Ringraziamo John Kelly e Martin Taylor (London School of Hygiene &amp; Tropical Medicine) per la fornitura di T. b. brucei GVR35-VSL-2 e il Dr. Andrea Zelmer (LSHTM) per un consiglio su imaging in vivo. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Bill e Melinda Gates Foundation globale Health Program (codice di autorizzazione OPPGH5337).

Etica Tutto il lavoro è stato realizzato sotto l&#39;approvazione del Regno Unito per la casa Ufficio Animali (procedure scientifiche) Act 1986 e la London School of Hygiene &amp; Tropical Medicine Animal Welfare and Ethics Review Board. ARRIVARE linee guida sono seguite in questo rapporto. 1. In Vivo Passaggio di Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei <ol><li> Rimuovere uno stock crioconservati (stabilate definito) di T. b. brucei ceppo GVR35-VSL-2 (disponibile dal professor John Kelly presso la London School of Hygiene &amp; Tropical Medicine attraverso MTA) 9 da azoto liquido e permettono di equilibrare a temperatura ambiente. Diluire stabilate a 2 x 10 4 trypanosomes / ml in sterile tampone fosfato glucosio (PBS-G) pH 8,0 (1 L PBS + 15 g di glucosio) 10. Nota: T. b. brucei GVR35-VSL-2 non è contagioso per gli esseri umani e richiede SAPO licenza strutture per effettuare esperimenti. </li><li> inject 20-25 g femminile del mouse CD1 con 0,2 ml trypanosomes diluiti per via intraperitoneale (ip) con un ago da 25 G. Questo è il &quot;mouse donatore&quot;. Posizionare il mouse infetto in uno specifico patogeno libero (SPF) -cage e mangimi ad libitum. Nota: i topi CD1 sono un ceppo outbred e T. b. infezioni brucei GVR35 sono ben caratterizzati in questo ceppo. Tuttavia, questo protocollo è applicabile anche a ceppi inbred o geneticamente modificati, ma è importante notare che il colore della pelliccia possono influire sulla sensibilità dell&#39;imaging 6,9. </li><li> Monitorare parassitemia periferica dal prelievo di sangue. Posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione di plastica e prendere 5 ml di sangue dalla coda per via venosa con 21 G ago o venesection e mescolare 1/10 con cloruro di ammonio sterile 0,85% per la lisi dei globuli rossi e consentire una più facile conteggio. </li><li> Contare il sangue diluito in un Neubauer emocitometro. <ol><li> Caricare il sangue diluito in entrambe le camere. Conta l&#39;intero gr centraleid di una camera per dare n trypanosomes. Concentrazione di trypanosomes nel sangue = n x 10 4 trypanosomes / ml, regolare per qualsiasi fattore di diluizione e calcolare la media delle due camere. Nota: Dopo circa 5-7 giorni dopo l&#39;infezione, parassitemia periferica dovrebbe aumentare in misura sufficiente a svolgere una infezione ad una concentrazione di 2 x 10 4 tripanosomi / ml. </li></ol></li><li> Quando i livelli di trypanosome sono sufficienti per il numero di topi richiesti alta, passare al punto 1.6. Un livello parassitemia di 6 x 10 4 trypanosomes / ml in un topo donatore è sufficiente per infezione di 10 topi. Nota: Per le dimensioni statisticamente significative del gruppo, n = 6 per ogni gruppo di trattamento di topi sono necessari 8. Per gli altri modelli di infezione, calcoli di potenza dovrebbero essere applicati per determinare le dimensioni dei gruppi appropriati. </li><li> Topi posto in una scatola di calore (a 28-30 ° C per circa 5-10 minuti) per consentire le vene coda di dilatarsi.Per indurre anestesia terminale, somministrare 20 mg / kg ev pentobarbital con un ago 25 G. Conferma del mouse è anestetizzato premendo delicatamente i cuscinetti plantari per garantire che non vi è alcun riflesso di ritiro. </li><li> Eparinizzare un ago G 21 aliquotandolo 5 ml eparina a 5.000 USP unità / ml in un tubo Bijou e succhiare due volte dentro e fuori l&#39;ago di una siringa da 1 ml. </li><li> Prendere la eparinizzato 21 G ago e siringa da 1 ml, ed eseguire puntura cardiaca sul mouse passaggio anestetizzato inserendo l&#39;ago centralmente sotto la gabbia toracica (una goccia di sangue piscina nella base dell&#39;ago) e tirare delicatamente lo stantuffo in modo da non comprimere la camera del cuore. Raccogliere un minimo di 0,7 ml di sangue. </li><li> Diluire sangue infetto per produrre un inoculo di 2 x 10 4 trypanosomes / ml in PBS-G pH 8,0 come al punto 1.1. Nota: A questo punto, il sangue rimanente può essere crioconservati per produrre stabilate miscelando con 8% glicerolo, 20% inattivato al calore ca fetalesiero lf (hi-FCS) e il 72% di sangue infetto. Lentamente congelare a -80 ° C usando un lento congelamento contenitore congelamento per ottenere una velocità di raffreddamento di -1 ° C / min, prima del trasferimento a azoto liquido. </li></ol> 2. L&#39;infezione di topi sperimentale <ol><li> Posizionare CD1 topi di sesso femminile (~ 21-25 g) in una scatola di riscaldamento a delicatamente calda per dilatare le vene. Posizionare i topi riscaldati in un sistema di ritenuta di plastica e iniettare 0,2 ml inoculo diluito per via endovenosa con un ago G 25 nella vena della coda, pari a 4.000 trypanosomes per topo. Mettere pressione al sito di iniezione in seguito per fermare l&#39;emorragia. Nota: infezione intraperitoneale è un percorso valida di infezione ed è stato utilizzato in studi precedenti 10, ma abbiamo trovato questo meno riproducibile rispetto alla via endovenosa. </li><li> Randomize topi infetti e la gabbia in gruppi di 3 in gabbie SPF-ventilati. Come controllo, iniettare CD1 topi femmina con wild type parassita non bioluminescente, T. b. brucei GVR35 (n =3). </li><li> Monitorare l&#39;infezione attraverso il sangue Film Microscopia <ol><li> Spot 5 ml di sangue da prelievo venoso o salasso su un vetrino ed eseguire uno striscio di sangue (utilizzando un secondo vetrino spingere delicatamente la goccia di sangue in tutto il vetrino per produrre un film sottile). Lasciare le diapositive asciugare all&#39;aria. </li><li> Fissare lo striscio di sangue con il 100% di metanolo e macchia con Giemsa per 10 minuti prima di risciacquare con dH 2 O e lasciare asciugare all&#39;aria. Sotto obiettivo 100X contare il numero di tripanosomi in 10 campi di vista (FOV). Nota: le riprese sangue viene eseguita insieme a tutto l&#39;animale di imaging non invasivo più presto dopo l&#39;infezione di un giorno. Durante l&#39;elaborazione di un numero di animali, questo metodo di quantificazione tripanosoma è preferito rispetto conteggio emocitometro come i campioni possono essere conservati a temperatura ambiente e successivamente contati. </li></ol></li></ol> 3. bioluminescenza Imaging per tenere traccia delle infezioni Nota: Per monitorare l&#39;infezione, tutto animAl imaging non invasivo può essere utilizzato. <ol><li> Preparare una soluzione stock di D-luciferina, il substrato luciferasi di lucciola, in Dulbecco tampone fosfato (DPBS) a 30 mg / ml. Filtro sterilizzare e congelare in aliquote a -20 ° C. Nota: D-Luciferin è sensibile alla luce, quindi proteggerlo dalla luce avvolgendo aliquote in un foglio. Non più volte di gelo-disgelo luciferina in quanto può influenzare l&#39;attività 11. </li><li> Scaldare una aliquota di D-luciferina a temperatura ambiente. Rimuovere ogni mouse dalla gabbia (compresi topi di controllo infettate con nonbioluminescent ceppo wild type parassita) e iniettare 150 mg / kg di D-luciferina riscaldato (diluito in DPBS) per via intraperitoneale con un ago 25 G. Posizionare il mouse in una camera isofluorane per circa 5 minuti per indurre l&#39;anestesia con il 2% isofluorane / O 2 miscela a 2,5 L / min. Nota: I topi diventano immobile quando sono sotto anestesia. Per l&#39;imager qui utilizzato, 3 topi possono essere elaborati in un momento. Se i topi sono anesthetzato per più di 30 minuti, unguento oftalmico lacrima artificiale può essere applicato per prevenire gli occhi dei topi si secchi. </li><li> Per l&#39;imager qui descritto, aprire il software e inizializzare la macchina utilizzando il software secondo le istruzioni del produttore. Acquisire le immagini una volta fotocamera e la piastra riscaldata hanno raggiunto la temperatura. Nota: questo strumento non è di solito spento, consentendo alla macchina di eseguire calibrazioni di fondo durante la notte. Nel caso in cui deve essere riavviata o deve eseguire un controllo di calibrazione prima. </li><li> Mettere i topi anestetizzati nella termocamera (cfr 3,5). Utilizzare grandi separatori neri tra i topi per ridurre al minimo sanguinare attraverso di qualsiasi segnale bioluminescente luminoso. topi immagine utilizzando una serie di tempi di esposizione; 1, 3, 10, 30, 60 e 180 secondi, con medie discretizzazione, 1 f / stop e un filtro aperto, e il campo visivo E (12.5 x 12.5 cm 2). Nota: I topi di controllo infettati con il tipo selvatico parassiti GVR35 nonbioluminescent forniscono un backgrvalore di bioluminescenza ound. Da un esperimento di cinetica di luciferina (Figura 6), con questo modello, abbiamo trovato che i picchi di segnale bioluminescenza a 10 minuti dopo la somministrazione e l&#39;imaging dura circa 5 minuti per 3 topi. Prendete questo lasso di tempo in considerazione quando anestetizzare e di imaging i topi. </li><li> Per garantire l&#39;imaging approfondito dei topi, ruotare per ottenere una ventrale, dorsale e vista laterale. Mantenere la coerenza dell&#39;ordine di orientamento per l&#39;imaging tra animali sequenziali. </li><li> Dopo l&#39;imaging, permettono topi per recuperare da anestesia sotto osservazione prima di tornare a SPF-gabbia. </li><li> Continuare l&#39;imaging topi ogni 7 giorni fino al giorno 21 dopo l&#39;infezione. Ci dovrebbe essere un costante aumento del segnale bioluminescenza sull&#39;intera animale. </li><li> Al D21, immagini e striscio di sangue dei topi come descritto in precedenza, e la dose topi con 40 mg / kg per via intraperitoneale Diminazene aceturato. Questo farmaco cancellerà il parasitemia periferico, ma non attraverserà la barriera emato-Brain barriera, e permette quindi una migliore visualizzazione dell&#39;infezione CNS. Nota: Diminazene aceturato è un farmaco comunemente utilizzate per il trattamento di tripanosomiasi animale fase iniziale. </li><li> Continuare l&#39;imaging e il monitoraggio a D28 e D35. </li></ol> 4. Conferma CNS infezione <ol><li> Al D35, topi immagine sopra descritto (passi 3,1-3,4). </li><li> Dopo l&#39;imaging, permettono di recuperare i topi da topi anestesia e Exsanguinate come dettagliato nella fase 1,6-1,8, raccolta di sangue per ulteriori analisi. </li><li> Dopo puntura cardiaca, perfusione topi con 20 ml di PBS (opzionale: aggiungere 3 mg / ml di luciferina alla soluzione di perfusione) attraverso il cuore per cancellare il sangue dagli organi e di reintrodurre etichetta luciferina che potrebbero aver eliminato dalla regione del cervello durante l&#39;intervallo di tempo dal punto 4.1. </li><li> Rimuovere delicatamente il cervello, utilizzando forbici curve, tagliando dalla base attorno alla circonferenza del cranio e sollevamento fuori la parte superiore del cranio, per permettere al cervelloper essere delicatamente tirato fuori con le pinze curve. </li><li> Posizionare il cervello asportato su una sezione di plastica nera e pipettare 50 ml di 15 mg / ml luciferina sopra l&#39;organo prima di imaging, per garantire un&#39;adeguata luciferina è stato aggiunto al cervello asportato. Immagine utilizzando le impostazioni come sopra. Questo dimostrerà localizzazione dell&#39;infezione agli emisferi cerebrali. Nota: quantificazione valle parassitemia sul cervello asportato può essere effettuata da qPCR come precedentemente descritto 8. Altre applicazioni a valle alternative potrebbero includere l&#39;istologia o immunoistochimica per identificare i parassiti nel tessuto cerebrale dopo la fissazione. </li></ol> 5. La quantificazione della bioluminescenza Imaging Nota: bioluminescenza sia quantificabile secondo la regione di interesse (ROI) con il software di imaging e corretta per lo sfondo bioluminescenza. <ol><li> Utilizzando lo strumento ROI, creare un ROI di forma rettangolare per intero animale quantificazione unnd posizionarlo dell&#39;immagine mouse sopra per coprire punta del naso alla base della coda del topo. Utilizzare la stessa casella di dimensione per ogni animale e ogni punto del tempo. Osservando il ROI per il cervello, utilizzare una ROI circolare nello stesso modo, posizionandolo sopra la regione della testa del mouse nell&#39;immagine. </li><li> Se necessario, regolare le immagini a comparire sullo stesso spettro per una rappresentazione visiva di infezione. Nota: il software utilizzato qui genera una mappa di colori per ogni immagine regolata automaticamente per i conteggi minimo e massimo di fotoni. Per consentire un confronto visivo tra una serie di immagini, la scala di colore deve essere impostato gli stessi valori per tutte le immagini. <ol><li> Usando l&#39;immagine con il più alto bioluminescenza e la scheda &#39;Regolazione immagine&#39; sulla tavolozza degli strumenti, selezionare una scala logaritmica e un adeguato minima scala di colori e massima (da determinare empiricamente). Applicare questa scala a tutte le immagini di tutto l&#39;esperimento. </li></ol></li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+chronic+Trypanosoma+cruzi+infections+reveals+tissue-specific+parasite+dynamics+and+heart+disease+in+the+absence+of+locally+persistent+infection.">Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection.</a> Cell. Microbiol. 16 (9), 1285-1300 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Lo sviluppo di un T. bioluminescente b. brucei GVR35 ceppo permette la visualizzazione di una infezione tripanosoma dalla presto per la fase tardiva. Precedenti modelli di infezione erano in grado di rilevare la fase avanzata, quando i parassiti sono nel cervello, in tempo reale dalla microscopia striscio di sangue, e richiedevano l&#39;abbattimento e la rimozione dei cervelli dal topi infettati per determinare parassita fardello 12. La bioluminescenza riduce la variabilità inter-mouse come un mouse può essere seguita per tutta la totalità della infezione e una valutazione qualitativa rapida di infezione si può osservare in qualsiasi momento. Il metodo altamente sensibile delle immagini bioluminescenza permette infezione di basso livello per essere identificati prima di microscopia sangue pellicola, con solo 100 trypanosomes rilevabili attraverso l&#39;imaging rispetto ai 5 x 10 3 / ml trypanosomes rilevabili mediante microscopia 9. Inoltre, seguendo gli stessi animali tutto l&#39;esperimento eliminares la necessità di gruppi di animali separati per ogni punto di tempo, riducendo notevolmente l&#39;utilizzo degli animali. Il protocollo di imaging qui descritto può essere adattato per soddisfare l&#39;esigenza scientifica come la natura non invasiva significa che l&#39;imaging ulteriori e più frequente può essere effettuato (con approvazione etica appropriata animali), ma per la valutazione di infezione cerebrale D21 è la prima volta punto. A questo punto, i farmaci in fase iniziale non sono più efficaci a chiarire i parassiti in fase avanzata. È inoltre indispensabile che i topi vengono esposte alle stesse condizioni in ogni punto. Ad esempio, gli stessi tempi di esposizione e stessa visualizzazione (ventrale o dorsale) dovrebbero essere utilizzati per assicurare una misurazione accurata del corso dell&#39;infezione. Se durante l&#39;imaging assenza di segnale (quando è noto che il modello dovrebbe avere un&#39;infezione), ci sono una serie di passi che possono essere seguiti per determinare l&#39;origine del problema. In primo luogo, il tempo di esposizione può essere aumentatoad un massimo di 5 minuti, che dovrebbe essere in grado di rilevare il segnale molto basso bioluminescenza. Se il segnale non è ancora rilevato e pellicole di sangue sono positivi per parassiti, il passo successivo sarebbe quello di confermare se il parassita è ancora bioluminescenti. Ciò può essere eseguito utilizzando una vitro luciferasi test commerciale dell&#39;attività e bioluminescenza sarebbero rilevati usando un luminometro. Se a questo punto il parassita non bioluminescenti è, la stabilità del costrutto nel parassita avrebbe bisogno di essere affrontate. Il colore dei topi fa la differenza per la sensibilità dell&#39;imaging come bioluminescenza emessa viene attenuato di pelliccia scura e 6,9 pelle. Scelta del ceppo di topi, come ad esempio i topi bianchi o topi nudi, può quindi migliorare i risultati. Se il colore del mouse è vincolato, ad esempio mediante l&#39;uso di una linea transgenica, poi rasatura o depilazione topi in una regione di interesse può migliorare notevolmente la sensibilità 6. deNonostante la maggiore sensibilità e segnalare che il modello bioluminescente produce, bioluminescenza non correla direttamente alla parassitemia periferica osservata in pellicole di sangue (giorni 7-21 mostrato in Figura 4). La letteratura ha documentato che l&#39;infezione fase iniziale della tripanosomiasi infetta il sistema emolinfatico 1, e non è limitata unicamente al sistema sanguigno e questo, insieme con l&#39;infezione di organi periferici, può spiegare perché quando parassitemia periferico è appena rilevabile nelle pellicole di sangue, bioluminescenza è visibile come è particolarmente evidente dai dati del giorno 7 in figura 3 e 4. Questo, tuttavia, significa che l&#39;imaging bioluminescenza può essere usato solo come misura qualitativa di infezione, e ulteriori analisi è necessaria per determinare onere parassita assoluta. Imaging bioluminescenza ha la capacità di essere usato con altri agenti patogeni infettivi che sono difficili da moNitor, con modelli di roditori di malattia di Chagas, la malaria e la toxoplasmosi già stabilito 13-16. L&#39;elevato rapporto segnale-rumore di bioluminescenza accoppiato con la sua capacità di monitorare infezioni in tempo reale può fornire una più sensibile, la valutazione farmaco non invasiva, così come ottenere una migliore comprensione della cinetica di infezione del sistema nervoso centrale, rendendolo un valido strumento ricerca sulle malattie infettive.

Human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, is caused by the vector-borne protozoan parasites of the Trypanosoma brucei spp1. Estimated numbers of current cases is fewer than 7 thousand every year with almost 70 million people exposed to the risk of the parasite infection within the African continent. The disease, which is most often lethal if left untreated, comprises an early hemolymphatic stage where parasites are present in the blood, progressing to the late stage when parasites invade the central nervous system (CNS) and are no longer susceptible to treatment by early stage trypanosomal drugs2. The current drug therapies for late-stage HAT have both complex, prolonged, treatment regimens and severe adverse effects as well as reported resistance, therefore research into new drug therapies is imperative3,4. 
The study of late-stage human African trypanosomiasis (HAT) within traditional mouse models is lengthy and complex, with the removal of brain tissue being required to monitor parasitic burden5. The animal infective strain T. b. brucei is used as the study model of trypanosomiasis with the late stage appearing 21 days post infection (dpi). To monitor the wild type nonbioluminescent parasite infection in the mouse model, peripheral blood films or quantitative PCR are the only methods to determine parasite burden. For parasite burden in the brain, the mouse needs to be culled, brain excised and qPCR carried out on tissues, making it impossible to track parasites through multiple time points in the late stage infection. This results in the inability to follow real-time infections within the central nervous system (CNS). 
In vivo bioluminescence imaging (BLI) can provide highly sensitive, non-invasive detection of parasite dissemination and disease progression in a mouse model that can be followed in a single animal for the entirety of the experiment6. BLI is based on the emission of light in the visible spectrum produced by a luciferase-catalyzed reaction. The emitted photons are then detected by a charge coupled device (CCD) camera7. For this purpose, the pathogen is genetically modified to express a luciferase protein and the substrate, luciferin, is introduced at time points of interest by injection. The main advantage of this method is the ability to carry out longitudinal studies, in which the same animal can be imaged several times with minimal adverse effects. The acquired bioluminescence signal can be quantified, thus indicating the pathogen burden.
The optimization and validation of a red-shifted bioluminescent T. b. brucei has enabled the investigation of the late stage infection through non-invasive procedures, detecting parasites earlier than blood film microscopy and greatly reducing the time, cost and numbers of animals needed to study CNS infection and drug screening in late-stage trypanosomiasis8,9. In this protocol we demonstrate infection of mice with bioluminescent trypanosomes and how to then visualize the parasites in vivo for quantification of disease progression and CNS penetration.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:233px;">PBS</td>
			<td style="width:189px;">Sigma, UK</td>
			<td style="width:155px;">P4417</td>
			<td style="width:283px;">tablets pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:233px;">Glucose</td>
			<td style="width:189px;">Sigma, UK</td>
			<td style="width:155px;">G8270</td>
			<td style="width:283px;">99.5% (molecular) grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:233px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Sigma, UK</td>
			<td style="width:155px;">A9434</td>
			<td style="width:283px;">99.5% (molecular) grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:233px;">Heparin (lithium salt)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma, UK</td>
			<td style="width:155px;">H0878</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:233px;">Hi-FCS</td>
			<td style="width:189px;">Gibco, Life Technologies, UK</td>
			<td style="width:155px;">10500-064</td>
			<td style="width:283px;">500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:233px;">DPBS</td>
			<td style="width:189px;">Sigma, UK</td>
			<td style="width:155px;">D4031</td>
			<td style="width:283px;">Sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:233px;">Mr. Frosty</td>
			<td style="width:189px;">Nalgene, UK</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:233px;">Giemsa</td>
			<td style="width:189px;">Sigma, UK</td>
			<td style="width:155px;">G5637</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="44" rowspan="2" style="height:44px;width:233px;">D-Luciferin</td>
			<td style="width:189px;">Perkin Elmer, UK</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:189px;">Sigma, UK</td>
			<td style="width:155px;">115144-35-9</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:233px;">Diminazene aceturate</td>
			<td style="width:189px;">Sigma, UK</td>
			<td style="width:155px;">D7770</td>
			<td style="width:283px;">Analytical grade</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:233px;">IVIS Lumina II</td>
			<td style="width:189px;">Perkin Elmer, UK</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:283px;">other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:233px;">Living Image v. 4.2</td>
			<td style="width:189px;">Perkin Elmer, UK</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:283px;">proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:233px;">1 ml syringe</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific, UK</td>
			<td>10142104</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:233px;">20 ml syringe</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific, UK</td>
			<td>10743785</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:233px;">25G Needles</td>
			<td style="width:189px;">Greiner Bio-one</td>
			<td>N2516</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:233px;">21G Needles</td>
			<td style="width:189px;">Greiner Bio-one</td>
			<td>N2138</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:233px;">Twin-frosted microscope slide</td>
			<td style="width:189px;">VWR, UK</td>
			<td>631-0117</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:233px;">1.5 ml microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:189px;">StarLab, UK</td>
			<td>I1415-1000</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:233px;">7 ml Bijou tube</td>
			<td style="width:189px;">StarLab, UK</td>
			<td>E1412-0710</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:233px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:189px;">Sigma, UK</td>
			<td>Z756903</td>
			<td style="width:283px;">our restrainer was made in-house, this is a similar model</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescence imaging to detect late stage infection of african trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

Questo protocollo dimostra come seguire la progressione della malattia dopo l&#39;infezione di topi con T. b. brucei, un modello per la tripanosomiasi africana umana. La figura 1 mostra la sequenza temporale del protocollo sperimentale, dimostrando il calendario per la fasi di trattamento e di imaging. La Figura 2 mostra un tipico campo di vista in uno striscio di sangue Giemsa-macchiate fisso utilizzato per quantificare parassitemia periferico, con trypanosomes e globuli rossi presenti. Sviluppo dell&#39;infezione negli animali può essere seguita misurando la bioluminescenza come nella figura 3, che mostra gli animali infetti nel corso di un esperimento con gli stessi animali impressi in ogni punto. Attraverso il corso dell&#39;infezione un aumento bioluminescenza può essere osservata in tutti gli animali nei primi 21 giorni come il segnale diventa più disseminata ed intenso, con alte regioni di BLI (rappresentato come rossodalla mappa scala di calore) nell&#39;area milza. A topi D21 sono trattati con Diminazene aceturato come descritto nella figura 1, dopo l&#39;esposizione, e una goccia in bioluminescenza possono osservare D28 come l&#39;infezione periferica è controllata, con bassi livelli di segnale essendo presente nella regione della testa dei topi. Al D35 il segnale rimane ancora nella regione testa è diventata più intensa che indica una possibile infezione cerebrale. Il cervello è escisse per confermare il segnale è presente all&#39;interno del tessuto cerebrale e può quindi essere quantificata qPCR. Tradizionalmente, strisci di sangue vengono utilizzati per quantificare la progressione dell&#39;infezione e gli effetti del trattamento. Tuttavia, questi misurano solo parassitemia periferico, e non possono essere usate per valutare i livelli parassita nel cervello. Figura 4 combina quantificazione sia del parassitemia periferico e bioluminescenza dimostrare cinetiche malattia. A D7 un segnale alto BLI è presente su 10 8 </sup&gt; fotoni / sec, ma la parassitemia è molto bassa nei film di sangue. Sia la parassitemia e segnalare quindi aumentare e al D21 le gocce parassitemia ma bioluminescenza rimane costante, che è in parte dovuto alle trypanosomes in movimento nel sistema linfatico e dei tessuti e anche a causa loro metodo host-evasione di passare le loro glicoproteine ​​di superficie (VSG). Dopo D21 la parassitemia diventa non rilevabile nelle pellicole di sangue dovuto al trattamento con Diminazene aceturato ma, nonostante il tuffo iniziale bioluminescenza, il segnale è ancora sopra sfondo e continua a D35, una misura della bioluminescenza nella regione testa visibile in figura 3 . Ciò dimostra la maggiore sensibilità del metodo sopra bioluminescenza tradizionale conteggio pellicola di sangue. Per verificare che la bioluminescenza nella regione della testa è veramente localizzazione al tessuto cerebrale, alla fine dell&#39;esperimento i cervelli sono rimossi e bioluminesscenza misurata ex vivo (Figura 5). Una differenza di pressione tra l&#39;infezione cervello è spesso visto e segnale non appare localizzare a specifiche regioni anatomiche come distribuzione di intensità del segnale BLI può variare tra animali infetti. Ad esempio, forte segnale BLI è presente nel bulbo olfattivo nel topo 2 e 3 e nel cervelletto nel topo 3, mentre il cervello dal mouse 1 mostra la distribuzione generale del segnale BLI tutto il cervello. Poiché i cervelli possono essere esposte subito dopo l&#39;abbattimento dei topi, ulteriori analisi può essere effettuata sul tessuto cerebrale come il tessuto non sia danneggiato in vivo nel processo di imaging es. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54032/54032fig1.jpg" /> Figura 1:. Timeline di Experiment tra cui l&#39;imaging, il campionamento e il trattamento a causa della natura non invasiva delle immagini bioluminescenza, il monitoraggio di infezione può avvenire mori spesso dettagliato nel diagramma. Il campionamento e di imaging ogni 7 giorni consentono l&#39;identificazione dell&#39;infezione progredire. Il trattamento a D21 con aceturato Diminazene rimuove parassitemia periferici per consentire una migliore visualizzazione della testa e del cervello infezione. Aceturato Diminazene è un farmaco in fase iniziale e non è in grado di superare la barriera emato-encefalica in quantità adeguate per eliminare l&#39;infezione fase tardiva. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54032/54032fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54032/54032fig2.jpg" /> Figura 2:. Trypanosomes Giemsa macchiato tripanosomi su un film di sangue fisso, Giemsa macchiati (viola con i nuclei rosa, chiuso freccia) sono facilmente rilevabili contro i globuli rossi (di colore blu, freccia aperta) e può essere rapidamente contato per ottenere il numero di trypanosomes / 10campi di vista sotto un obiettivo 100X. La barra della scala indica 10 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54032/54032fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54032/54032fig3.jpg" /> Figura 3: bioluminescenza Imaging di topi infettati Tre animali rappresentativi di un gruppo di 6 topi infettati con VSL-2 (M = mouse) ed una wild-type di controllo infetto (infettati dal tipo selvaggio linea nonbioluminescent parassita).. Luciferina è stato anche somministrato al mouse controllo prima di imaging, che prevede la misurazione del fondo. Una scala della mappa di calore è mostrato con l&#39;indicazione rossa alti livelli di bioluminescenza, pari a un numero elevato di parassiti, e blu che indica bassi livelli di bioluminescenza (D = giorno). Il mouse di controllo non ha alcuna bioluminescenza come previsto, senza parassiti luciferasi che esprimono. immagine F<html> rom Burrell-Saward et al. 8 per concessione di Oxford University Press. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54032/54032fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54032/54032fig4.jpg" /> Figura 4:. Confronto di bioluminescenza e Sangue Film parassitemia bioluminescenza totale di ogni intero animale è stato quantificato come descritto nella sezione 5 e parassitemia periferico quantificato contando parassiti in strisci di sangue. Le barre di errore indicano la deviazione standard dalla media. Immagine da Burrell-Saward et al. 8 per concessione di Oxford University Press. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54032/54032fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 5 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54032 / 54032fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5:. Ex Vivo Imaging di asportato il cervello cervelli perfusi dei topi imaged in Figura 3 sono stati rimossi e ripreso come descritto in 4.5. Bioluminescenza è misurato su una scala della mappa di calore come per Figura 3. Il cervello di controllo da un mouse infettati con wild type parassiti nonbioluminescent è stato anche trattato con luciferina e non bioluminescenza può essere osservato. La barra di scala denota 1 cm. Questo dato è stato modificato da Burrell-Saward et al. 8 per concessione di Oxford University Press. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54032/54032fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54032/54032fig6.jpg" /> Figura 6: Cinetica di Luciferin bioluminescenza nei topi VSL-2-infetti.Tre topi CD1 VSL-2-infette sono stati iniettati con 150 mg / kg ip luciferina e poste immediatamente all&#39;interno del imager. I topi sono stati ripresi più di 60 minuti e la loro bioluminescenza è stato calcolato per determinare la finestra di imaging ottimale dopo la somministrazione luciferina. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54032/54032fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Bioluminescenza Imaging per rilevare fase avanzata di infezione di africani Tripanosomiasi

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

bioluminescence-imaging-to-detect-late-stage-infection-african

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.7K Views.  London School of Hygiene & Tropical Diseases. This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Video: Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Comprehensive &amp; Cost Effective Laboratory Monitoring of HIV/AIDS: an African Role Model

We present the video about assisting anti-retroviral therapy (ART) by an apt laboratory service - representing a South-African role model for economical large scale diagnostic testing. In the low-income countries inexpensive ART has transformed the prospects for the survival of HIV seropositive patients but there are doubts whether there is a need for the laboratory monitoring of ART and at what costs - in situations when the overall quality of pathology services can still be very low. The appropriate answer is to establish economically sound services with better coordination and stricter internal quality assessment than seen in western countries. This video, photographed at location in the National Health Laboratory Services (NHLS-SA) at the Witwatersrand University, Johannesburg, South Africa, provides such a coordinated scheme expanding the original 2-color CD4-CD45 PanLeucoGating strategy (PLG). Thus the six modules of the video presentation reveal the simplicity of a 4-color flow cytometric assay to combine haematological, immunological and virology-related tests in a single tube. These video modules are: (i) the set-up of instruments; (ii) sample preparations; (iii) testing absolute counts and monitoring quality for each sample by bead-count-rate; (iv) the heamatological CD45 test for white cell counts and differentials; (v) the CD4 counts, and (vi) the activation of CD8+ T cells measured by CD38 display, a viral load related parameter. The potential cost-savings are remarkable. This arrangement is a prime example for the feasibility of performing &gt; 800-1000 tests per day with a stricter quality control than that applied in western laboratories, and also with a transfer of technology to other laboratories within a NHLS-SA network. Expert advisors, laboratory managers and policy makers who carry the duty of making decisions about introducing modern medical technology are frequently not in a position to see the latest technical details as carried out in the large regional laboratories with huge burdens of workload. Hence this video shows details of these new developments.

Comprehensive & Cost Effective Laboratory Monitoring of HIV/AIDS: an African Role Model

Anti-retroviral therapy to treat HIV/AIDS is monitored in South Africa on a large scale. Flow cytometry is combined for haematology (CD45), immunology (CD4) and viral-load linked CD38 assay. Recorded at NHLS-SA laboratories, Johannesburg, these modern methods are cost-efficient with heightened local internal quality control, serving as role-models for resource-limited diagnostics.

Completa dei costi e monitoraggio di laboratorio efficace di HIV / AIDS: un modello di ruolo africano

We present the video about assisting anti-retroviral therapy (ART) by an apt laboratory service - representing a South-African role model for economical ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH oxidase has critical signaling functions that modulate the inflammatory response 1. Thus, the development of a method to measure in "real-time" the kinetics of NADPH oxidase-derived ROS generation is expected to be a valuable research tool to understand mechanisms relevant to host defense, inflammation, and injury.
Chronic granulomatous disease (CGD) is an inherited disorder of the NADPH oxidase characterized by severe infections and excessive inflammation. Activation of the phagocyte NADPH oxidase requires translocation of its cytosolic subunits (p47phox, p67phox, and p40phox) and Rac to a membrane-bound flavocytochrome (composed of a gp91phox and p22phox heterodimer). Loss of function mutations in any of these NADPH oxidase components result in CGD. Similar to patients with CGD, gp91phox -deficient mice and p47phox-deficient mice have defective phagocyte NADPH oxidase activity and impaired host defense 2, 13. In addition to phagocytes, which contain the NADPH oxidase components described above, a variety of other cell types express different isoforms of NADPH oxidase.
Here, we describe a method to quantify ROS production in living mice and to delineate the contribution of NADPH oxidase to ROS generation in models of inflammation and injury. This method is based on ROS reacting with L-012 (an analogue of luminol) to emit luminescence that is recorded by a charge-coupled device (CCD). In the original description of the L-012 probe, L-012-dependent chemiluminescence was completely abolished by superoxide dismutase, indicating that the main ROS detected in this reaction was superoxide anion 14. Subsequent studies have shown that L-012 can detect other free radicals, including reactive nitrogen species 15, 16. Kielland et al. 16 showed that topical application of phorbol myristate acetate, a potent activator of NADPH oxidase, led to NADPH oxidase-dependent ROS generation that could be detected in mice using the luminescent probe L-012. In this model, they showed that L-012-dependent luminescence was abolished in p47phox-deficient mice.
We compared ROS generation in wildtype mice and NADPH oxidase-deficient p47phox-/- mice 2 in the following three models: 1) intratracheal administration of zymosan, a pro-inflammatory fungal cell wall-derived product that can activate NADPH oxidase; 2) cecal ligation and puncture (CLP), a model of intra-abdominal sepsis with secondary acute lung inflammation and injury; and 3) oral carbon tetrachloride (CCl4), a model of ROS-dependent hepatic injury. These models were specifically selected to evaluate NADPH oxidase-dependent ROS generation in the context of non-infectious inflammation, polymicrobial sepsis, and toxin-induced organ injury, respectively. Comparing bioluminescence in wildtype mice to p47phox-/- mice enables us to delineate the specific contribution of ROS generated by p47phox-containing NADPH oxidase to the bioluminescent signal in these models.
Bioluminescence imaging results that demonstrated increased ROS levels in wildtype mice compared to p47phox-/- mice indicated that NADPH oxidase is the major source of ROS generation in response to inflammatory stimuli. This method provides a minimally invasive approach for "real-time" monitoring of ROS generation during inflammation in vivo.

NADPH oxidase is the major source of reactive oxygen species (ROS) in phagocytes. Because of the ephemeral nature of ROS, it is difficult to measure and monitor ROS levels in living animals. A minimally invasive method for serial quantification of ROS in living mice is described.

Imaging bioluminescenza di attività NADPH ossidasi in diversi modelli animali

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Separazione dei<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Fine Stage-eritrociti infettati da mezzi magnetici

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D imaging multimodale di<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infezioni in topi

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that distinguish acute and chronic inflammation in mouse models. With tissue damage or pathogen invasion, neutrophils are the first line of defense, playing a major role in mediating the acute inflammatory response. As the inflammatory reaction progresses, circulating monocytes gradually migrate into the site of injury and differentiate into mature macrophages, which mediate chronic inflammation and promote tissue repair by removing tissue debris and producing anti-inflammatory cytokines. Intraperitoneal injection of luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) enables detection of acute inflammation largely mediated by tissue-infiltrating neutrophils. Luminol specifically reacts with the superoxide generated within the phagosomes of neutrophils since bioluminescence results from a myeloperoxidase (MPO) mediated reaction. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) also reacts with superoxide in order to generate bioluminescence. However, lucigenin bioluminescence is independent of MPO and it solely relies on phagocyte NADPH oxidase (Phox) in macrophages during chronic inflammation. Together, luminol and lucigenin allow non-invasive visualization and longitudinal assessment of different phagocyte populations across both acute and chronic inflammatory phases. Given the important role of inflammation in a variety of human diseases, we believe this non-invasive imaging method can help investigate the differential roles of neutrophils and macrophages in a variety of pathological conditions.

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

We describe a non-invasive imaging method for distinguishing inflammatory stages. Systemic delivery of luminol reveals areas of acute inflammation dependent upon MPO activity in neutrophils. In contrast, injection of lucigenin allows for visualization of chronic inflammation dependent upon Phox activity in macrophages.

In vivo metodo di imaging per distinguere infiammazione acuta e cronica

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per monitorare Glycosome Dynamics in Tripanosoma africano

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony forming units (CFU-Es). After CFU-Es, cells are morphologically recognizable and generally termed terminal erythroblasts. One of the challenges for the study of terminal erythropoiesis is the lack of experimental approaches to dissect gene functions in a chronological manner. In this protocol, we describe a unique strategy to determine gene functions in the early and late stages of terminal erythropoiesis. In this system, mouse fetal liver TER119 (mature erythroid cell marker) negative erythroblasts were purified and transduced with exogenous expression of cDNAs or small hairpin RNAs (shRNAs) for the genes of interest. The cells were subsequently cultured in medium containing growth factors other than erythropoietin (Epo) to maintain their progenitor stage for 12 hr while allowing the exogenous cDNAs or shRNAs to express. The cells were changed to Epo medium after 12 hr to induce cell differentiation and proliferation while the exogenous genetic materials were already expressed. This protocol facilitates analysis of gene functions in the early stage of terminal erythropoiesis. To study late stage terminal erythropoiesis, cells were immediately cultured in Epo medium after transduction. In this way, the cells were already differentiated to the late stage of terminal erythropoiesis when the transduced genetic materials were expressed. We recommend a general application of this strategy that would help understand detailed gene functions in different stages of terminal erythropoiesis.

We present an in vitro mouse fetal liver erythroblast culture system that dissects the early and late stages of terminal erythropoiesis. This system facilitates functional analysis of specific genes in different developmental stages.

Mouse fetale Fegato Cultura di sistema per sezionare Funzioni gene bersaglio nelle fasi precoci e tardivi del Terminal eritropoiesi

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to the frequent failure of traditional antibiotic treatments. Alternative therapeutics are urgently needed to tackle MDR bacteria.
An innovative non-antibiotic approach, antimicrobial blue light (aBL), has shown promising effectiveness against MDR infections. The mechanism of action of aBL is not yet well understood. It is commonly hypothesized that naturally occurring endogenous photosensitizing chromophores in bacteria (e.g., iron-free porphyrins, flavins, etc.) are excited by aBL, which in turn produces cytotoxic reactive oxygen species (ROS) through a photochemical process.
Unlike another light-based antimicrobial approach, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), aBL therapy does not require the involvement of an exogenous photosensitizer. All it needs to take effect is the irradiation of blue light; therefore, it is simple and inexpensive. The aBL receptors are the endogenous cellular photosensitizers in bacteria, rather than the DNA. Thus, aBL is believed to be much less genotoxic to host cells than ultraviolet-C (UVC) irradiation, which directly causes DNA damage in host cells.
In this paper, we present a protocol to assess the effectiveness of aBL therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in a mouse model of burn injury. By using an engineered bioluminescent strain, we were able to noninvasively monitor the extent of infection in real time in living animals. This technique is also an effective tool for monitoring the spatial distribution of infections in animals.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy per la multi-resistente baumannii Acinetobacter Masterizzare Infezioni Utilizzando bioluminescenza Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sovrapressione e purificazione dell&#39;uomo<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasi in<emEscherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is the best method for diagnosis of first stage HAT and furthermore this parasite purification method permits serological and research investigations.
HAT is caused by Tsetse fly transmitted Trypanosoma brucei gambiense and T. b. rhodesiense. Related trypanosomes are the causative agents of animal trypanosomiasis. Trypanosome detection is essential for HAT diagnosis, treatment and follow-up. The technique described here is the most sensitive parasite detection technique, adapted to field conditions for the diagnosis of T. b. gambiense HAT and can be completed within one hour. Blood is layered onto an anion-exchanger column (DEAE cellulose) previously adjusted to pH 8, and elution buffer is added. Highly negatively charged blood cells are adsorbed onto the column whereas the less negatively charged trypanosomes pass through. Collected trypanosomes are pelleted by centrifugation and observed by microscopy. Moreover, parasites are prepared without cellular damage whilst maintaining their infectivity.
Purified trypanosomes are required for immunological testing; they are used in the trypanolysis assay, the gold standard in HAT serology. Stained parasites are utilized in the card agglutination test (CATT) for field serology. Antigens from purified trypanosomes, such as variant surface glycoprotein, exoantigens, are also used in various immunoassays. The procedure described here is designed for African trypanosomes; consequently, chromatography conditions have to be adapted to each trypanosome strain, and more generally, to the blood of each species of host mammal.
These fascinating pathogens are easily purified and available to use in biochemical, molecular and cell biology studies including co-culture with host cells to investigate host-parasite relationships at the level of membrane receptors, signaling, and gene expression; drug testing in vitro; investigation of gene deletion, mutation, or overexpression on metabolic processes, cytoskeletal biogenesis and parasite survival.

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

This method of trypanosome separation from blood depends on their surface charge being less negative than mammalian blood cells. Infected blood is placed and treated on an anion-exchanger column. This method, the most fitting diagnostic for African trypanosomiasis, provides purified parasites for immunological, biological, biochemical, pharmaceutical and molecular biology investigations.

Purificazione dei tripanosomi extracellulare, tra cui africana, dal sangue mediante scambiatori di anioni (colonne Diethylaminoethyl-cellulosa)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Bioluminescenza Imaging per rilevare fase avanzata di infezione di africani Tripanosomiasi

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Completa dei costi e monitoraggio di laboratorio efficace di HIV / AIDS: un modello di ruolo africano

Imaging bioluminescenza di attività NADPH ossidasi in diversi modelli animali

Separazione dei

4D imaging multimodale di

In vivo metodo di imaging per distinguere infiammazione acuta e cronica

Utilizzo di proteine fluorescenti per monitorare Glycosome Dynamics in Tripanosoma africano

Mouse fetale Fegato Cultura di sistema per sezionare Funzioni gene bersaglio nelle fasi precoci e tardivi del Terminal eritropoiesi

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy per la multi-resistente baumannii Acinetobacter Masterizzare Infezioni Utilizzando bioluminescenza Imaging

Sovrapressione e purificazione dell'uomo

Purificazione dei tripanosomi extracellulare, tra cui africana, dal sangue mediante scambiatori di anioni (colonne Diethylaminoethyl-cellulosa)

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