è poco conosciuta. Etichettando PI (4,5) P2 con una sonda fluorescente a due colori fusa al dominio Pleckstrin omologia, si descrive un nuovo approccio per studiare il PI (4,5) P2 distribuzione spaziale nella membrana plasmatica su scala nanometrica . 

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High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

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Biochimica

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

Manipolazione di singola molecola di G-quadruplex di pinzette magnetiche

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

Trasporto dell'elettrone di miotubi C2C12 Trans-Plasma membrana di misura

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

Quantificazione di tutto il proteoma di etichettatura omogeneità a livello di singola molecola

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary mechanism of amyloid aggregate-induced toxicity in neurodegenerative diseases. However, most reports describing the mechanisms of membrane disruption are based on phospholipid model systems, and studies directly targeting events occurring at the level of biological membranes are rare. Described here is a model for studying the mechanisms of amyloid toxicity at the membrane level. For mitochondrial isolation, density gradient medium is used to obtain preparations with minimal myelin contamination. After mitochondrial membrane integrity confirmation, the interaction of amyloid fibrils arising from &#945;-synuclein, bovine insulin, and hen egg white lysozyme (HEWL) with rat brain mitochondria, as an in vitro biological model, is investigated. The results demonstrate that treatment of brain mitochondria with fibrillar assemblies can cause different degrees of membrane permeabilization and ROS content enhancement. This indicates structure-dependent interactions between amyloid fibrils and mitochondrial membrane. It is suggested that biophysical properties of amyloid fibrils and their specific binding to mitochondrial membranes may provide explanations for some of these observations.

Provided here is a protocol for investigating the interactions between native form, prefibrillar, and mature amyloid fibrils of different peptides and proteins with mitochondria isolated from different tissues and various areas of the brain.

Interazioni con e Membrana Permeabilizzazione di mitocondri cerebrali di Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and others. Many of these functions require motors to operate in ensembles. Despite a wealth of knowledge about the mechanisms of individual cytoskeletal motors, comparatively less is known about the mechanisms and emergent behaviors of motor ensembles, examples of which include changes to ensemble processivity and velocity with changing motor number, location, and configuration. Structural DNA nanotechnology, and the specific technique of DNA origami, enables the molecular construction of well-defined architectures of motor ensembles. The shape of cargo structures as well as the type, number and placement of motors on the structure can all be controlled. Here, we provide detailed protocols for producing these ensembles and observing them using total internal reflection fluorescence microscopy. Although these techniques have been specifically applied for cytoskeletal motors, the methods are generalizable to other proteins that assemble in complexes to accomplish their tasks. Overall, the DNA origami method for creating well-defined ensembles of motor proteins provides a powerful tool for dissecting the mechanisms that lead to emergent motile behavior.

The goal of this protocol is to form ensembles of molecular motors on DNA origami nanostructures and observe the ensemble motility using total internal reflection fluorescence microscopy.

Produzione di Dynein e Kinesin Motor Ensemble su nanostrutture DNA Origami per l'osservazione a singola molecola

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve intracellular structures and the dynamics of biomolecules with ~20 nm precision. A prerequisite for SMLM are fluorophores that transition from a dark to a fluorescent state in order to avoid spatio-temporal overlap of their point spread functions in each of the thousands of data acquisition frames. BODIPYs are well-established dyes with numerous conjugates used in conventional microscopy. The transient formation of red-shifted BODIPY ground-state dimers (DII) results in bright single molecule emission enabling single molecule localization microscopy (SMLM). Here we present a simple but versatile protocol for SMLM with conventional BODIPY conjugates in living yeast and mammalian cells. This procedure can be used to acquire super-resolution images and to track single BODIPY-DII states to extract spatio-temporal information of BODIPY conjugates. We apply this procedure to resolve lipid droplets (LDs), fatty acids, and lysosomes in living yeast and mammalian cells at the nanoscopic length scale. Furthermore, we demonstrate the multi-color imaging capability with BODIPY dyes when used in conjunction with other fluorescent&#160;probes. Our representative results show the differential spatial distribution and mobility of BODIPY-fatty acids and neutral lipids in yeast under fed and fasted conditions. This optimized protocol for SMLM can be used with hundreds of commercially available BODIPY conjugates and is a useful resource to study biological processes at the nanoscale far beyond the applications of this work.&#160;

Conventional BODIPY conjugates can be used for live-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) through exploitation of their transiently forming, red-shifted ground state dimers. We present an optimized SMLM protocol to track and resolve subcellular neutral lipids and fatty acids in living mammalian and yeast cells at the nanoscopic length scale.

Convenzionale BODIPY Coniugato per la microscopia a super-risoluzione a celle vive e il tracciamento a singola molecola

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

Un saggio di imaging a singola molecola in vitro per l'analisi della cinetica di traduzione dipendente dal cappuccio

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

Imaging a singola molecola dell'assemblaggio di condensati EWS-FLI1 sul DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...