This work was supported by a Project for Private Universities: matching fund subsidy from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan (T.I.) and Grants-in-Aid for Scientific Research (C) from MEXT (S.T. and K.N).

I protocolli e l&#39;uso di animali da esperimento sono stati approvati dalla cura degli animali e l&#39;uso dei comitati istituzionali presso l&#39;Università di Yamanashi e Waseda University. La cura degli animali è stata eseguita in conformità con le linee guida istituzionali. 1. CPEC Preparazione <ol><li> Preparare i seguenti apparati e materiali: un microscopio stereo, preferibilmente in grado di trasmettere illuminazione dal basso; un paio di pinze da orologiaio (Dumont # 3 o # 4), sterilizzata fiamma, forbici operativi diritte, sterilizzato fiamma; due sterili piatti 10 centimetri di plastica contenenti 20 ml ghiacciata Leibovitz L-15; 35 millimetri piatti con fondo di vetro, contenenti 2 ml di RT Leibovitz L-15; un becher da 100 ml contenente 70% di etanolo; cuccioli neonatali mouse. </li><li> Brevemente immergere un mouse neonatale in 70% di etanolo e eutanasia rapidamente decapitazione utilizzando le forbici operativi. </li><li> Mettere subito la testa in gelida Leibovitz L-15 di media sterile 10 centimetri dish. </li><li> Togliere la pelle dai calvaria utilizzando la coppia di pinze orologiaio, tagliare aprire il cranio per esporre il cervello, e quindi tagliare i nervi cranici per isolare tutto il cervello. </li><li> Trasferire il cervello per un nuovo piatto contenente ghiacciata Leibovitz L-15 a medio e osservare al microscopio stereo, facendo in modo che il cervello è completamente immerso nel mezzo. </li><li> Impostare la parte dorsale del cervello rivolto verso l&#39;alto, e orientare il cervello in modo che i bulbi olfattivi risiedono nella posizione 03:00 (per le persone destri). Tenere il cervello leggermente con le pinzette nella mano sinistra. </li><li> Utilizzando le pinze dissezione fini (Dumont # 3 o 4 #) nella mano destra, tagliare il corpo calloso e sotto il parenchima che collega gli emisferi cerebrali, lungo la fessura longitudinale del cervello. </li><li> Spingere delicatamente gli emisferi cerebrali via ai fianchi laterali ed esporre la fessura cerebrale trasversale. </li><li> Separare gli emisferi pizzicando fuori the parenchima tra l&#39;emisfero e talamo. </li><li> Estrarre delicatamente i laterali plesso coroideo ventricolari che è attaccato alla parte laterale dell&#39;ippocampo dal Affixa lamina. </li><li> Trasferire i isolati plesso coroideo al piatto fondo di vetro 35 millimetri contenente fresco Leibovitz L-15 di media, e sovrapporre un peso (Materials List) delicatamente per tenere il tessuto in luogo. </li></ol> 2. Immagini dal vivo di CPEC Cilia <ol><li> Verificare il corretto raggi ultravioletti (UV) e il filtro dedotto (IR) taglio (s) per bloccare luminosa inferiore a 400 nm e più di 700 nm, e che a densità neutra (ND) Filtri (25% e il 6%), sono inseriti nel percorso di luce del microscopio invertito. </li><li> Regolare la messa a fuoco della lente obiettivo rudemente per occhio, e quindi regolare il condensatore in modo che il centro ed il fuoco per conformarsi alla illuminazione Köhler. Inserire un contrasto interferenziale differenziale appropriata (DIC) prisma, un elemento DIC, nonché analizzatore e polarizzatore elementi in lipercorso ght di conformarsi alle ottiche DIC. </li><li> Regolare il contrasto di vista dalla posizione del prisma DIC modo che la struttura della superficie del tessuto è più riconoscibile. Se tutti cilia delle cellule bersaglio sono mobili, una chiara visione di ciglia motile non può essere ottenuta con occhio a causa del loro movimento. </li><li> Modificare il percorso della luce per la videocamera, e rimuovere i filtri ND per aumentare la potenza della luce. </li><li> Usare la fotocamera in modalità di messa a fuoco per regolare il campo visivo e messa a fuoco. Durante la messa a fuoco, in cui le immagini video vengono visualizzati in tempo reale sul monitor, una chiara visione di ciglia motilità non è disponibile. </li><li> Usare la fotocamera a 200 Hz con un tempo di esposizione di 0,1 ms per il periodo desiderato (secondi a minuti). Dopo l&#39;acquisizione della pila di immagini, singoli fotogrammi visualizzeranno strutture ciliari chiare. Se i bordi ciliari sono sfocate, di aumentare la frequenza dei fotogrammi o utilizzare un tempo di esposizione più breve. </li><li> Registrare il movimento di CPEC ciglia entro 25-60 minuti dopo l&#39;eutanasia in LeibovitzL-15. </li></ol> 3. Analisi del Movimento ciliare <ol><li> Tenere traccia manualmente battendo i modelli di ogni ciglio sul monitor del computer. Segna posizioni punta ciliare in ogni fotogramma con il puntatore del mouse, che vengono assemblati per informazioni traiettoria di ogni ciglio. O analizzare le informazioni traiettoria con lo stesso software o esportare in altre applicazioni più generali per ulteriori analisi. L&#39;efficienza di questa fase di analisi è descritto nella discussione. </li><li> Classificare le traiettorie in due modalità di movimento, avanti e indietro o di rotazione, a occhio. </li><li> Calcolare la frequenza battito ciliare (CBF) utilizzando la seguente formula: [CBF = (numero di fotogrammi al secondo) / (numero medio di frame per un singolo battito)] 14, che può essere ottenuto da un diagramma di moto punta ciliare (Figura 3 ). Ripetere questo calcolo per più cicli battito ciliare, perché altra cilia sulla stessa cella può interferire con il movimento di ciascun cilium, con conseguente irregolarità. </li><li> Per analizzare l&#39;uniformità angolare del battito ciliare assi all&#39;interno di una singola cella, definire l&#39;angolo θ battitura per ogni traiettoria (Figura 4). Per traiettorie indietro e indietro, misura le posizioni della punta cilia a una linea retta, e definire θ come l&#39;angolo del segmento fa con asse x. Per traiettorie rotazionali, montare le posizioni ad un&#39;ellisse, e definire θ come l&#39;angolo l&#39;asse maggiore dell&#39;ellisse fa con asse x. I dettagli del montaggio sono descritti nella sezione risultati rappresentativi. </li><li> Per una descrizione quantitativa di ogni traiettoria, calcolare generalizzata proporzioni AR. Brevemente, ruotare la traiettoria - θ e definire AR come il rapporto tra le larghezze della distribuzione lungo x - e -axes y (Figura 4B). I dettagli sono indicati nella sezione risultati rappresentativi, e l&#39;interpretazione, Significato, e la limitazione del parametro sono descritti nella discussione. </li></ol> 4. Preparazione del campione per SEM Nota: SEM è un metodo importante per valutare lo stato delle ciglia su CPECs in modo globale. Per preparare campioni per SEM, una procedura standard riportato in precedenza 15 viene impiegato con lievi modifiche. <ol><li> Prima sezionare il tessuto dal cervello, preparare il fissativo in una fiala di vetro da 5 ml con tappo in polietilene. Il fissativo contiene il 2% paraformaldeide, glutaraldeide al 2,5% (metà soluzione Karnovsky 16) in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4. </li><li> Sezionare il tessuto dal cervello come descritto al punto 1. </li><li> Brevemente sciacquare il tessuto isolato con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) in un nuovo piatto e quindi fissare il tessuto nella fissante nella fiala di vetro per 1 ora a temperatura ambiente. Utilizzare pipette monouso e trattare i campioni gente. Dopo lavaggio in HBSS, il tessuto diventa appiccicoso. <ol><li> Per trasferire i campioni nella soluzione fissativo, lentamente espellere una piccola quantità di soluzione contenente il tessuto dalla pipetta di trasferimento come una gocciolina e aggiungere al fissativo. </li></ol></li><li> Dopo la fissazione, scartare il fissativo e lavare il tessuto con tampone fosfato tre volte. </li><li> Immergere il tessuto in una soluzione di saccarosio al 10% per lavare i restanti aldeidi. Per assicurare l&#39;eliminazione completa aldeidi, immergere i campioni nella soluzione per 10 minuti e quindi ripetere due volte con fresca 10% di saccarosio. Questo passaggio è importante per una buona post-fissazione in fasi successive. </li><li> Immergere il tessuto in una soluzione di 1% tetrossido di osmio in tampone fosfato per 30 min e poi posto su ghiaccio per post-fissazione. Giudicare il grado di osmification dal colore del campione: quando aldeidi vengono completamente rimossi, il campione è nero. </li><li> Lavare i campioni di tessuto post- fisso a lungo con doppio distilled acqua più volte. </li><li> Disidratare i campioni di immersione in concentrazioni graduati di etanolo, generalmente 65%, 75%, 85%, 95%, 99% e 100%, per 10 minuti ciascuno. Ottenere etanolo anidro inserendo setacci molecolari in 99,5% di etanolo da una bottiglia appena acquistato. Ripetere disidratazione con etanolo anidro tre volte. </li><li> Porre i campioni disidratati in acetato di isoamile, un reagente di sostituzione per punto essiccazione critico, per 10 min. Ripetere questa operazione due volte. Questo reagente evapora rapidamente e il campione può diventare secca, con conseguente distruzione dalla tensione superficiale. Pertanto, non asciugare completamente il campione. </li><li> Dopo l&#39;ultimo scambio di acetato isoamile, rimuovere la maggior parte del solvente, immediatamente avvolgere la fiala di vetro aperto con un foglio di alluminio, e posizionare il flacone in ghiaccio secco. Utilizzando un ago o una pinza sottile, fare diversi fori nella pellicola che copre la bocca del flacone, in modo che l&#39;anidride carbonica liquida scorre facilmente nel flaconcino nel punto dryer critica. Passare alla fase successivail più rapidamente possibile. </li><li> In questa fase, ridurre al minimo il riporto di acetato isoamile nella camera del phon, ma non lasciare che il campione asciughi completamente prima del punto di essiccazione critico. Inoltre, non lasciare il campione sul ghiaccio secco per un tempo inutilmente lungo per evitare la formazione di brina sulla fiala. </li><li> Trasferire le fiale di vetro imballati in pellicola contenenti i campioni di tessuto nel punto dryer critico che assicura la struttura superficiale del tessuto rimane intatto mentre l&#39;acqua contenuta nella rimozione del tessuto. Informazioni dettagliate sul funzionamento del punto asciugatrice critica può essere ottenuto dalle istruzioni del produttore. </li><li> Maneggiare con cura i campioni con uno stuzzicadenti per ridurre al minimo i danni meccanici. I campioni di tessuto derivanti secche sono fragili. Montare i campioni sul stub metallo e cappotto d&#39;oro-palladio utilizzando una polverizzazione ionica. </li></ol> 5. Osservazione al SEM <ol><li> Osservare da SEM e registrare immagini con una fotocamera digitaleattrezzato per microscopio elettronico a scansione. </li><li> Trasferire i dati delle immagini digitali ad un PC per l&#39;analisi. </li></ol>

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	<li>Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+ciliary+motility+on+choroid+plexus+epithelial+cells+during+the+perinatal+period.">Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period.</a> Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).</li><li>Bisgrove, B. W., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cilia+in+developmental+disorders+and+disease.">The roles of cilia in developmental disorders and disease.</a> Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).</li><li>Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+cilia+go+bad:+cilia+defects+and+ciliopathies.">When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).</li><li>Oh, E. C., Katsanis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia+in+vertebrate+development+and+disease.">Cilia in vertebrate development and disease.</a> Development. 139 (3), 443-448 (2012).</li><li>Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+cilia+of+human+airway+epithelia+are+chemosensory.">Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory.</a> Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).</li><li>Kiprilov, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+in+culture+possess+primary+cilia+with+hedgehog+signaling+machinery).">Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery).</a> The Journal of Cell Biology. 180 (5), 897-904 (2008).</li><li>Hirokawa, N., Tanaka, Y., Okada, Y., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+flow+and+the+generation+of+left-right+asymmetry.">Nodal flow and the generation of left-right asymmetry.</a> Cell. 125 (1), 33-45 (2006).</li><li>Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+multiple+primary+cilia+reveals+a+novel+mode+of+ciliary+development+in+mammals.">Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals.</a> Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).</li><li>Takeda, S., Narita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+vertebrate+cilia,+towards+a+new+taxonomy.">Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy.</a> Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).</li><li>Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+polyglutamylation+is+essential+for+airway+ciliary+function+through+the+regulation+of+beating+asymmetry.">Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).</li><li>Foster, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+ciliary/flagellar+beating+of+Chlamydomonas.">Analysis of the ciliary/flagellar beating of Chlamydomonas.</a> Methods in Cell Biology. 91, 173-239 (2009).</li><li>Lechtreck, K. -. F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+digital+imaging+of+ependymal+cilia+in+the+murine+brain.">High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain.</a> Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).</li><li>Okada, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+nodal+cilia+movement+and+measurement+of+nodal+flow.">Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow.</a> Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).</li><li>Chilvers, M. A., Rutman, A., O&#8217;Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+beat+pattern+is+associated+with+specific+ultrastructural+defects+in+primary+ciliary+dyskinesia.">Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).</li><li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetry+and+kinesin+superfamily+protein+KIF3A:+new+insights+in+determination+of+laterality+and+mesoderm+induction+by+kif3A-/-+mice+analysis.">Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis.</a> The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).</li><li>Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolarity+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. Questo lavoro si propone di riferire metodologia dettagliata per osservare la motilità delle ciglia in isolate tessuti plesso coroide. Novità scientifiche sono stati riportati in studi precedenti 1,8.

Prospettive di questo metodo Sebbene la tecnica qui descritta non fornisce un&#39;analisi più dettagliata delle ciglia rispetto ai metodi precedentemente pubblicati, il significato di questa tecnica risiede nella semplicità del sistema ed economicità, che può essere facilmente applicato a qualsiasi tipo di screening di motilità ciliare ex vivo. In particolare, TI Workbench fornisce un&#39;interfaccia semplice e user-friendly che consente ai ricercatori di osservare e analizzare la motilità ciliare più facilmente. Efficaci metodi di monitoraggio automatici non sono stati sviluppati per gli oggetti a basso contrasto, come le ciglia senza macchia in video-enhanced contrasto DIC. Anche se il metodo per tracciare il movimento ciliare è manuale in questa tecnica, la quantità di sforzo in ciliare analisi di motion tracking in modo ottimale ridotta rispetto all&#39;uso di software di uso generale per l&#39;analisi delle immagini. Dissezione del campione Per preparare ex campioni vivo CPEC, manipolazioni rapide e delicate sono necessari per preservare la vitalità dei tessuti, che garantisce la motilità delle ciglia ex vivo. Perché contaminazione da eritrociti offusca il campo di osservazione, gentile ma intricato lavaggio del tessuto sezionato con tampone fosfato è fortemente raccomandato. Per evitare il sanguinamento, la cura deve essere esercitata per evitare di strappare coroide dell&#39;arteria posteriore che può essere identificato come una struttura filiforme rossastro prominente aderito alla lamina Affixa del plesso colloidale. Microscopio Un microscopio invertito equipaggiato con ottica DIC e una sorgente luminosa trasmissione ad alta potenza è essenziale per questo metodo. Poiché le lampade al mercurio sono generalmente incapaci di frequente accensione e lo spegnimento, un otturatore di fronte l&#39;alloggiamento della lampada è necessario. O un otturatore manuale o elettrico può essere utilizzato per questo scopo. Per proteggere i campioni e gli occhi fr dell&#39;osservatoreom UV e luce IR, filtri ottici sono necessari per consentire solo la luce visibile (400-700 banda passante o una combinazione di filtri IR e UV). Filtri ND sono necessari per modificare la potenza della luce che varia a seconda della situazione anche: monitoraggio da parte dell&#39;occhio, messa a fuoco con una videocamera, e ad alta velocità di registrazione time-lapse. Una lente obiettivo con elevata apertura numerica è necessaria per una risoluzione elevata. C&#39;è una certa distanza tra la parte superiore del vetrino e il punto focale causa della morfologia e lo spessore del tessuto. Pertanto, una lente immersione in acqua piuttosto che un obiettivo a immersione in olio è preferito per una migliore qualità dell&#39;immagine. Isolamento delle vibrazioni è anche necessario produrre pile di immagini stabili. Tavoli Air dumper tipo sono utili per questo scopo, ma semplice ammortizzazione del microscopio inserendo palle da tennis sotto la base del microscopio con un tavolo stabile può anche funzionare. Videocamera Una telecamera CCD capace di almst 200 fotogrammi / sec è necessario per tracciare il movimento delle ciglia. Negli ultimi dieci anni, le telecamere CCD con frame rate più veloci rispetto al tasso standard video (25-30 Hz) si sono resi disponibili a costi molto più bassi. Modelli fotocamera in grado di tempi più brevi rispetto esporre l&#39;intervallo del fotogramma sono utili per ridurre la sfocatura dovuta al movimento delle ciglia senza aumentare la quantità di dati. Un tempo di esposizione di 0,1 ms e un intervallo di telaio 5 msec (200 Hz) sono le condizioni minime per ottenere immagini ciliari CPECs con una qualità sufficiente. Software L&#39;analisi per tracciare il movimento di ogni ciglio richiede molto tempo, specialmente quando i pacchetti software di uso generale per l&#39;analisi delle immagini vengono utilizzati per tenere traccia ogni punta ciliare. Ridurre le fasi di attività ripetute, come mouse cliccando sulla posizione della punta ciliare sul monitor, la selezione di un menu per registrare la posizione cliccata, e facendo clic su un pulsante per passare al fotogramma successivo dell&#39;immagine, si traduce in un significativo reproduzione di tempo e fatica. In questo studio, una routine speciale è stata aggiunta al software TI Workbench su misura. Nella modalità di tracciamento ciliare del software TI Workbench, l&#39;utente continua a loop la seguente operazione in due fasi semplice: spostando il puntatore del mouse alla punta ciliare e premendo un tasto freccia sulla tastiera per avanzare il telaio, che non richiede il movimento puntatore del mouse o gli occhi dell&#39;utente per spostare (a menu e pulsanti sullo schermo del computer) dalle punte ciliari sullo schermo del computer. Il software registra i posizioni punta ciliari, mostra la traiettoria registrata per assistere l&#39;utente, e crea una tabella di informazioni sul movimento ciliare per ulteriori analisi. Maggior parte dei software di uso generale per l&#39;analisi delle immagini consente di macro di programmazione per l&#39;elaborazione batch di tali compiti ripetuti. Tale programmazione personalizzato per ridurre passaggi ripetuti è fortemente raccomandato. Analisi delle traiettorie Estrazione del trajectories è stata effettuata utilizzando il software TI Workbench su misura, come descritto sopra. Un&#39;analisi relativamente semplice e di elaborazione delle immagini sono stati effettuati con lo stesso software. Per le analisi di montaggio, la traiettoria di ogni punta ciliare è stato trasferito al software Igor Pro. Altri software di analisi avanzato come MATLAB può essere usato anche per questo scopo. Nel corso di studio, a causa delle difficoltà di categorizzare le traiettorie in avanti e indietro o traiettorie di rotazione, le traiettorie sono stati classificati ad occhio in cieco, che sono state confermate da un altro osservatore, con conseguente classificazione coerente. Tuttavia, più matematicamente rigoroso misure per categorizzare le traiettorie senza possibilità di arbitrio sarebbe preferibile. Ellisse montaggio delle traiettorie sembra essere ideale, che potrebbe quantificare l&#39;entità della ellitticità come le proporzioni dell&#39;ellisse attrezzata () sia in avanti e indietro e movimenti di rotazione. Tuttavia, Un tentativo di utilizzare la distribuzione del rapporto di aspetto per definire un valore di soglia per la classificazione era inefficace. Il raccordo spesso fallito per traiettorie indietro e indietro, i parametri non è riuscito spesso a convergere, e il raccordo convergenti era apparentemente illusorio. Pertanto, il montaggio ellisse non è stato adottato per classificare automaticamente le traiettorie o quantificare l&#39;ellitticità di ogni traiettoria. Il montaggio è stato effettuato per estrarre direzione battito punte rotazionale movimento come l&#39;asse maggiore dell&#39;ellisse montato. In questo studio, AR è stato proposto per quantificare la misura in cui una traiettoria devia da un lineare ideale movimento di va e vieni. Il parametro è il rapporto tra la larghezza della distribuzione perpendicolare alla direzione battitura a quella lungo la direzione. Il valore dovrebbe essere zero quando la traiettoria è una linea retta, e uno quando la traiettoria è un cerchio, simile al formato dell&#39;ellisse di cui sopra. In pratica, ottenendo il valore AR può essere relativamente facile ruotando la traiettoria, in modo che la direzione di battitura diventa parallela alla asse x (Figura 4B). Tale quantificazione porta a valori notevolmente distinti per le due modalità di movimento, che suggerisce l&#39;uso potenziale del parametro non solo per quantificare le caratteristiche di ogni traiettoria, ma anche per classificare più rigorosamente le traiettorie. Tuttavia, va notato che la direzione battito stessa è già il risultato di processi di montaggio distinti per le due modalità del metodo corrente. Ulteriore miglioramento dell&#39;analisi, ad esempio un algoritmo di raccordo più avanzata, potrebbe risolvere i problemi di possibile arbitrarietà. Un aspetto riguardante l&#39;ellitticità della traiettoria è che il battito di ogni cilium CPEC non possa essere in atto nel piano che è rigorosamente perpendicolare al x - y </em&gt; piano di osservazione. In effetti, i risultati dell&#39;imaging SEM implicavano che CPEC cilia sono spesso inclinato, e l&#39;inclinazione possono portare a ellitticità apparente o anisotropia delle traiettorie. Preparazione per SEM Durante la preparazione per l&#39;osservazione SEM, ci sono diversi punti importanti che assicurano l&#39;acquisizione di immagini di alta qualità. Innanzitutto, post-fissazione con tetrossido di osmio deve essere eseguita accuratamente, comprese pre-lavaggio con una soluzione di saccarosio al 10%. Senza un adeguato fissaggio dalla procedura osmification, i passi successivi non possono mantenere o ripristinare la condizione dei campioni, portando ad una qualità inferiore della preparazione. Perché fissativi aldeide stanno riducendo gli agenti, eventuali aldeidi rimanenti all&#39;interno del campione inibiscono l&#39;attività di tetrossido di osmio, un forte reattivo ossidante. Per assicurare l&#39;eliminazione di aldeidi superflue nei campioni, lavaggio accurato con la soluzione di saccarosio è un imperativo. Nei casi di po subottimalest-fissaggio, il colore del campione non cambia dal marrone al nero. In secondo luogo, il volume di tetrossido di osmio deve essere almeno 50 volte più grande di quella del campione. Altrimenti, la fissazione sufficiente non può essere previsto. In terzo luogo, è importante evitare l&#39;essiccazione completa dei campioni, in particolare durante il processo di disidratazione che impiega etanolo altamente puro e acetato isoamilico. Essiccazione del campione distrugge le strutture superficiali fini come cilia, con conseguente scarsa qualità delle immagini.

Cilia are hair-like projections on the surface of most vertebrate cells, which have attracted attention by medical researchers because of a class of diseases termed ciliopathies2&#8211;4. Despite the ubiquitous expression of the organelle, a wide variety of ciliary functions have been reported, including motility and biosensing. For example, motile cilia on the mucoepithelial surface transport mucus5 and epithelial debris to the outlet of tracts, thereby preventing disease by clearing the surface of epithelia. Moreover, during early developmental periods and embryonic stages, cilia regulate the proliferation of stem cells6, and are involved in the determination of left&#8211;right asymmetry of the vertebrate body7. 
Choroid plexus epithelial cells (CPECs) are derivatives of neuroepithelial cells that cover the surface of the choroid plexus tissue in the brain, which play important roles in maintaining homeostasis of the intracranial environment by production of cerebrospinal fluid (CSF). It has been previously demonstrated that CPECs have multiple non-motile cilia that regulate the production of CSF through G-protein-coupled receptors that are specifically concentrated on the cilia8. Although these cilia had been regarded as quiescent non-motile cilia, it was discovered that some CPEC cilia exhibit transient motility during the neonatal period1. This finding was quite important because it revealed that so-called non-motile cilia are not necessarily immotile from the beginning of development and might display transient motility during specific time windows, possibly in response to specific physiological demands and functions9. To precisely describe the motile nature of CPEC cilia, it is necessary to develop an ex vivo observation system that encompasses analysis of the kinetic profiles unique to CPEC cilia. 
With respect to motility, although several technical reports have described observations of the motile cilia of the tracheal epithelium5,10, motile single-cell flagella11, so-called conventional motile cilia12, and nodal cilia13, detailed analytical methods applicable to relatively undulated structures such as the choroid plexus have not been well documented so far. Moreover, a high time resolution is required to analyze the ciliary movement of CPECs, in which expensive high-speed cameras are indispensable. To circumvent this necessity and simplify monitoring the ciliary motility of various cell types, a low cost, high-speed camera has been introduced, and an easily accessible and convenient method to record the motility of motile cilia, especially to describe the speed and pattern of motion of each cilium, has been developed1. Moreover, original image analysis software &#8220;TI Workbench&#8221; has been used here to facilitate detailed analysis of motility. Collectively, this method provides a new concise strategy to analyze ciliary motion together with correlative scanning electron microscopy (SEM), which can be adopted in a wide range of cilium research.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>for both live imaging and SEM preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flat paper towel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#934;10-cm plastic dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mL beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight operating scissors</td>
			<td>Sansyo</td>
			<td>S-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>watchmaker forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>No.DU-3 or -4, INOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for live cell imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom dish</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>D110300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for SEM preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL glass vial with a polyethylene cap</td>
			<td>Nichiden Rika-Glass</td>
			<td>PS-5A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipette</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>SM251-1S</td>
			<td>for specimen tranfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>toothpick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for specimen transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ion sputter with gold-palladium</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>E-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>critical point dryer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HCP-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for live cell imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 W mercury lump housing and power supply</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-ULH and BH2-RFL-T3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 W mercury lamp</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>USH103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC condenser, n.a. 0.55</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-LWUCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrrical shutter</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>VS35S22M1R3-24 and VMM-D1</td>
			<td>manual shutter can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter (400-700 nm, &#934;45 mm)</td>
			<td>Koshin Kagaku</td>
			<td>C10-110621-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ND filter (&#934;45 mm)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>45ND6, 45ND25</td>
			<td>combination of 25% and 6% ND filters are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective lens (water immersion) with DIC element</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-speed video camera</td>
			<td>Allied Vision Technologies</td>
			<td>GE680</td>
			<td>&#62;= 200 Hz frame rate and 1 msec expose time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition / analysis software</td>
			<td>in-hous software</td>
			<td>TI Workbench</td>
			<td>capable of acquisition at high frame rates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC for camera control / analysis</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Mac Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration isolation table</td>
			<td>Meiritsu Seiki</td>
			<td>AD0806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>weight for tissue</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>slice anchor kits</td>
			<td>It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed &#934;0.5mm platinum wire.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scanning electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JSM-6510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for live cell imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol&#160;</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>057-00456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-15 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for SEM preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol&#160;</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>057-00456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde&#160;</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>17003-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoamyl acetate</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>02710-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Sieves 4A 1/8&#160;</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>130-08655</td>
			<td>for preparation of anhydrous ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer, 0.1 M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monosodium phosphate (dihydrate)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>31718-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disodium phosphate (anhydrous)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>31801-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suclose</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>30406-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmium tetroxide</td>
			<td>Nisshin EM</td>
			<td align="right">300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Una panoramica del flusso di lavoro è mostrata in Figura 1, comprese le immagini dei dispositivi. Osservazioni dal vivo di movimento di CPECs Film 1 mostra un film di CPECs isolati da un topo perinatale e film 2 mostra una vista espansa delle immagini in film 1. Va notato che i singoli suggerimenti ciliari sono meno chiari in immagini fisse rispetto a quelli in film. La Figura 2 mostra tracciamento del moto di due cilia con diverse modalità di movimento, avanti e indietro e movimenti di rotazione, dai dati riportati in Film 1 e 2. Figura 3 mostra una semplice analisi delle traiettorie del cilia, in cui la differenza di fase nelle due coordinate è evidente nel movimento di rotazione. Analisi di CPEC traiettorie punta ciliare De<html> tailed metodi per analizzare quantitativamente ciascuna traiettoria sono mostrate in Figura 4 con illustrazioni schematiche definizioni l&#39;angolo θ battito (A) e un diagramma di flusso dell&#39;analisi con risultati rappresentativi (B). Per definire l&#39;angolo θ pestaggio per traiettorie indietro e indietro, misura le posizioni della punta ciliare durante più cicli per una retta y = ax + b, e definire la direzione pestaggio come quello lungo la linea montato. Definire l&#39;angolo di battitura qui come θ = Arc tan a. Poiché spesso raccordo linea riesce ad estrarre la direzione in caso di movimento rotatorio, montare le traiettorie rotazionali ad un&#39;ellisse, e definire la direzione di quella lungo l&#39;asse maggiore dell&#39;ellisse montato. Più precisamente, le posizioni punta (x, y) durante molteplici cicli di battitura sono fissati alla funzione qui sotto. 1.jpg &quot;width =&quot; 310 &quot;/&gt; dove <img alt="Equazione 2" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52991/52991eq2.JPG" width="200" /> Il raccordo ellisse prevede cinque parametri di adattamento: x 0, y 0, a, b, e θ. I - x ed y coordinate -spatial del centro dell&#39;ellisse sono x 0 e y 0, rispettivamente. I raggi maggiore e minore dell&#39;ellisse sono A e B, rispettivamente. Angolo θ è l&#39;angolo che l&#39;asse maggiore fa con l&#39;asse x, o l&#39;angolo di battitura. Una rappresentazione schematica di questi parametri è mostrato nel pannello di destra della Figura 4A. Il montaggio viene effettuato utilizzando software Igor Pro definendo la funzione esplicita sopra descritta. Poi, un istogramma di battere l&#39;angolo θ per tutte le cilia osservared nella stessa cella viene tracciata come un istogramma circolare (figura 2 in Narita et al. 8). La frequenza è normalizzata al numero di punte ciliari analizzati. Va notato che ogni cilium è interpretato avere due θ valori nell&#39;istogramma circolare, ad esempio π / 4 e 3π / 4, portando ad una distribuzione simmetrica della direzione. Per definire generalizzata proporzioni AR, le posizioni della punta ciliare durante cicli multipli vengono ruotate di - θ (Figura 4B). Secondo la rotazione, sia avanti e indietro e traiettorie di rotazione diventano distribuiti approssimativamente parallelo alla asse x, in cui la larghezza della distribuzione A e B, lungo gli assi x ed y, rispettivamente, sono definiti come mezzo di la differenza tra il valore minimo e massimo. Pertanto, questi parametri sono più rilevanti ai raggi maggiore e minore dell&#39;ellisse, ae b. AR viene quindi definito come il rapporto tra A e B by AR = B / A. Le osservazioni della coroide plesso epitelio di SEM SEM permette l&#39;osservazione della struttura superficiale ammenda di esemplari. La presenza di cilia su CPECs è confermato nel corso tempo evolutivo. L&#39;emergere di ciglia multipla su CPECs viene osservato dal giorno embrionale (E) 13, poco dopo lo sviluppo plesso coroideo inizia nei ventricoli laterali intorno E11. In questa fase, le celle sono piccole con un aspetto immaturo variabili, e le punte ciliari puntano verso varie direzioni. A E15, un ciuffo di ciglia multipla è stabilito sulla parte superiore della superficie apicale, che sono in piedi fuori dalla microvilli circostanti. Al giorno postnatale (P) 2, molte ciglia sono fissati a una posizione piegata, che riflette la motilità ciliare osservato da immagini dal vivo. A P14, la maggior parte delle cellule possiedono più cilia che sono non mobili nonché microvilli w<html> esimo una texture più fine rispetto alle fasi precedenti. Figura 5 mostra le immagini SEM di CPECs con ciglia in queste fasi. Sulla base dei film mostrato in Figura 1 e Film 1, è ovvio che le ciglia motili sono facilmente riconoscibili per l&#39;imaging dal vivo. Tuttavia, è difficile distinguere cilia non mobili mediante microscopia DIC. Di conseguenza, SEM è indispensabile per capire gli stati ciliari complessivi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52991/52991fig1.jpg" /> Figura 1:. Panoramica del flusso di lavoro (a) Microscopio stereo. (B) Microscopio invertito dotato di un dispositivo di carica (CCD) fotocamera. (C) dello schermo del computer durante l&#39;analisi. (D) Ion polverizzazione. (E) dei campioni per SEM. Microscopio elettronico (f) Scansione. Movie 1.PLOAD / 52991 / Figure_2.mov &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Movie della vista dall&#39;alto di CPECs e ciglia da un cucciolo del mouse P2 in microscopia video ad alta velocità. A causa della superficie irregolare del tessuto plesso coroideo, questa istantanea contiene . sia in-focus e gli aerei out-of-focus La zona nell&#39;area di rigore ampliato e mostrato in Movie 2 bar Scala:. 2 micron. Movie 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52991/Figure_3.mov" target="_blank">Movie della visione allargata del campione di tessuto in Movie 1.</a> Battere ciglia ha mostrato movimenti sia di rotazione o di back-e-via. Scala bar: 1 micron. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52991/52991fig4.jpg" /> Figura 2:. Ricostituzione della traiettoria di CPEC cilia dalle immagini time-lapse in Film 2 (A) Cilia con movimento avanti e indietro (in alto) e movimento di rotazione (in basso). DIC<html> immagini dai dati di film sono presentati in 50 msec intervalli (1-8, bar scala: 1 micron). La posizione della punta destinazione ciliare è indicato da una freccia. (B) Le traiettorie (linea tratteggiata) e le posizioni delle punte ciliari (cerchi colorati) mostrati nelle immagini sono sovrapposte. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52991/52991fig5.jpg" /> Figura 3:. Due modalità di movimento CPEC punta ciliare ricostituita a partire dai dati di film movimenti punta ciliare rappresentativi, movimento avanti e indietro (A) e il movimento di rotazione (B), oltre cicli multipli sono presentati come traiettorie (top, barre di scala: 0.5 micron). Andamento nel tempo della xey coordinate della posizione della punta sono tracciati, rispettivamente (al centro). Per dimostrare un sfasamento tra le due coordinate, xey coordinate sono stati normalizzati per [-1,1] e sovrapposti (in basso, le linee rosse e blu, rispettivamente). IGURA 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52991 / 52991fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 4: illustrazioni schematiche che descrivono l&#39;analisi delle traiettorie ciliari punta (A) Definizioni dell&#39;angolo θ pestaggio per avanti e indietro (pannello di sinistra) e rotazione (pannello di destra) traiettorie.. Parametri nella formula che descrive l&#39;ellisse montato, a, b, x 0, y 0, sono mostrati nel pannello di destra. (B) Diagramma di flusso dell&#39;analisi montaggio delle traiettorie per definire l&#39;angolo θ battitura e AR. I risultati effettivi degli apparecchi delle traiettorie rappresentativi sono presentati in pannelli di destra. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52991/52991fig7.jpg" /> Figura 5: Immagine SEM di ciglia. Rappresentante micrografie SEM di CPECs a E13, E15, P2 e P14. Nel corso del tempo, CPECs di maggiori dimensioni, e sviluppati microvilli e cilia sulla superficie apicale. Un ciuffo di ciglia a E13 è ancora acquisire la motilità. A P2, quando il rapporto di ciglia con motilità raggiunto il punto più alto, si osservano molte ciglia piegate. A P14, ciglia perdono motilità. Scala bar: 5 micron.

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Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

L&#39;osservazione del movimento ciliare delle cellule epiteliali del plesso coroide<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

observation-ciliary-movement-choroid-plexus-epithelial-cells-ex

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

12.1K Views.  Waseda University. In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Video: Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1). Herpes keratitis is currently the leading cause of both cornea-derived and infection-associated blindness in the developed world. Typical presentation of herpes keratitis includes infection of the corneal epithelium and sometimes the deeper corneal stroma and endothelium, leading to such permanent corneal pathologies as scarring, thinning, and opacity 1.
Corneal HSV-1 infection is traditionally studied in two types of experimental models. The in vitro model, in which cultured monolayers of corneal epithelial cells are infected in a Petri dish, offers simplicity, high level of replicability, fast experiments, and relatively low costs. On the other hand, the in vivo model, in which animals such as rabbits or mice are inoculated directly in the cornea, offers a highly sophisticated physiological system, but has higher costs, longer experiments, necessary animal care, and a greater degree of variability. 
In this video article, we provide a detailed demonstration of a new ex vivo model of corneal epithelial HSV-1 infection, which combines the strengths of both the in vitro and the in vivo models. The ex vivo model utilizes intact corneas organotypically maintained in culture and infected with HSV-1. The use of the ex vivo model allows for highly physiologically-based conclusions, yet it is rather inexpensive and requires time commitment comparable to that of the in vitro model.

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

In this video article we describe the use of a new ex vivo model of acute herpes simplex virus type I corneal epithelial infection.

Ex Vivo Modello organotipiche corneale di acuta epiteliali Herpes simplex virus di tipo I Infezione

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1).  Herpes keratitis is currently the leading ...

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Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity to normally innocuous stimuli1. Hyperalgesia and allodynia have been studied in many different rodent models of diabetes mellitus2. However, as stated by B&ouml;lcskei et al, determination of "pain" in animal models is challenging due to its subjective nature3. Moreover, the traditional methods used to determine behavioral responses to noxious thermal stimuli usually lack reproducibility and pharmacological sensitivity3. For instance, by using the hot-plate method of Ankier4, flinch, withdrawal and/or licking of either hind- and/or fore-paws is quantified as reflex latencies at constant high thermal stimuli (52-55 &deg;C). However, animals that are hyperalgesic to thermal stimulus do not reproducibly show differences in reflex latencies using those supra-threshold temperatures3,5. As the recently described method of B&ouml;lcskei et al.6, the procedures described here allows for the rapid, sensitive and reproducible determination of thermal nociceptive thresholds (TNTs) in mice and rats. The method uses slowly increasing thermal stimulus applied mostly to the skin of mouse/rat plantar surface. The method is particularly sensitive to study anti-nociception during hyperalgesic states such as PDN. The procedures described bellow are based on the ones published in detail by Alm&aacute;si et al 5 and B&ouml;lcskei et al 3. The procedures described here have been approved the Laboratory Animal Care and Use Committee (LACUC), Wright State University.

Here, we describe a rapid reliable and simple procedure to determine the lowest temperature at which rats or mice show nocifensive behavior, i.e. the thermal nociceptive threshold (TNT). This method applies a slowly increasing thermal stimulus allowing precise and reproducible estimation of TNTs with minimum, if any, stress to the animals.

Rapida determinazione della soglia termica nocicettivo in ratti diabetici

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

Ex coltura vivo di Whole, in via di sviluppo Brains Drosophila

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain proper, that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis. The tissue harvested is suitable for biochemical and physiological analysis, and the MAV has been shown to be sensitive to damage produced by amphetamine and hyperthermia 1,2. As well, the major and minor cerebral vasculatures harvested in MAV are of potentially high interest when investigating concussive types of head trauma. The MAV dissected in this presentation consists of the pial and some of the arachnoid membrane (less dura) of the meninges and the major and minor cerebral surface vasculature. The choroid plexus dissected is the structure that resides in the lateral ventricles as described by Oldfield and McKinley3,4,5,6. The methods used for harvesting these two tissues also facilitate the harvesting of regional cortical tissue devoid of meninges and larger cerebral surface vasculature, and is compatible with harvesting other brain tissues such as striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. The dissection of the two tissues takes from 5 to 10 min total. The gene expression levels for the dissected MAV and choroid plexus, as shown and described in this presentation can be found at GSE23093 (MAV) and GSE29733 (choroid plexus) at the NCBI GEO repository. This data has been, and is being, used to help further understand the functioning of the MAV and choroid plexus and how neurotoxic events such as severe hyperthermia and AMPH adversely affect their function.

This video presentation shows a method of harvesting the two most important highly vascular structures that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis.

Una descrizione visiva della dissezione del sistema vascolare di superficie cerebrale e Meningi associate, e del plesso coroide da cervello di ratto

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

acuto<em&gt; In Vivo</em&gt; Registrazioni elettrofisiologiche dei potenziali del campo locale e dell&#39;attività multi-unità dal percorso iperdirezionale nei ratti anestetizzati

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) was first discovered in the 1980s as a splice variant from the calcitonin gene. Since its discovery, its role in migraine pathophysiology has been well established, first by its potent vasodilator properties and subsequently by its presence and function as a neurotransmitter in the sensory trigeminovascular system. The migraine-provoking ability of CGRP gave support to the pharma industry to develop monoclonal antibodies and antagonists inhibiting the effect of CGRP. A new treatment paradigm has proven effective in the prophylactic treatment of migraine. One of the useful tools to further understand migraine mechanisms is the ex vivo model of CGRP release from the trigeminovascular system. It is a relatively simple method that can be used with various pharmacological tools to achieve know-how to further develop new effective migraine treatments. The present protocol describes a CGRP release model and the technique to quantify the effect of pharmacological agents on the amount of CGRP released from the trigeminovascular system in rodents. A procedure describing the experimental approach from euthanasia to the measurement of protein levels is provided. The essential isolation of the trigeminal ganglion and the trigeminal nucleus caudalis from both mice and rats and the preparation of rat dura mater are described in detail. Furthermore, representative results from both species (rats and mice) are presented. The technique is a key tool to investigate the molecular mechanisms involved in migraine pathophysiology by using various pharmacological compounds and genetically modified animals.

Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents

The present protocol describes the ex vivo calcitonin gene-related peptide (CGRP) release model and the strategy to quantify the effect of pharmacological agents on the amount of CGRP released from the trigeminovascular system in rodents.

Ex Vivo Rilascio di peptide correlato al gene della calcitonina dal sistema trigeminovascolare nei roditori

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) was first discovered in the 1980s as a splice variant from the calcitonin gene. Since its discovery, its role in ...

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. This work describes the preparation of rat sciatic nerves for ex vivo neurophysiology, including buffer preparation, animal procedures, equipment setup and neurophysiological recording. This work provides an overview of the different types of experiments possible with this method. The outlined method aims to provide 6 h of stimulation and recording on extracted peripheral nerve tissue in tightly controlled conditions for optimal consistency in results. Results obtained using this method are A-fibre compound action potentials (CAP) with peak-to-peak amplitudes in the millivolt range over the entire duration of the experiment. CAP amplitudes and shapes are consistent and reliable, making them useful to test and compare new electrodes to existing models, or the effects of interventions on the tissue, such as the use of chemicals, surgical alterations, or neuromodulatory stimulation techniques. Both conventional commercially available cuff electrodes with platinum-iridium contacts and custom-made conductive elastomer electrodes were tested and gave similar results in terms of nerve stimulus strength-duration response.

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

This protocol describes the preparation of rat whole sciatic nerve tissue for ex vivo electrophysiological stimulation and recording in an environmentally-regulated, two-compartment, perfused saline bath.

Preparazione del nervo sciatico di ratto per la neurofisiologia Ex Vivo

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...