This work was supported by NIH-NIDCR IRO1DE019355 (MJ Yost, PI), and NSF-EPSCoR (EPS-0903795).

1. Determinare la percentuale di solidi in batch Collagene <ol><li> Estrarre il collagene seguito di una procedura precedentemente pubblicato 13. Scongelare un minimo di 20 ml di collagene. Determinare la percentuale iniziale di solidi collagene nel batch per manipolare la concentrazione collagene nel idrogel formati. <ol><li> Tagliare tre pezzi di foglio di alluminio (circa 6 x 6 cm) e la forma ciascuno come una vaschetta utilizzando il fondo di un bicchiere 25 ml. Registrare il peso di ciascun piatto. </li><li> Aggiungere una piccola quantità di collagene per ogni vaschetta e registrare il peso totale della vaschetta di alluminio e collagene. Aggiungere 0,5 - 0,8 g di collagene su ogni vaschetta di alluminio. Nota: Dopo questo passo, ci sono tre vaschette foglio di alluminio e ognuno dovrebbero avere una piccola quantità di collagene. Assicurarsi di registrare il peso di ciascuna (totale 3) vaschetta di alluminio vuota e il peso della padella dopo l&#39;aggiunta di collagene. </li><li> Calcolare il peso del collagene in ciascuna vaschetta usando l&#39;fopo formula: peso Collagene = Pan e peso collagene - peso Pan </li><li> Posizionare i tre pentole in alluminio che trattengono il collagene in forno a 100 ° C per 24 ore. </li><li> Dopo 24 ore, registrare il peso di ciascuna vaschetta di alluminio e il collagene disidratato. </li><li> Calcolare il peso del collagene disidratato mediante la seguente equazione: Disidratata peso collagene = Pan e peso collagene disidratato - peso Pan </li><li> Calcolare la percentuale di solido per i tre campioni per determinare la concentrazione di solidi collagene utilizzando la seguente formula: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/53578/53578eq2.jpg" /></li><li> Calcolare il contenuto medio collagene solida del batch utilizzando la percentuale di solidi collagene per ciascuno dei tre campioni. Nota: Il collagene che verrà utilizzato è ciò che resta del collagene idratato. sarà utilizzato Nessuno di collagene disidratato. </li><li> Dopo la determinazione della percentuale di collagene solido (ila concentrazione di collagene nitial) del lotto, continuare a utilizzare il collagene idratato rimanente. Utilizzare un pHmetro calibrato per regolare il pH del lotto collagene per 3. <ol><li> Aggiungere piccole quantità (2-5 ml per volta) di 12 N acido cloridrico (HCl). Tenere in ghiaccio in ogni momento. Non aggiungere cloridrico direttamente al collagene - aggiungere l&#39;acido al lato del tubo. Dopo aver aggiunto l&#39;acido, utilizzare la spatola per spingere l&#39;acido al collagene e rapidamente mescolare. </li></ol></li><li> Una volta raggiunto un pH di 3, lasciate riposare il collagene O / N a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione del BSA gomma <ol><li> Preparare la soluzione di albumina sierica bovina (BSA) seguendo la procedura di seguito elencati. <ol><li> Preparare la soluzione 2x tampone fosfato (PBS). Aggiungere due compresse PBS a 100 ml di acqua per fare 0,02 soluzione M PBS. </li><li> Combinare BSA con 2x PBS per creare una soluzione di BSA 30% utilizzando la procedura di seguito elencati. <ol><li> Ad esempio, per effettuare una BSA 30% con 30 ml di PBS 2x, utilizzare 12,9 g di BSA. Aggiungere 1/3 del 2x PBS (ad esempio, 10 ml) in un pallone con un ancoretta. Aggiungere 1/2 della BSA (ad esempio, 6,45 g BSA) al pallone e con una spatola, bagnare il soluto secca. </li><li> Ripetere questo processo di aggiunta di PBS e BSA finché tutto il soluto e solvente è nel pallone. Utilizzare la spatola per bagnare tutto il soluto. Si sarà simile a una miscela di un liquido e grumi. Lasciate riposare per circa 30 minuti. </li><li> Quindi, accendere l&#39;agitatore su un ciclo basso e fare in modo che non ci siano grumi di tutto il ancoretta. Si dovrebbero prendere 90 minuti per ottenere tutto in soluzione o può essere lasciata mescolando O / N a 4 ° C. Dopo il soluto è tutto dissolto, porre la soluzione in una siringa da 20 ml e ricoperto con un filtro a siringa 0.20 micron. Premere il pistone per espellere liquido attraverso il filtro e raccogliere la soluzione sterilizzata in una nuova provetta. Conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparare 3% soluti glutaraldeideil diluendo soluzione di glutaraldeide al 25% con sterile filtrata 2x PBS. Ad esempio, per 10 ml di soluzione di glutaraldeide al 3%, usare 2 ml di 25% glutaraldeide e 8 ml di PBS 2x. Conservare a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Trattamento Stampi Nota: Il prototipo descritto in questo articolo utilizza un acciaio inox Y pezzo stampo su misura. Lo stampo contiene un afflusso e due canali di deflusso di 4 e 3 mm, rispettivamente. In primo luogo, stampi puliti, spruzzarli con lo strutto insaturi, e sterilizzare. Preparare gli stampi seguendo la procedura descritta di seguito. <ol><li> Pulire stampi in acciaio inox con sonicatore ad una frequenza di 35 kHz. Mettere gli stampi nel sonicatore e sommergere con acqua e ghiaccio. Mantenere gli stampi a freddo in ogni momento durante il sonicatore è in funzione. Eseguire il sonicatore per 2 periodi di 90 min. <ol><li> Dopo ogni periodo, utilizzare un ago per assicurarsi che non vi sia materiale nel Luer Lock acciaio inossidabile o bConnettore Rass. Usare acqua e sapone per pulire l&#39;intera superficie dei due lati degli stampi. Verificare che non vi siano ostruzioni nei canali. </li></ol></li><li> Posizionare la stampi, viti, e connettore Luer lock in un sacchetto autoclave e si. </li><li> Riempire la bottiglia che si attacca a un a metà strada spruzzatore d&#39;aria con lardo disponibile in commercio (misto distaccante di acidi grassi). Sostituire il tappo con una bottiglia tappo normale. Mettere in un sacchetto di autoclave e metterla in esso. Nota: lardo viene utilizzato per facilitare il rilascio del materiale che sarà reazione iniettato successivamente (gomma BSA). Non posizionare il coperchio della bottiglia spruzzatore in autoclave- può danneggiare la tenuta interna. </li><li> Riscaldare il lardo per 45 secondi o fino a quando il suo chiaro e liquido in un forno a microonde. Avvitare il coperchio spruzzatore d&#39;aria alla bottiglia lardo. Collegare il coperchio con lo spruzzatore. Collegare lo spruzzatore alla fonte di aria al banco di laboratorio. Aprire la valvola dell&#39;aria, e aprire l&#39;ugello dello spruzzatore fino a quando non inizia a bagnare la superficiedi un tovagliolo di carta. </li><li> Spray lardo perpendicolare alla superficie dello stampo fino a quando la superficie è completamente coperta. Dopo che ogni pezzo è stato spruzzato, metterli in una capsula di Petri e sigillarla. Posizionare gli stampi a 4 ° C per 2 ore. </li><li> Procedere per sterilizzare gli stampi esponendo la superficie di luce UV per 30 min. Riposizionarle a 4 ° C fino a quando non sono pronti per essere iniettato reazione. </li></ol> 4. Reazione iniezione della gomma BSA Nota: Tutti i materiali e le soluzioni devono essere tenere freddo fino al momento dell&#39;uso per impedire l&#39;impostazione prematura della gomma BSA nei passaggi successivi. <ol><li> Preparare il dispenser per la distribuzione la gomma BSA agli stampi di seguito questi passaggi. <ol><li> Sterilizzare tutti i componenti di miscelazione (due O ring, cap siringa, doppia siringa, miscelare punta e 4: 1 dispenser) esponendoli a luce UV per 30 minuti nella cappa reazione a catena della polimerasi (PCR). Nota: Una cappa PCR è stata utilizzata perché tla procedura prevede fissativi. Questi prodotti chimici non possono essere utilizzati nel cofano coltura cellulare / tissutale a causa del rischio di esposizione e tossicità per le cellule. Qualsiasi altra cappa che contiene una luce UV sarà adatto. </li><li> Posizionare il cappuccio punta sul supporto soluzione. </li><li> Eseguire la miscelazione e l&#39;iniezione in un rapporto di 4: 1 di BSA: glutaraldeide. Aggiungere la BSA 30% alla camera doppia siringa, che consegnerà la più alta quantità di soluzione (Ci vorranno circa 4 ml per riempire). Assicurarsi di lasciare sufficiente spazio per posizionare l&#39;O-ring, al fine di prevenire la contaminazione traboccante e della camera adiacente. </li><li> Aggiungere la soluzione di glutaraldeide al 3% per l&#39;altra camera (ci vorranno circa 1 ml per riempire). Assicurarsi di lasciare sufficiente spazio per posizionare l&#39;O-ring per prevenire la contaminazione traboccante e della camera adiacente. </li><li> Posizionare la doppia siringa sul dispenser. Inclinare il gruppo verticalmente in modo che il tappo della siringa è in cima. Sostituire il tappo con la punta di miscelazione. </li><li> ScRew i due pezzi dello stampo in acciaio inox insieme. </li><li> Posizionare il gruppo all&#39;interno di un sacchetto di autoclave. </li><li> Per rimuovere eventuale aria nel distributore, tenerlo in posizione verticale e rapidamente stringere il manico una volta per rilasciare una piccola quantità di BSA mescolato con la glutaraldeide. Poi rapidamente collegare il connettore Luer lock di acciaio inox Y dello stampo per la punta della siringa. </li><li> Tenere stampo in acciaio inox Y con la mano sinistra e l&#39;erogatore miscela di BSA-glutaraldeide sulla destra. copre Alternate ciascuno di scarico sinistro e destro dei canali di deflusso premendo scarico ai lati della borsa autoclave per assicurarsi che i vuoti all&#39;interno sono pieni di soluzione. Poi, posizionare gli stampi in orizzontale e iniettare di nuovo. </li><li> Staccare gli stampi dal distributore e mettere in un piatto 25 millimetri Petri. </li><li> Posizionare Parafilm intorno alla piastra di Petri per prevenire la disidratazione della gomma. </li><li> Mettere lo stampo in 4 ° C frigo O / N. </li></ol></li></ol> Nota: Il collagene deve essere tenuta in ghiaccio in ogni momento durante il processo. <ol><li> Modificare la concentrazione di collagene utilizzando la percentuale di solidi di collagene. <ol><li> Rendere 10 ml di 1,75% collagene, regolando la concentrazione di collagene iniziale con acqua fredda. </li><li> Utilizzando un pHmetro calibrato, regolare il pH a 3 con 12 N di acido cloridrico. Non aggiungere cloridrico direttamente al collagen- aggiungere acido al lato del tubo. Dopo aver aggiunto l&#39;acido, utilizzare la spatola per spingere l&#39;acido in collagene e rapidamente mescolare. </li><li> Pesare 4 g di collagene in una provetta conica separata. </li><li> Centrifugare il collagene per rimuovere aria a 4 ° C e 9.343 xg per 20-30 min. </li><li> UV sterilizzare la cappa di coltura cellulare per 30 min, e aggiungere 14 ml di laminina al collagene 4 ml. Questo si tradurrà in una concentrazione laminina finale di 10 mg / mL. Nota: Laminina fornisce sintegrità STRUTTURALI, adesione, e promuove varie risposte cellulari. </li><li> Ruotare la PCR UV luce accesa per 20-30 minuti prima di utilizzare il cappuccio per la sterilizzazione. </li><li> Posizionare il tappo Luer lock, per collegare ad una siringa da 20 ml, in etanolo per 2 ore. Poi, lasciare asciugare e mettere in luce UV. </li><li> Gamma irradiare il collagene per 8.6 minuti per raggiungere 1.200 cGy. Nota: Il tempo dipenderà il decadimento della sorgente cesio. Regolare il tempo per raggiungere lo stesso dosaggio. </li></ol></li></ol> 6.Casting collagene su BSA gomma <ol><li> Per polimerizzare il collagene, utilizzare un 8: 1 ratio: 1 (collagene: HEPES: MEM). La procedura che segue si basa su un primo 4 g di collagene acidificato (dal punto 5.1.8). <ol><li> Fare una soluzione 0,2 N HEPES in acqua, e regolare il pH a 9 con l&#39;aggiunta di piccole quantità (1-5 microlitri) di M di idrossido di sodio 1-5 (NaOH). Utilizzando un pHmetro calibrato, controllare il pH della soluzione dopo ogni aggiunta. Conservare a 4 ° C o keep su ghiaccio. </li><li> Accendere la luce UV della cappa coltura tissutale per 20-30 min per sterilizzare la cappa. </li><li> forcipe autoclave, spatola, e bisturi per la sterilizzazione. </li><li> Mescolare 1,5 ml di 0,2 N HEPES (pH 9) e 1,5 ml di MEM 10x utilizzando la cappa coltura tissutale. Assicurati di tenerlo in ghiaccio e vortex per 5 secondi prima dell&#39;uso. Conservare a 4 ° C o tenere in ghiaccio. </li><li> Per sterilizzare il cofano PCR, accendere la luce UV per 30 min. </li><li> Posizionare una piastra 12 pozzetti e una siringa da 20 ml in -20 ° C per 10 minuti, o fino al momento di continuare. Nota: Conservare tutto il materiale freddo fino al momento dell&#39;uso. L&#39;aumento della temperatura induce prematura fibrillogenesi collagene. </li><li> Spruzzare tutti i tubi e le piastre così che stanno per essere nella cappa con il 70% di etanolo e lasciare asciugare per la sterilizzazione. Posizionare una siringa da 20 ml in ghiaccio per raffreddare per un uso successivo. </li><li> Nella cappa PCR, aprire gli stampi in acciaio inox per rilasciare la gomma BSA e utilizzando un bisturi, tagliare i canali di scarico del BSA rmuffa ubber. </li><li> Sotto il cofano della PCR, aprire i tubi di collagene sterili e aggiungere 1 ml di soluzione HEPES-MEM (fare in modo che prima di estrarre la soluzione HEPES-MEM, che è ben amalgamato e non ci sono depositi solidi). </li><li> Utilizzando la spatola sterile, mescolare bene la soluzione di collagene e di buffer. </li><li> Chiudere e vortex rapidamente per garantire un idrogel ben miscelato. </li><li> Trasferire in un fredda siringa da 20 ml. </li><li> Con una mano, tenere il BSA gomma all&#39;interno del pozzo e, con l&#39;altra, dispensare metà della soluzione collagene idrogel sul fondo del pozzo. </li><li> Utilizzando le pinzette sterili, in modo che le estremità di afflusso e deflusso di gomma tocchino i lati del pozzo. </li><li> Versare soluzione di collagene sulla cima della gomma fino è completamente coperto. </li><li> Assicurarsi che la gomma BSA è sospesa all&#39;interno del collagene e che non vi siano bolle, soprattutto in prossimità delle estremità della gomma. </li><li> Mettere il coperchio e avvolgere intorno al Parafilmcirconferenza del pozzo. </li><li> Mettere in incubatrice per 1 ora a 37 ° C. Tenere la luce UV PCR su. </li></ol></li><li> Dopo la polimerizzazione del collagene, UV reticolare il idrogel mediante la seguente procedura. Nota: La reticolazione del collagene sarà effettuata utilizzando un&#39;apparecchiatura reticolante UV in cui la quantità di energia può essere controllata. <ol><li> Accendere il reticolante UV e utilizzare l&#39;impostazione energia per irradiare la camera vuota con 630.000 μJ / cm 2. </li><li> Rimuovere il gel dal termostato. </li><li> Spruzzare mani con etanolo, e, all&#39;interno della camera, rimuovere il coperchio più rapidamente possibile. </li><li> Chiudere la camera e UV reticolare idrogel selezionando l&#39;impostazione di energia e irradiando 630.000 μJ / cm 2. </li><li> Dopo il ciclo di reticolazione, spegnere la luce UV sul cofano PCR </li><li> Spruzzare le mani con etanolo e aprire la camera, mettendo rapidamente il coperchio sulla piastra bene. Spostare la piastra benalla cappa PCR. </li><li> Utilizzando la spatola sterile, allentare delicatamente e rimuovere il gel dal pozzo. Capovolgere il gel sotto il cofano per reticolare il fondo della idrogel. Ripetere il passaggio 6.2.3 e 6.2.4. </li></ol></li></ol> 7. Digestione enzimatica della BSA in gomma <ol><li> Per avere un ponteggio collagene cava, rimuovere BSA gomma in modo che non influenza le dimensioni incorporati nel idrogel. La procedura è descritta di seguito. <ol><li> Accendere la luce UV per 20-30 minuti per sterilizzare il cofano coltura di tessuti. </li><li> Fare 0,25% tripsina soluzione a pH 7.8. Ad esempio, per 15 ml di acqua, aggiungere 0,0376 g di tripsina in una provetta conica da 50 ml. Aggiustare il pH a 7,8 con l&#39;aggiunta di piccole quantità (2-5 microlitri) di 1 M NaCl. Posizionare la soluzione in una siringa da 20 ml e ricoperto con un filtro a siringa 0.20 micron. Premere il pistone per espellere liquido attraverso il filtro e raccogliere la soluzione sterile in una nuova provetta. </li><li> Accendere il bagnomaria e impostare la temperatura a 30° C. </li><li> Dopo 30 minuti, spegnere la luce UV. Spruzzare etanolo su tutti i tubi e materiali che verranno utilizzati nella cappa. </li><li> Trasferire l&#39;idrogel di collagene sotto il cofano e il luogo in tubo conico separata. </li><li> Aggiungere circa 3-5 ml (appena sufficiente a coprire i gel) di soluzione tripsina 0,25% con un pH di 7,8 a ciascuna provetta. </li><li> Sigillare i tubi con Parafilm e vortex leggermente per circa 1 minuto. </li><li> Posto nella 30 ° C bagnomaria per 15-24 ore. Mentre nel bagnomaria, leggermente vortice i gel spesso fino alla gomma BSA è stato digerito o rimosso dal idrogel. Nota: Per determinare se la gomma BSA è stato rimosso, sia la gomma fluttua nella soluzione tripsina o ci sono parti panne. Non ci devono essere zone scure visivi all&#39;interno della idrogel. </li></ol></li><li> Per garantire che tutta la gomma BSA e tripsina è stata rimossa dai idrogel, risciacquo come descritto di seguito. <ol><li> Accendere il hoo PCRd luce UV per 20-30 minuti. </li><li> Preparare la soluzione Mosconas. Combinare cloruro di potassio (KCl, 28,6 mM), (NaHCO 3, 11,9 mM), glucosio (9,4 mM) e (NaH 2 PO 4, 0,08 mM) in acqua. Aggiustare il pH a 7,4 con 1 M NaOH o 12 soluzione M HCl. Posizionare la soluzione in una siringa da 20 ml e utilizzare un filtro a siringa da 0,20 micron per sterilizzare la soluzione. </li><li> Spruzzare il tutto con etanolo prima della loro immissione sul cofano e consentire l&#39;etanolo si asciughi. </li><li> Aprire la provetta e trasferire 5-10 ml di soluzione sterile Mosconas in un tubo da 50 ml. </li><li> Trasferire il idrogel collagene per tubo conico che contiene la soluzione enzimatica. Assicurarsi che l&#39;idrogel è completamente coperto con la soluzione. Lasciare il tubo nella shaker in frigorifero a 4 ° C per 30 min. </li><li> Aspirare la soluzione Mosconas e ripetere il passo 7.2.5 per due volte. </li><li> Conservare a 4 ° C. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kundu, J., Pati, F., Hun Jeong, Y., Cho, D. W., Cho, D. W., Forgacs, G. a. b. o. r., Sun, W. e. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biofabrication. , 23-46 (2013).</li><li>Vats, A., Tolley, N. S., Polak, J. M., Gough, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolds+and+biomaterials+for+tissue+engineering:+a+review+of+clinical+applications.">Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications.</a> Clin. Otolaryngol. 28, 165-172 (2003).</li><li>Chan, B. P., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolding+in+tissue+engineering:+general+approaches+and+tissue-specific+considerations.">Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations.</a> Eur Spine J. 17, s467-s479 (2008).</li><li>Salerno, A., Di Maio, E., Iannace, S., Netti, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+the+pore+structure+of+PCL+scaffolds+for+tissue+engineering+prepared+via+gas+foaming+of+multi-phase+blends.">Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends.</a> J. Porous Mater. 19, 181-188 (2011).</li><li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+scaffolds+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts.">Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts.</a> Acta Biomater. 10, 11-25 (2014).</li><li>Huang, Z. -. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+polymer+nanofibers+by+electrospinning+and+their+applications+in+nanocomposites.">A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites.</a> Compos. Sci. Technol. 63, 2223-2253 (2003).</li><li>Sell, S. A., McClure, M. J., Garg, K., Wolfe, P. S., Bowlin, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+of+collagen/biopolymers+for+regenerative+medicine+and+cardiovascular+tissue+engineering.">Electrospinning of collagen/biopolymers for regenerative medicine and cardiovascular tissue engineering.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 61, 1007-1019 (2009).</li><li>Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Collagen+Nanofibrous+Materials+for+Bone+Tissue+Engineering.">Biomimetic Collagen Nanofibrous Materials for Bone Tissue Engineering.</a> Adv. Eng. Mater. 12, B451-B466 (2010).</li><li>Cao, H., Kuboyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biodegradable+porous+composite+scaffold+of+PGA/beta-TCP+for+bone+tissue+engineering.">A biodegradable porous composite scaffold of PGA/beta-TCP for bone tissue engineering.</a> Bone. 46, 386-395 (2010).</li><li>Ankam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+topography+and+size+determine+the+fate+of+human+embryonic+stem+cells+to+neuronal+or+glial+lineage.">Substrate topography and size determine the fate of human embryonic stem cells to neuronal or glial lineage.</a> Acta Biomater. 9, 4535-4545 (2013).</li><li>Bose, S., Vahabzadeh, S., Bandyopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+tissue+engineering+using+3D+printing.">Bone tissue engineering using 3D printing.</a> Mater. Today. 16, 496-504 (2013).</li><li>Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+trends+and+limitations+in+hydrogel-rapid+prototyping+for+tissue+engineering.">A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering.</a> Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).</li><li>Yost, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+tubular+scaffold+for+cardiovascular+tissue+engineering.">A novel tubular scaffold for cardiovascular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 10, 273-284 (2004).</li><li>Habeeb, A. J., Hiramoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+of+proteins+with+glutaraldehyde.">Reaction of proteins with glutaraldehyde.</a> Arch Biochem Biophys. 126, 16-26 (1968).</li><li>Tanford, C., Buzzell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Viscosity+of+Aqueous+Solutions+of+Bovine+Serum+Albumin+between+pH+4.3+and+10.5.">The Viscosity of Aqueous Solutions of Bovine Serum Albumin between pH 4.3 and 10.5.</a> J. Phys. Chem. 60, 225-231 (1956).</li><li>Yadav, S., Shire, S. J., Kalonia, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscosity+analysis+of+high+concentration+bovine+serum+albumin+aqueous+solutions.">Viscosity analysis of high concentration bovine serum albumin aqueous solutions.</a> Pharm Res. 28, 1973-1983 (2011).</li><li>Tobitani, A., Ross-Murphy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intrinsic+viscosity+of+polyelectrolytes+revisited.">The intrinsic viscosity of polyelectrolytes revisited.</a> Polym. Int. 44, 338-347 (1997).</li><li>Arakawa, T., Timasheff, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+protein+solubility.">Theory of protein solubility.</a> Methods Enzymol. 114, 49-77 (1985).</li><li>Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaraldehyde:+behavior+in+aqueous+solution,+reaction+with+proteins,+and+application+to+enzyme+crosslinking.">Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.</a> Biotechniques. 37, 790-796 (2004).</li><li>Burmeister, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaraldehyde+cross-linked+glutamate+oxidase+coated+microelectrode+arrays:+selectivity+and+resting+levels+of+glutamate+in+the+CNS.">Glutaraldehyde cross-linked glutamate oxidase coated microelectrode arrays: selectivity and resting levels of glutamate in the CNS.</a> ACS Chem Neurosci. 4, 721-728 (2013).</li><li>Chatterji, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin+with+hydrophilic/hydrophobic+grafts+and+glutaraldehyde+crosslinks.">Gelatin with hydrophilic/hydrophobic grafts and glutaraldehyde crosslinks.</a> J. Appl. Polym. Sci. 37, 2203-2212 (1989).</li><li>Freije, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+modified,+immobilized+trypsin+reactor+with+improved+digestion+efficiency.">Chemically modified, immobilized trypsin reactor with improved digestion efficiency.</a> J Proteome Res. 4, 1805-1813 (2005).</li><li>Cunha-Filho, M. S., Alvarez-Lorenzo, C., Martinez-Pacheco, R., Landin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+gels+for+intratumoral+delivery+of+beta-lapachone:+effect+of+cyclodextrins+and+ethanol.">Temperature-sensitive gels for intratumoral delivery of beta-lapachone: effect of cyclodextrins and ethanol.</a> ScientificWorldJournal. 2012, 126723 (2012).</li><li>Basak, R., Bandyopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+hydrophobic+drugs+in+Pluronic+F127+micelles:+effects+of+drug+hydrophobicity,+solution+temperature,+and+pH.">Encapsulation of hydrophobic drugs in Pluronic F127 micelles: effects of drug hydrophobicity, solution temperature, and pH.</a> Langmuir. 29, 4350-4356 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Biofabrication è un settore altamente multidisciplinare in cui i principi biologia e ingegneria si fondono per generare materiali complessi che imitano il tessuto nativo. Per realizzare questo, vi è la necessità di sviluppare tecniche che utilizzano le informazioni raccolte dal tessuto in vivo e tradurlo in un scaffold in vitro. In questo modo, una piattaforma può essere progettato che ricorda da vicino le proprietà architettonici, funzionali e meccaniche del tessuto in vivo. Il materiale ottimale ponteggio deve possedere certe proprietà, come essere biocompatibile, imitano le proprietà meccaniche del tessuto di interesse, sia in grado di degradazione controllata, in grado di supportare la vitalità cellulare, e in grado di consentire rimodellamento tissutale 2,3. Un gran numero di tecniche di fabbricazione sono stati sviluppati per generare vitali, costrutti tridimensionali. Queste tecnologie si dividono in due categorie principali: un convenzionaled avanzata. Le tecniche convenzionali includono l&#39;utilizzo di materiali tradizionali sintetici e naturali per rendere strutture porose. Alcuni esempi sono solventi casting, liofilizzazione, e si fondono stampaggio. Gli svantaggi di queste tecniche includono uno scarso controllo di porosità all&#39;interno della struttura (dimensione dei pori e pori interconnettività) e difficoltà a fare canali interni all&#39;interno dei ponteggi. Tecniche avanzate includono stereolitografia, stampaggio, la stampa 3D, e electrospinning, tra gli altri 1. Queste tecniche presentano degli inconvenienti, quali la mancanza di canali microarchitettura a lungo raggio, selezione dei materiali per fornire resistenza meccanica ottimale pur essendo in grado di erogare attraverso ugelli di piccolo diametro, ottimizzazione dipende dal materiale, richiedono particolari post-elaborazione che possono essere tossici, e limitazione nella progettazione di architetture interne in un costrutto in vitro. Un importante inconveniente di stampa 3D è la disponibilità di biomateriali che sono vettori cellulari adeguateE, contemporaneamente, le proprietà meccaniche necessarie per mantenere una organizzazione architettonica definito 12. La tecnologia qui presentata incorpora entrambe le tecniche di fabbricazione convenzionali e avanzate. Il meglio dei due mondi deriva dalla convergenza di produzione automatizzata per creare, o importare, l&#39;architettura desiderata con lo sviluppo di una gomma enzima-labile. Gli stampi in acciaio inossidabile sono stati creati utilizzando una fresatrice, ma la loro realizzazione non è limitata a questa tecnica. Utilizzo di una stampante 3D (ad esempio, Makerbot), gli stessi stampi sono stati fabbricati da acido polilattico (PLA). Gli stampi negativi sono stati fresati con le direttive architettoniche disegnate dal programma CAD, che prevede stampi solidi che creano un trasferimento semplice e affidabile di funzioni per qualsiasi materiale. Questa tecnologia è significativa in quanto permette non solo il controllo della composizione dei tessuti esterni, ma anche altamente complessa architettura interna. Il lavoro qui presentatosi concentra principalmente sulla caratterizzazione della gomma BSA, che può essere miscelato omogeneamente, è facilmente digeribile in un ragionevole lasso di tempo, sia resistente alle alterazioni nella sua struttura, ed è in grado di mimare tratti minuti, mantenendo la sua stabilità durante il processo di colata . Il limite di questa tecnica è stata testata e la risoluzione del materiale sacrificale può mantenere dimensioni piccole come 300 micron di diametro. Tuttavia, la Figura 7 mostra che il canale è circondato da un sottile strato di distaccante. Utilizzando un microscopio, questa zona supplementare è chiaramente distinta e può essere rimosso per avere la dimensione desiderata. Questa tecnica biofabrication consente la replicazione di un&#39;ampia varietà di strutture interne che vanno dal macro al micro-scala. albumina sierica è la proteina più abbondante nel sistema circolatorio. Poiché le proteine ​​sono polielettroliti, solubilità è stata determinata mediante interazioni elettrostatiche 15-17. È stato dimostrato che a basse concentrazioni saline, c&#39;è una salatura-in effetto sulla proteina facilitando la sua solubilità 18. La glutaraldeide è un agente reticolante che provoca cambiamenti nelle proprietà di albumina. Il cambiamento di colore visibile in figura 1 è attribuito alla formazione di legami aldimine 19-21. La glutaraldeide reagisce principalmente con BSA attraverso i gruppi amminici della lisina per formare legami covalenti intermolecolari 14. I dati indicano che l&#39;aumento dei sali migliorata l&#39;elasticità della gomma (da 1x PBS a 2x PBS). La concentrazione più elevata glutaraldeide produce gel più rigide che impostate in precedenza rispetto a quelli a bassa concentrazione. Tuttavia, essi sono più difficili da erogare, miscelare omogeneamente, e formano gel fragili. Per fornire la quantità appropriata di gomma BSA negli stampi, ogni parte del gruppo deve essere mantenuto freddo perché temperature più elevate accelerano la glutaraldeide e reazione BSA.La gomma ideale (30% BSA 3% glutaraldeide in 2x PBS o PBS 1x) si comporta come un materiale viscoelastico che può sopportare caricamento senza deformazione permanente. Questo diventa molto importante durante la manipolazione e colata materiale intorno alla struttura di gomma BSA. Tripsina è una serina proteasi che idrolizza proteine. La tripsina è un enzima ampiamente utilizzato che ha alta specificità scissione. Fende le catene peptidiche principalmente sul lato carbossilico del amminoacidi lisina e arginina 22. BSA è prontamente solubile a basse concentrazioni in acqua, e la tripsina facilmente digerito gomma BSA lasciando intatta e relativamente intatto il collagene. Il materiale non avrà alcun contatto con le cellule. Il costrutto è stato testato per la presenza di glutaraldeide libera e non vi erano tracce di questo fissativo. Ciò dimostra l&#39;efficacia della gomma BSA come materiale sacrificale per biofabrication. In questo protocollo, il collagene è stato usato come materiale scaffold, ma qualsiasi otsuo materiale che è resistente alla digestione tripsina potrebbe essere utilizzato. Il lavoro futuro sarà focalizzato sulla ricostituzione dei componenti vascolari nei idrogeli seminando patibolo con le cellule endoteliali e fibroblasti. Una delle sfide è quello di creare una distribuzione uniforme delle cellule in tutto l&#39;interno dei canali che imitano la distribuzione 3D nativo. Per risolvere questo problema, una strategia è in fase di sviluppo che permette la chiusura o di collegare dei canali e l&#39;iniezione di sospensione cellulare. Il materiale esaminato è F127 Pluronic, che è un gel termoreversibile, liquido a 4 ° C e un solido superiore ai 30 ° C 23,24. Un&#39;elevata concentrazione di Pluronic ha avuto successo nel creare il sigillo temporale necessaria. Dopo la sospensione cellulare è all&#39;interno dei canali del ponteggio, l&#39;entità viene ruotata per un determinato periodo di tempo fino a quando le cellule aderiscono a tutti i lati della struttura 3D. Il canale interno avrà un adeguato supporto per il mantenimentola sopravvivenza delle cellule. Pluronic mantiene la sua forma di gel ed è facilmente solubile in ambiente acquoso. Una volta che le cellule aderiscono, l&#39;idrogel sarà invaso da media, e può essere coltivato in condizioni stazionarie o portata, a seconda dello scopo dello studio. Questa metodologia sarà ulteriormente valutata e sarà il follow-up di questa pubblicazione. La tecnica biofabrication qui descritta è attualmente utilizzato per sviluppare una replica impalcatura di un dell&#39;arteria renale umano. Lo stesso approccio potrebbe essere fatto con altri tipi di tessuti, come cardiaca, per ampliare l&#39;applicabilità di questa tecnica per una vasta gamma di applicazioni cliniche. La tecnica sviluppata biofabrication qui è un passo avanti nella generazione di ponteggi in vitro che possono ricapitolare caratteristiche geometriche intrinseche modo rapido e affidabile. Un materiale naturale, come il collagene, è stato scelto perché offre chimica ottimale e segnali fisici alle cellule oltre materiali sintetici. questi namateriali strutturali possono essere utilizzati per la ricerca terapeutica, come modelli in vitro di sviluppo, malformazioni e tessuto malattia, così come per la sostituzione del tessuto danneggiato.

Nel campo dell&#39;ingegneria dei tessuti la capacità di fabbricare scaffold tessuto è vitale. Un ponteggio tessuto adatto ha una struttura 3D, è composto da materiali biocompatibili, e mima dell&#39;architettura tessuto vivo per facilitare cellule e tessuti crescita e rimodellamento. Questo ponteggio deve consentire il trasporto delle sostanze nutritive e la rimozione dei rifiuti 1-4. Uno dei principali ostacoli nella produzione di questi scaffold è la capacità di ricapitolare specifiche caratteristiche geometriche in un materiale biocompatibile. Diverse tecniche biofabrication sono stati segnalati per controllare le caratteristiche geometriche di questi ponteggi, esempi sono electrospinning 5-8, solvente colata 9, stereolitografia 10, e 3D-stampa 11, tra gli altri. Queste tecniche sono inferiori nel fornire una relativamente facile trasferimento di controllabili elementi architettonici interni ed esterni, sono costosi, sono limitati dalla risoluzione e la stampabilità ( <em&gt; ad esempio, calibro ugello, limitazione di materiale), o richiedono tecniche di post-fabbricazione che richiede un lungo periodo di tempo per produrre impalcature vitali 12. In molti sistemi di fabbricazione commerciali, la creazione di vuoti interni, canali e caratteristiche si ottiene utilizzando sabbia o altri materiali rimovibili o sacrificali adatti. La parte metallica o plastica è formata intorno allo stampo di sabbia, e una volta solidificato, la sabbia viene rimosso. Più o meno allo stesso modo, la prossima generazione di biomateriali ha bisogno della BioSand equivalente. Pertanto, la gomma BSA è stato sviluppato come un sostituto per BioSand. La gomma BSA è un materiale di nuova formulazione che consiste di albumina di siero bovino reticolata con glutaraldeide. L&#39;obiettivo finale è quello di ricreare specifiche caratteristiche architettoniche in una impalcatura di collagene biodegradabile. Le caratteristiche del biorubber sacrificale che mantiene la fedeltà dimensionale con lo stampo del tessuto originale vengono descritti. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Diverse combinazioni di concentrazioni BSA e glutaraldeide sono stati testati utilizzando una varietà di solventi. Questo materiale è stato creato dalla reazione tra BSA e glutaraldeide. gomma BSA può essere reazione iniettato nelle geometrie complesse degli stampi tessuto. Reticolato BSA è tripsina labile e prontamente digeriti dall&#39;enzima in condizioni di pH e temperatura miti. Al contrario, il tipo intatta collagene è molto resistente alla tripsina digestione. Queste caratteristiche sono stati capitalizzati per rimuovere selettivamente la gomma BSA lasciando dietro di sé il collagene. Il presente lavoro consisteva determinare i parametri ideali necessari per ottenere uno stampo labile in grado di fornire specifiche caratteristiche architettoniche di un&#39;impalcatura biocompatibile. Le caratteristiche specifiche che sono stati valutati inclusi miscibilità, digestione enzimatica, portante, e la capacità di essere reazione iniettato in uno stampo negativo. La combinazione del 30% BSA e 3% glutaraldeide soddisfa questi requisiti. Questo protocollo prevede la necesslinee guida ary per creare queste impalcature tridimensionali. Il prototipo è costituito da un ponteggio collagene che rappresenta un&#39;architettura ramificato con un afflusso e deflusso due canali con diametri rispettivamente 4 e 3 mm,. Questa tecnica ha il potenziale per imitare macro e micro-ambienti del tessuto di interesse. Questa tecnologia fornisce una tecnica praticabile per fornire una determinata istruttivo geometrico di un materiale biodegradabile in una questione relativamente facile e tempestiva con alta fedeltà, che può essere sintonizzata per imitare il vivo elasticità dei tessuti e altre caratteristiche del tessuto di interesse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="770">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">Collagen type I</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:217px;">Collagen extracted from calf hide</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocloric Acid (HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets)</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>U5378</td>
			<td>1 tablet per 100 mL makes 1XPBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumium from bovine serum (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lard</td>
			<td>Fields</td>
			<td>3090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless Steel Molds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Milled using Microlution Machine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Air Brush Kit</td>
			<td>Central Pneumatic</td>
			<td>47791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mixing Tip for double syringe</td>
			<td>Medmix</td>
			<td>ML2.5-16-LLM</td>
			<td>Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Small O ring for double syringe</td>
			<td>Medmix</td>
			<td>PPB-X05-04-02SM</td>
			<td>Piston B, 5mL, 4:1, PE natural</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Double Syringe cap&#160;</td>
			<td>Medmix</td>
			<td>VLX002-SM</td>
			<td>Cap, 4:1/10:1, PE brown, med</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Big O ring for double syringe</td>
			<td>Medmix</td>
			<td>PPA-X05-04-02SM</td>
			<td>Piston A, 5 mL, 4:1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Double Syringe&#160;</td>
			<td>Medmix</td>
			<td>SDL X05-04-50M</td>
			<td>Double syringe, 5 mL, 4:1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Double Syringe Dispenser</td>
			<td>Medmix</td>
			<td>DL05-0400M</td>
			<td>Dispenser, 5 mL, 4:1, med , plain</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminim</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6 mg/mL- extracted USC lab</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 mL Syringe Luer Lock Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luer Lock Caps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>JGTCBLLX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gibco Minimum Essential Media 10X (MEM)</td>
			<td>&#160;Life Technologies</td>
			<td>1143-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV Crosslinker&#160;</td>
			<td>Spectroline UV</td>
			<td>XLE1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Cloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-10</td>
			<td>To prepare Mosconas</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P5405-250</td>
			<td>To prepare Mosconas</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td>To prepare Mosconas</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>G-8270</td>
			<td>To prepare Mosconas</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-7907</td>
			<td>To prepare Mosconas</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Filter for syringes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional biomimetic technology: novel biorubber creates defined micro- and macro-scale architectures in collagen hydrogels

ponteggi tessuti giocano un ruolo cruciale nel processo di rigenerazione dei tessuti. L&#39;impalcatura ideale deve soddisfare alcuni requisiti, come avere la composizione corretta, il modulo di mira, e le caratteristiche architettoniche ben definiti. Biomaterials che ricapitolano l&#39;architettura intrinseca del tessuto vivo sono essenziali per lo studio delle malattie e per facilitare la rigenerazione del tessuto molle perduto e valido. Una tecnica biofabrication romanzo è stato sviluppato che combina stato di imaging arte, stampa tridimensionale (3D), e l&#39;attività enzimatica selettiva per creare una nuova generazione di biomateriali per la ricerca e l&#39;applicazione clinica. Il materiale sviluppato, gomma Bovine Serum Albumin, è reazione iniettato in uno stampo che sostiene specifiche caratteristiche geometriche. Questo materiale sacrificale permette l&#39;adeguato trasferimento di caratteristiche architettoniche di un materiale impalcatura naturale. Il prototipo è costituito da un ponteggio collagene 3D con 4 e 3 canali mm che ReprESENT un&#39;architettura ramificata. Questo documento enfatizza l&#39;uso di questa tecnica biofabrication per la generazione di costrutti naturali. Questo protocollo utilizza un software per computer (CAD) per produrre uno stampo solido che sarà reazione iniettato con gomma BSA seguita dalla digestione enzimatica della gomma, lasciando le sue caratteristiche architettoniche all&#39;interno del materiale scaffold.

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels at JoVE.com

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

An innovative biofabrication technique was developed to engineer three-dimensional constructs that resemble the architectural features, components, and mechanical properties of in vivo tissue. This technique features a newly developed sacrificial material, BSA rubber, which transfers detailed spatial features, reproducing the in vivo architectures of a wide variety of tissues.

Tridimensionale Tecnologia biomimetica: Novel Biorubber Consente di creare Definito micro e macro scala Architetture in collagene idrogel

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

three-dimensional-biomimetic-technology-novel-biorubber-creates

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.1K Views.  Medical University of South Carolina. An innovative biofabrication technique was developed to engineer three-dimensional constructs that resemble the architectural features, components, and mechanical properties of in vivo tissue. This technique features a newly developed sacrificial material, BSA rubber, which transfers detailed spatial features, reproducing the in vivo architectures of a wide variety of tissues.

Video: Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Fabbricazione di micro-tessuti utilizzando i moduli di Collagene Gel cellule contenenti

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Ricerca

Bioingegneria

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Idrogeli di alginato per tridimensionale Cultura Organo di ovaie e tube

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Stampa planare e tridimensionale di inchiostri conduttivi

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrati

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Umana Cartilagine Tessuto Fabrication Uso tridimensionale Tecnologia Inkjet Printing

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Analisi della migrazione delle cellule all&#39;interno di una tridimensionale di collagene Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Generazione di una tridimensionale a tutto spessore della pelle Equivalent e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Sciogliere elettrofilatura scrittura di scaffold tridimensionale Poly(ε-caprolactone) con morfologie controllabile per applicazioni di ingegneria del tessuto

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

Coltura di cellule di idrogeli ultrasottile Innova elastico come una membrana dello scantinato biomimetici per Dual

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...