Gli autori desiderano ringraziare Rena Bizios per i suoi preziosi commenti sul manoscritto.

Etica Dichiarazione: I topi utilizzati nel presente studio sono stati trattati in conformità con le linee guida pubblicate dal Comitato europeo per la &quot;cura e l&#39;uso di animali da laboratorio&quot; (Direttiva 2010/63 / UE e la Convenzione europea ETS 123). Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato Etico della Facoltà di Medicina Lariboisière Saint-Louis (CEEA LV / 2010-01-04). 1. Gli animali <ol><li> Utilizzare topi atimici (10 settimane). Utilizzare un numero minimo di 6 topi con difetti lasciati vuoti come gruppo di controllo negativo. </li></ol> 2. Preparazione Ponteggi <ol><li> Singenici Graft Preparazione <ol><li> Utilizzare isograft osso per riempire il difetto di fornire gruppo di controllo con un numero minimo di 6 animali. </li><li> Ottenere isografts osso di raccolta escisse osso femorale da topo appartenenti a una &quot;difetti lasciati vuoti o&quot; difetti pieni di corallo impalcatura &quot;gruppi (THè evita l&#39;uso di animali in più per raccogliere isograft osso) 11. </li><li> Lavare l&#39;osso resecato con tampone fosfato (PBS) e mantenerlo sterile umida impacco di garza. </li></ol></li><li> Coral Ponteggio Preparazione <ol><li> Utilizzare impalcatura che sono fatti di corallo naturale: Acropora sp. cubi esoscheletro corallo, 3 x 3 x 3 mm, come potenziale sostituto osseo con un minimo di 6 animali. </li><li> Intagli a mano ogni cubo corallo alla forma del cilindro (3,5 altezza; diametro di 2 mm). </li><li> Sterilizzare ogni scaffold in autoclave (121 ° C per 20 min), lavare con PBS sterile, e immerso in mezzo di coltura completo (α-MEM) per 24 ore prima dell&#39;impianto in topi. </li></ol></li></ol> 3. procedure di anestesia e l&#39;analgesia <ol><li> Fornire analgesia preventiva, 15 min prima dell&#39;anestesia, per iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,1 mg / kg di peso corporeo dell&#39;animale). </li><li> Applicare una pomata nell&#39;animaleocchi per prevenire la secchezza ogni 30 minuti mentre gli animali sono sotto anestesia. </li><li> Mettere i topi su un blocco di riscaldamento per evitare l&#39;ipotermia. </li><li> Anestesia e Analgesia durante la procedura chirurgica <ol><li> Iniettare intraperitoneale una soluzione contenente xilazina (8 mg / kg) e ketamina (100 mg / kg). </li><li> Fornire ossigeno mediante flusso-by (50 ml / min). </li><li> Conferma adeguata profondità dell&#39;anestesia dalla presenza di buon rilassamento muscolare e mancanza di risposta animale ad uno stimolo nocivo (ad es., Società punta pinch). </li><li> Iniettare per via sottocutanea di una singola dose dell&#39;enrofloxacina (0,05 mg / kg) come profilassi microbici. </li></ol></li><li> Analgesia post-operatoria <ol><li> Fornire postoperatoria mediante iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,1 mg / kg) ogni 12 ore per 3 giorni consecutivi. </li></ol></li><li> Anestesia durante le procedure diagnostiche per immagini <ol><li> Mettere i topi in un anesthetizing-box, e quindi indurre e mantenere l&#39;anestesia con circa il 4% e il 2% isoflurano in ossigeno, rispettivamente. </li><li> Conferma un&#39;adeguata profondità dell&#39;anestesia dalla buona rilassamento muscolare animale e la mancanza di movimento. </li></ol></li><li> Condizioni di recupero <ol><li> Mantenere i topi sul pad riscaldamento fino al completo recupero </li><li> Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale dopo l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. </li></ol></li><li> Condizioni post-operatorie <ol><li> Ospitare i topi separatamente durante i primi 3 giorni ospiterà i topi da 4 nelle gabbie dopo giorno 3. </li><li> Fornire acqua e adattato libitum cibo annuncio. Lasciare i topi di peso-orso, senza alcuna restrizione di attività per tutto il periodo post-operatorio. </li></ol></li></ol> 4. Procedura chirurgica:Femorale segmentale Defect Modello 11,12 <ol><li> Dopo l&#39;anestesia, inserire ogni mouse in decubito ventrale con l&#39;arto posteriore sinistra in estensione. </li><li> Scrub l&#39;arto per la chirurgia asettica utilizzando 10% di povidone iodio per 5 minuti e poi posizionare una garza sterile sotto l&#39;arto per creare una superficie sterile (un telo trasparente sterile è utilizzato per essere in grado di monitorare il movimento respiratorio durante la procedura). Si ha cura di mantenere la sterilità del campo operatorio durante la procedura. </li><li> Fare un 15 - 17 mm incisione cutanea longitudinale sulla faccia antero-laterale del femore, che si estende dal anca al giunto ginocchio. </li><li> Incidere la fascia lata, dividere il muscolo vasto laterale e muscolo bicipite femorale per esporre l&#39;intera lunghezza della diafisi femorale. Si deve usare cautela per preservare il nervo sciatico caudalmente e la capsula articolare distale (Figura 1). </li><li> Per migliorare femorale expo diafisicerto, transetto il muscolo gluteo e bicipite femorale dal 3 trocantere. </li><li> Effettuare una dissezione circolare del femore al centro della diafisi. </li><li> Applicare una titanio piastra di micro-bloccaggio a 6 buche (10 mm di lunghezza; 1,5 mm di larghezza, peso: 30 mg) sul lato femorale anteriore. NOTA: I fori della piastra, che sono conicamente incassati con una porzione cilindrica, ospitare titanio autofilettanti viti di bloccaggio (lungo 2 mm, diametro esterno 0,47 millimetri, peso: 5 mg, con superficie inferiore della vite a testa filettata per consentire il bloccaggio entro il foro della placca) che sono collegati ad uno stelo, che torce quando bloccato. </li><li> Eseguire il foro più prossimale della piastra con una punta 0,3 mm e sia la potenza del motore dedicato o potenza motrice non dedicata funzionare a 2,500 rpm a circa 500 mW 12). </li><li> Inserire la prima vite con un cacciavite dedicato e quindi bloccarla (Figura 2). NOTA: Dato che l&#39;allineamento di tegli piastra è calcolato applicando questa prima vite, è importante posizionare la piastra parallela al femore durante l&#39;inserimento della vite. </li><li> Eseguire il foro più distale della piastra in modo simile, inserire e bloccare la vite (Figura 3). </li><li> Inserire, ma non fare blocco, le altre due viti esterne. </li><li> Posizionare il filo di 0,22 millimetri Gigli vide strettamente attorno all&#39;osso in un orientamento medio-laterale e quindi inserire nelle asole della dima (Figura 4). </li><li> Inserire la dima dedicato sul gambo delle ultime due viti e applicarlo sopra la piastra (Figura 5). </li><li> Eseguire un ostectomia femorale lunga 3,5 mm metà diafisario utilizzando il Gigli ha visto sotto irrigazione (mediante soluzione isotonica salina sterile) per evitare necrosi termica. Hanno l&#39;assistente del chirurgo prendere la maschera. Avere il chirurgo applica una tensione costante costante. Fare attenzione a non groviglio il filo sega e di utilizzare al centro due terzi del filo. Evitare exmovimento processo per ottenere un taglio dritto osso (Figura 6). </li><li> Dopo la ostectomia, rimuovere la Gigli ha visto. Per evitare danni dei tessuti molli, tagliare la sega a filo vicino al osso da un lato. </li><li> Rimuovere la dima e bloccare le ultime due viti (Figura 7). </li><li> O lasciare il difetto segmentale vuoto o chirurgicamente riempirlo mettendo materiali da testare all&#39;interno del difetto. </li><li> Abbondantemente risciacquare il campo chirurgico con soluzione isotonica salina sterile. </li><li> Posizionare il muscolo vasto laterale liberamente sopra la piastra. Chiudere la fascia e piani sottocutanei utilizzando un semplice modello di sutura continua e 5,0 glycomer 631 sutura; chiudere la pelle con un semplice modello di sutura interrotta usando 4.0 glycomer 631 sutura. In alternativa, è anche possibile chiudere la pelle con colla di pelle. </li></ol> 5. In Vivo valutazioni di rigenerazione ossea <ol><li> Con i topi sotto anestesia, eseguire radiograficovalutazioni in maniera longitudinale, utilizzando sia i raggi X convenzionali (26 kV, 10 sec; 2X ingrandimento; 20 linee / mm risoluzione spaziale) e ad alta risoluzione di micro-tomografia computerizzata (μCT). </li><li> Per l&#39;analisi μCT, acquisire immagini con una risoluzione di 36 micron (50 kV e 478 mA, a 40 msec tempo di esposizione, utilizzando una di filtro 0,5 millimetri di alluminio, fase di rotazione di 0,7 °, e la rotazione tomografica di 180 °). Analizzare le immagini utilizzando il software residente. </li></ol> 6. Le valutazioni ex vivo di rigenerazione ossea <ol><li> Dieci settimane dopo l&#39;intervento, indurre l&#39;anestesia con isoflurano in ossigeno, e quindi sacrificare i topi mediante iniezione intraperitoneale di una dose eccessiva di barbiturici (1 ml di pentobarbital). </li><li> Asportare le ossa femorali, rimuovere la sovrapposizione tessuto muscolare, e fissare i campioni di ossa in paraformaldeide al 4% (pH 7,4) per quattro giorni. </li><li> Rimuovere la placca e le viti da ogni campione di osso asportati dopo paraformaldeide FIXAzione. </li><li> Ex Vivo μ Analisi CT <ol><li> Mettere ogni osso asportato e fissati in tubi di polietilene riempito con il 75% di alcol e analizzarli utilizzando ex vivo μCT. </li><li> Acquisire le immagini a 80 kV e 100 mA (tempo di esposizione di 1.000 msec, alluminio 0,5 filtro e 4 micron dimensione del pixel fotocamera (2.400 x 4.000 con una dimensione voxel di 7 micron), media quattro fotogrammi per ogni incremento di rotazione di 0,9 °. </li><li> Ricostruire le immagini in 3 dimensioni (dimensione media voxel di 13 micron) con un back-proiezione Hamming-filtrata con il software residente. </li><li> Per l&#39;analisi quantitativa della formazione ossea, utilizzare software residente per ottenere il volume di tessuto mineralizzato (soglia inferiore grigia 45 indici scala di grigi e la soglia grigio superiore 240 indici scala di grigi) in una regione determinata e coerente di interesse corrispondente al difetto. </li><li> Eseguire analisi nello stesso modo per ogni mouse con la stessa regione di interesse. </li><li> Utilizzare il test unidirezionale analisi (intervallo di confidenza - al 95% e il livello significativo con p &lt;0,05) per confrontare il tasso unione ossea e il volume di tessuto mineralizzato nella regione di interesse tra i gruppi. </li></ol></li><li> analisi istologica <ol><li> Incorpora ogni asportato e fissato osso femorale in resina di metacrilato di metile e di processo per l&#39;istologia undecalcified. </li><li> Tagliare ciascun campione osso longitudinalmente in sezione di spessore (200 micron) con un raffreddamento ad acqua sega circolare diamantata. </li><li> Macinare ogni sezione campione osseo fino a uno spessore di 100 micron, lucidare e macchiare utilizzando Stevenel macchie blu e van Gieson picrofuchsin. NOTA: Dopo la colorazione, le cellule appaiono in blu, osso in rosa, e corallo in marrone al microscopio ottico. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Auer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+animal+models+in+fracture+research:+seeking+consensus+in+optimising+both+animal+welfare+and+scientific+validity+for+appropriate+biomedical+use.">Refining animal models in fracture research: seeking consensus in optimising both animal welfare and scientific validity for appropriate biomedical use.</a> BMC Musculoskelet Disord. 8 (72), (2007).</li><li>Histing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+bone+healing+models:+standards,+tips,+and+pitfalls+results+of+a+consensus+meeting.">Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting.</a> Bone. 49 (4), 591-599 (2011).</li><li>Horner, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+bone+defect+models+for+tissue+engineering+applications:+criteria+for+choice.">Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).</li><li>Srouji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+tissue+engineering+applications:+femoral+critical+size+defect+in+immunodeficient+mice.">A model for tissue engineering applications: femoral critical size defect in immunodeficient mice.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17 (5), 597-606 (2011).</li><li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing.">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> J Orthop Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).</li><li>Harris, J. S., Bemenderfer, T. B., Wessel, A. R., Kacena, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+mouse+critical+size+defect+models+in+weight+bearing+bones.">A review of mouse critical size defect models in weight bearing bones.</a> Bone. 55 (1), 241-247 (2013).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+LockingMouseNail--a+new+implant+for+standardized+stable+osteosynthesis+in+mice.">The LockingMouseNail--a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice.</a> J. Surg. Res. 169 (2), 220-226 (2011).</li><li>Garcia, P., Histing, T., Holstein, J. H., Pohlemann, T., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femoral+non-union+models+in+the+mouse.">Femoral non-union models in the mouse.</a> Injury. 41 (10), 1093-1094 (2010).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+reliable+non-union+model+in+mice.">Development of a reliable non-union model in mice.</a> J. Surg. Res. 147 (1), 84-91 (2008).</li><li>Viateau, V., Logeart-Avramoglou, D., Guillemin, G., Petite, H., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+for+bone+tisue+enginering+purposes.">Animal Models for bone tisue enginering purposes.</a> Sourcebook of models for biomedical research. , 725-738 (2008).</li><li>Manassero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+murine+femoral+segmental+critical-sized+defect+model+stabilized+by+plate+osteosynthesis+for+bone+tissue+engineering+purposes.">A novel murine femoral segmental critical-sized defect model stabilized by plate osteosynthesis for bone tissue engineering purposes.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 19 (4), 271-280 (2013).</li><li>Matthys, R., Perren, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+fixator+for+use+in+the+mouse.">Internal fixator for use in the mouse.</a> Injury. 40 Suppl 4, S103-S109 (2009).</li><li>Becquart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia+is+the+prime+but+not+the+only+cause+of+human+multipotent+stromal+cell+death+in+tissue-engineered+constructs+in+vivo.">Ischemia is the prime but not the only cause of human multipotent stromal cell death in tissue-engineered constructs in vivo.</a> Tissue Eng. Part A. 18 (19-20), 2084-2094 (2012).</li><li>Deschepper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proangiogenic+and+prosurvival+functions+of+glucose+in+human+mesenchymal+stem+cells+upon+transplantation.">Proangiogenic and prosurvival functions of glucose in human mesenchymal stem cells upon transplantation.</a> Stem Cells. 31 (3), 526-535 (2013).</li><li>Oetgen, M. E., Merrell, G. A., Troiano, N. W., Horowitz, M. C., Kacena, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+femoral+non-union+model+in+the+mouse.">Development of a femoral non-union model in the mouse.</a> Injury. 39 (10), 1119-1126 (2008).</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+femoral+segmental+defect+model+for+bone+tissue+engineering+using+a+novel+rigid+internal+fixation+system.">A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system.</a> J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).</li><li>Zwingenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+femoral+critical-size+bone+defect+model+in+immunodeficient+mice.">Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice.</a> J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).</li><li>Cheung, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+externally+fixed+femoral+fracture+model+for+mice.">An externally fixed femoral fracture model for mice.</a> J. Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).</li><li>Claes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperhomocysteinemia+is+associated+with+impaired+fracture+healing+in+mice.">Hyperhomocysteinemia is associated with impaired fracture healing in mice.</a> Calcif. Tissue Int. 85 (1), 17-21 (2009).</li><li>Drosse, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+femoral+critical+size+defect+model+for+orthotopic+evaluation+of+bone+healing:+a+biomechanical,+veterinary+and+trauma+surgical+perspective.">Validation of a femoral critical size defect model for orthotopic evaluation of bone healing: a biomechanical, veterinary and trauma surgical perspective.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 14 (1), 79-88 (2008).</li><li>Holstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+establishment+of+defined+mouse+models+for+the+study+of+fracture+healing+and+bone+regeneration.">Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration.</a> J. Orthop. Trauma. 23 (5 Suppl), S31-S38 (2009).</li><li>Johnson, K. D., August, A., Sciadini, M. F., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+ground+cortical+autograft+as+a+bone+graft+material+in+a+new+canine+bilateral+segmental+long+bone+defect+model.">Evaluation of ground cortical autograft as a bone graft material in a new canine bilateral segmental long bone defect model.</a> J. Orthop. Trauma. 10 (1), 28-36 (1996).</li><li>Meinig, R. P., Buesing, C. M., Helm, J., Gogolewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+diaphyseal+bone+defects+using+resorbable+poly(L/DL-lactide)+and+poly(D-lactide)+membranes+in+the+Yucatan+pig+model.">Regeneration of diaphyseal bone defects using resorbable poly(L/DL-lactide) and poly(D-lactide) membranes in the Yucatan pig model.</a> J. Orthop. Trauma. 11 (8), 551-558 (1997).</li><li>Wu, J. J., Shyr, H. S., Chao, E. Y., Kelly, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+osteotomy+healing+under+external+fixation+devices+with+different+stiffness+characteristics.">Comparison of osteotomy healing under external fixation devices with different stiffness characteristics.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 66 (8), 1258-1264 (1984).</li><li>Xing, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+bilateral+femoral+large+segmental+bone+defect+mouse+model+potentially+applicable+to+basic+research+in+bone+tissue+engineering.">Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering.</a> J. Surg. Res. 192 (2), 454-463 (2014).</li><li>Manassero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Survival+and+Osteogenic+Ability+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Orthotopic+and+Ectopic+Sites+in+Mice.">Comparison of Survival and Osteogenic Ability of Human Mesenchymal Stem Cells in Orthotopic and Ectopic Sites in Mice.</a> Tissue Eng. Part A. 22 (5-6), 534-544 (2016).</li><li>Bos, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+and+tissue+reaction+to+biodegradable+poly(L-lactide)+for+use+as+internal+fixation+of+fractures:+a+study+in+rats.">Degradation of and tissue reaction to biodegradable poly(L-lactide) for use as internal fixation of fractures: a study in rats.</a> Biomaterials. 12 (1), 32-36 (1991).</li><li>Oest, M. E., Dupont, K. M., Kong, H. J., Mooney, D. J., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+scaffold+and+growth+factor-mediated+repair+of+critically+sized+bone+defects.">Quantitative assessment of scaffold and growth factor-mediated repair of critically sized bone defects.</a> J.Orthop. Res. 25 (7), 941-950 (2007).</li><li>Pihlajamaki, H., Bostman, O., Tynninen, O., Laitinen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+tissue+response+to+bioabsorbable+poly-L-lactide+and+metallic+screws:+an+experimental+study.">Long-term tissue response to bioabsorbable poly-L-lactide and metallic screws: an experimental study.</a> Bone. 39 (4), 932-937 (2006).</li><li>Rai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+platelet-rich+plasma+with+polycaprolactone-tricalcium+phosphate+scaffolds+for+segmental+bone+defect+repair.">Combination of platelet-rich plasma with polycaprolactone-tricalcium phosphate scaffolds for segmental bone defect repair.</a> J. Biomed. Mater Res. A. 81 (4), 888-899 (2007).</li><li>Komlev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+in+vivo+bone+deposition+by+bone+marrow+stromal+cells+into+porous+calcium+phosphate+scaffolds:+an+X-ray+computed+microtomography+study.">Kinetics of in vivo bone deposition by bone marrow stromal cells into porous calcium phosphate scaffolds: an X-ray computed microtomography study.</a> Tissue Eng. 12 (12), 3449-3458 (2006).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Impiantazione ectopica di materiali e dispositivi in topi ortopedici specifici è comunemente eseguita per valutare l&#39;osso formando funzioni di vari ponteggi 13,14. tuttavia esistono importanti differenze tra i modelli ectopiche e ortotopico, compresi i fattori di segnalazione osteogenic nativi e le interazioni con le cellule paracrini che formano l&#39;osso ospite. Il presente studio stabilisce un riproducibile grande segmentale murino, critico-size difetti femorale (3,5 mm, circa il 20-25% della lunghezza del femore). Considerando le dimensioni di tale difetto e la stabilità fornita dalla osteosintesi piatto risultante, questo modello imita l&#39;osso atrofica non-union clinicamente incontrato. Il periodo di tempo post-operatorio scelto nel presente studio, è in linea con i topi modelli non sindacali precedentemente descritti, mostrando una mancanza di un&#39;adeguata guarigione dopo 8 a 12 settimane 4,9,15,16. Ancora più importante, reproducible e stabile osteosintesi, nonché stabilità dei sostituti ossei impiantati sono stati ottenuti senza morbilità e mortalità 1,2 con l&#39;uso di entrambe piastra di bloccaggio e una maschera per eseguire l&#39;osteotomia. Questo risultato contrasta anche i risultati riportati in cui sia un fissatore esterno o un chiodo endomidollare sono stati utilizzati 4,5,17-24. Per i fissatori esterni potenziali svantaggi includono: variabilità in rigidità, infezioni delle vie perni, allentando i perni, potenziali lesioni dovute ai perni e il peso dei materiali (da 4 a 20% del peso corporeo del mouse). Per il chiodo endomidollare potenziali svantaggi includono: riempimento della cavità midollare con il chiodo e danni iatrogeni delle superfici articolari. Altri murino segmentale, critica size difetti femorali stabilizzate mediante piastra osteosintesi sono state descritte con difetto osseo creato da una fresa e da 1,5 a 2 mm di lunghezza 16,25. in the presente modello, l&#39;uso di una maschera e un filo sega permesso una precisa osteotomia 3,5 millimetri a lungo senza muscoli significativi traumi. Tuttavia, per riuscire a eseguire la procedura si dovrebbe prendere in considerazione alcuni punti chiave: non utilizzare piccolo topo (topi nudi o con un peso di meno di 25 grammi o di età inferiore a 8 settimane) altrimenti il ​​piatto dovrebbe essere troppo lungo. Quando si avvicina l&#39;osso femorale, fare attenzione a preservare sia il nervo sciatico caudalmente e la capsula articolare distale. Applicare la piastra sul lato anteriore dell&#39;osso femorale e poiché l&#39;allineamento della piastra è calcolato applicando questa prima vite, avere cura di posizionare la piastra parallela al femore durante l&#39;inserimento questa prima vite. Prima di effettuare il ostectomia, aver cura di effettuare una dissezione circolare del femore al centro della diafisi per evitare traumi muscolari. Quando si esegue l&#39;osteotomia, l&#39;assistente del chirurgo deve tenere saldamente la guida e il surgeon deve essere attento (i) non aggrovigliare il filo sega, (ii) utilizzare mezzo due terzi del filo durante l&#39;applicazione di una tensione costante costante, e (iii) per evitare il movimento in eccesso per ottenere un taglio dritto osso. guarigione ossea è possibile nella presente modello fornito un innesto osseo viene utilizzato. Inoltre, questo modello consente ulteriori studi dei meccanismi coinvolti nelle strategie di sostituzione delle ossa quando sia innesti o cellule umane di origine vengono utilizzati in un ben standardizzata grande, segmentale, difetti, osso. Inoltre, in linea alle tendenze attuali che richiedono la raffinatezza e la riduzione di utilizzo di animali nella ricerca ortopedia legati, questo modello può essere utilizzato in combinazione con in vivo tecniche di imaging come la bioluminescenza. Tali tecniche non invasive permettono di monitorare sia la sopravvivenza delle cellule impiantate e la guarigione dei tessuti senza richiedere il sacrificio di animali 26. Le principali limitazioni del presente modello sono sia lacondizioni portanti e il volume del difetto osseo creato perché non imitano completamente quelli incontrati clinicamente nell&#39;uomo. Le limitazioni del modello sono (i) la radio-opacità del piatto che può richiedere la rimozione della piastra prima ex vivo μCT analisi e possono complicare l&#39;interpretazione dei longitudinali risultati degli esami radiografici e, (ii) l&#39;impossibilità di modulare piastra rigidezza può essere un parametro chiave meccanica nella formazione dell&#39;osso 27-30. Si deve tenere a mente anche, quando si utilizza isograft osso o altre impalcature che contengono una componente minerale (in particolare carbonato di calcio), che alcuni pregiudizi vengono introdotti nel processo di segmentazione delle analisi micro-CT, perché la densità ossea di nuova costituzione in parte sovrapposto con sia la densità isograft o densità patibolo. Per questo motivo il volume osseo ottenere dall&#39;analisi micro-CT sono relativi principalmente il volume del tessuto mineralizzato (osso neoformato piùsostituto osseo) 11,26,31.

Massive difetti ossei diafisarie sono una grande sfida per il chirurgo ortopedico. la sostituzione ossea con innesto osseo autologo, attualmente considerato come il trattamento gold-standard, è in quantità limitata ed è associata a morbidità raccolta legate. Per queste ragioni, costrutti osso tissutale, che conciliano cellule staminali mesenchimali del midollo osseo con ponteggi osteoconduttive sono stati esplorati come alternativa per autotrapianti in chirurgia ortopedica. Fino ad oggi, la maggior parte degli studi sono stati condotti in modelli animali clinicamente rilevanti, quali cani, maiali e pecore 1-3, ma la valutazione preliminare di questi costrutti in ortotopico, segmentale, difetti ossei critico-size in modelli animali di piccola (come topi) potrebbe avere diversi vantaggi: (i) le spese basse, (ii) un gran numero di animali possono essere azionati; (Iii) in contrasto con grandi modelli animali, omogeneità dei ceppi di topi limita variazioni individuali scaffold riassorbimento unND formazione ossea e; (Iv) soprattutto, la disponibilità di anticorpi specifici e animali gene targeting consentono la valutazione del processo biologico coinvolto nella guarigione ossea. Ultimo ma non meno importante, l&#39;uso di ceppi di topi immunodeficienti consente anche studi usando sia innesti o cellule di origine umana senza risposte immunitarie avverse nei topi. Nonostante i vantaggi di cui sopra, enormi modelli difetto osseo diafisarie nei topi sono scarsi. La maggior parte di tali modelli utilizzano fissaggio osseo con un perno intramidollare che riempie la cavità del midollo osseo (limitando così il volume di materiale da testare) e ostacola anche la riproducibilità non fornendo rotazione ed assiale stabilità 2,4-7. Gli obiettivi di questo studio sono: (i) simulando una situazione di non-union ossa clinica, per descrivere un riproducibili, critica-size, segmentale, modello di difetto femorale in topi, che è stabilizzata da accurate e riproducibili osteosynth bloccaggio a lamelleESIS che fornisce un ambiente biomeccanico altamente stabile 8-10; (Ii) illustrare il modello presente con due potenziali sostituti ossei e descrivere analisi formazione ossea che potrebbe essere utilizzato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">&#945;-MEM , Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, France</td>
			<td style="width:119px;">M4526</td>
			<td style="width:167px;">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acropora sp. coral exoskeleton cubes, Biocoral&#174;</td>
			<td>Biocoral&#174;, Inoteb, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3x3x3 mm cubes, autoclaving (121&#176;C for 20 min) sterilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buprenorphine, Buprecare&#174;</td>
			<td>Axience, Pantin, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.3 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine, Rompun&#174; 2%</td>
			<td colspan="2">Bayer HealthCare, Puteaux, France</td>
			<td>20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine, Ketamine 500&#174;</td>
			<td>Virbac, Carros, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane, For&#232;ne&#174;</td>
			<td>Abbott, Arcueil, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Enrofloxacine, Baytril&#174; 5%</td>
			<td colspan="2">Bayer HealthCare, Puteaux, France</td>
			<td>50 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pentobarbital, Dolethal&#174;&#160;</td>
			<td>V&#233;toquinol, Lure, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>182,2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anesthetizing box</td>
			<td>Ugo Basile, Gemonio, Italy</td>
			<td style="width:119px;">7900/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic transparent sterile drape, BusterOpCover 30*45cm</td>
			<td>Buster, Coveto, Montagu, France</td>
			<td style="width:119px;">613867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% povidone iodine, V&#233;t&#233;dine&#174; Solution</td>
			<td style="width:191px;">V&#233;toquinol, Lure, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Titanium micro- locking plate, MouseFix Plate XL</td>
			<td>RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/</td>
			<td style="width:119px;">RIS.401.120</td>
			<td>6 holes, 10 mm long and 1.5 mm wide, autoclaving (121&#176;C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.3 mm drill bit, Drill Bit 0.30 mm</td>
			<td>RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/</td>
			<td style="width:119px;">RIS.592.200</td>
			<td>autoclaving (121&#176;C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Engine power</td>
			<td>RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/</td>
			<td style="width:119px;">AccuPen</td>
			<td>Cold sterilzation (ethylene oxide)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Screw driver, Handrill</td>
			<td>RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/</td>
			<td style="width:119px;">RIS.390.130</td>
			<td>autoclaving (121&#176;C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Self-tapping locking screws, MouseFix Screw 2 mm</td>
			<td>RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/</td>
			<td style="width:119px;">RIS.401.100</td>
			<td>2 mm long, 0.47 mm outer diameter and 0.34 mm core diameter, autoclaving (121&#176;C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Jig,MouseFix XL Drill and Saw Guide</td>
			<td>RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/</td>
			<td style="width:119px;">RIS.301.103</td>
			<td>3.5 mm between the slots, autoclaving (121&#176;C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22-mm Gigli saws (0.22 mm Saws)</td>
			<td colspan="2">RISystem AG, Davos, Switzerland</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">5.0 glycomer 631, Biosyn</td>
			<td style="width:191px;">Covidien, V&#233;toquinol, Lure, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tapper-cut needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">4.0 glycomer 631, Biosyn</td>
			<td style="width:191px;">Covidien, V&#233;toquinol, Lure, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tapper-cut needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Xray, MX20</td>
			<td colspan="3">Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">in vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1176</td>
			<td colspan="2">Skyscan, Aartselaar, Belgium</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Ex vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1172</td>
			<td colspan="2">Skyscan, Aartselaar, Belgium</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Resident software: Nrecon(v1.6.9)/Ctan(v.1.14.4)</td>
			<td colspan="2">Skyscan, Aartselaar, Belgium</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of a segmental femoral critical-size defect model in mice stabilized by plate osteosynthesis

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold. 
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.

Le suddette procedure chirurgiche durate dal 45 a 60 min. Ostectomia e osteosintesi erano facili da eseguire con l&#39;aiuto di assistente di un chirurgo ma senza usare alcun sistema di ingrandimento. Non si sono verificate complicanze intraoperatorie. In uno studio preliminare su 18 topi 11, radiografie postoperatorie fornito prove che la lunghezza difetto osseo (3,43 ± 0,12 millimetri) e il posizionamento piastra (distanza tra la cavità articolare soffocare e la parte distale della piastra = 2,65 ± 0,56 millimetri) erano riproducibili. Il tasso di mortalità correlata all&#39;anestesia era di circa il 5%. Il recupero funzionale dell&#39;arto operato era eccellente in tutti gli animali e pieno portante è stata osservata entro un giorno dopo l&#39;intervento chirurgico (Animated Figura 1). Il peso del osteosintesi (placca e viti) utilizzato nella pstudio resent era circa 0,1% del peso corporeo mouse. Non ci sono complicanze postoperatorie (ad esempio, infezione della ferita, fallimento dell&#39;impianto, migrazione innesto osseo, ecc) si sono verificati. No autolesionismo o lesioni causate da cagemates si è verificato. Quando i difetti ossei chirurgicamente indotte sono stati lasciati vuoti, senza significativa formazione ossea è stata osservata con l&#39;osso coerente non-union. Al contrario, quando i difetti sono stati riempiti sia con un isograft o uno scaffold di corallo, osso neoformato estende dal bordo prossimale e distale dell&#39;osso è stato osservato. Inoltre, considerando che la formazione ossea permesso ripristino della continuità ossea in molte difetti trattati con isografts (figura 8), è stato osservato solo all&#39;interno del ponteggio corallo difetti riempiti con questo materiale. Infatti, nessun osso è stata osservata una distanza superiore a 1 mm dai bordi ossei. Assenza di cartilagine in tutta istologico analizza i risultati forniti prova dellastabilità del osteosintesi raggiunto (Figura 9, Figura 10). Le radiografie e microCT analisi fornite prove del fatto che l&#39;unione delle ossa non si è verificato in tutti gli animali del gruppo di difetto di-sinistra-vuoto, 10 settimane dopo l&#39;impianto. Il volume di tessuto mineralizzato valutati da analisi microCT era 0,8 ± 0,3 mm 3 ed è stato rappresentante del-tessuto osseo formatosi di recente. Nei gruppi impalcatura isograft e corallo, l&#39;unione delle ossa è stato ottenuto in 4 e 4 animali, rispettivamente. Il volume di tessuto mineralizzato valutati da analisi microCT era 4.4 ± 0.9 mm 3 e 8.9 ± 0.7 mm 3. In questi gruppi, tuttavia, perché sia ​​la isograft e il patibolo coralli contenevano minerali, formazione di nuovo osso non poteva essere veramente distinto dal materiale impiantato restante (isograft o impalcatura di corallo). Sia il tasso di unione bon e il volume del tessuto mineralizzato ottenuto dal gruppo isograft edal gruppo scaffold corallo erano significativamente (p &lt;0,001) superiori a quelli ottenuti dal gruppo difetto-sinistra-vuoto. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52940/52940fig1.jpg" /> Figura 1:. L&#39;esposizione chirurgica per la creazione della femorale segmentale Defect A 15 - 17 mm incisione cutanea longitudinale, che si estende dal anca al giunto ginocchio, è stata fatta sulla faccia antero-laterale del femore. La fascia lata è stato inciso; il muscolo vasto laterale e muscolo bicipite femorale sono stati divisi per esporre l&#39;intera lunghezza della diafisi femorale. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52940/52940fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/52940/52940fig2.jpg" /> Figura 2: PiastraPosizionamento e prossimale vite Placement. La targa è stata applicata sul lato femorale anteriore. Il foro più prossimale della placca è stato perforato; la prima vite è stato inserito e, quindi, chiusa a chiave. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52940/52940fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52940/52940fig3.jpg" /> Figura 3:. Distal Screw Placement Il foro più distale della placca è stato perforato e la vite è stato inserito e bloccato. (Ristampato con il permesso di tessuto Eng parte C 2013, 19 (4), 271-280) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52940/52940fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52940/52940fig4.jpg" /> Figura 4: </strong&gt; Gigli Sega di posizionamento. Gli altri due viti esterne sono state inserite ma non bloccate e il filo dei 0,22 mm seghe Gigli era legata stretta intorno all&#39;osso in un orientamento medio-laterale. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52940/52940fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52940/52940fig5.jpg" /> Figura 5: La maschera di posizionamento La maschera è stato inserito sullo stelo degli ultimi due viti e applicato sopra la piastra e il filo della lama è stata quindi inserita nelle scanalature della dima.. (Ristampato con il permesso di tessuto Eng parte C 2013, 19 (4), 271-280) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52940/52940fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt= &quot;Figura 6&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52940 / 52940fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6:. Osteotomia ostectomia è stata eseguita e la sega Gigli è stata ritirata. (Ristampato con il permesso di tessuto Eng parte C 2013, 19 (4), 271-280) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52940/52940fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52940/52940fig7.jpg" /> Figura 7:. Viti interne Chiusura La maschera è stata rimossa e le ultime due viti bloccato. I difetti segmentale erano poi o lasciati vuoti o riempiti con i materiali testati. (Ristampato con il permesso di tessuto Eng parte C 2013, 19 (4), 271-280) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52940/52940fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img al<html> t = &quot;Figura 8&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52940 / 52940fig8.jpg&quot; /&gt; Figura 8: Rappresentante postoperatoria radiografie e sagittale μCT ricostruzione dell&#39;osso femorale di topi osso femorale con il rispettivo difetto sia lasciato vuoto (AE), o pieni di enorme osso singenici trapianto (FJ), o pieni di enormi ponteggi corallo Acropora (KO. ); immediatamente dopo l&#39;intervento (A, F, K), 4 settimane dopo l&#39;intervento (B, G, L), 6 settimane dopo l&#39;intervento (C, H, M), e 10 settimane dopo l&#39;intervento (D, E, I, J, N , O) (lamiere di lunghezza = 10 mm). (Ristampato con il permesso di tessuto Eng parte C 2013, 19 (4), 271-280) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52940/52940fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> file / ftp_upload / 52940 / 52940fig9.jpg &quot;/&gt; . Figura 9: Rappresentante Radiografia, μCT Ricostruzione e Istologia di un difetto Riempito con il corallo Patibolo Testato nel presente studio Una grande quantità di osso neoformato è stata osservata in-tra le circostanti bordi ossee e l&#39;impalcatura del corallo; in contrasto, piccolo osso era presente all&#39;interno del ponteggio. Macchie: Stevenel blu e von Gieson picrofuchsin. In queste condizioni, l&#39;osso, le cellule, e corallo macchiate di rosso, blu e marrone, rispettivamente. Barra di scala = 500 micron. ACS = Acropora patibolo corallo; BN = osso. (Ristampato con il permesso di tessuto Eng parte C 2013, 19 (4), 271-280) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52940/52940fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52940/52940fig10.jpg" /> Figura 10: rappre<html> presentante Istologia di un difetto lasciato vuoto (A), pieno di Massive singenici innesto osseo (B), e riempito di corallo Scaffold (C). In difetto lasciato vuoto, l&#39;arrotondamento del ossea bordi con ripieno canale midollare e abbondante tessuto fibroso profondo in difetto sono stati osservati. In difetto riempito con enorme innesto osseo singenici, è stata osservata una continuità ossea tra il trapianto e le circostanti bordi ossei; midollo osseo era presente in tutta la cavità originaria. In difetto pieno di impalcatura corallo, è stata osservata osso neoformato tra le circostanti bordi ossee e il patibolo corallo, ma poco osso era presente all&#39;interno del patibolo. Macchie: Stevenel blu e von Gieson picrofuchsin. In queste condizioni, l&#39;osso, le cellule, e corallo macchiate di rosso, blu e marrone, rispettivamente. Barra di scala = 500 mm. ACS, impalcatura di corallo; BN, osso; BM, del midollo osseo; FT, tessuto fibroso. (Ristampato con il permesso dal tessuto Eng parte C 2013, 19 (4), 271-280)OAD / 52940 / 52940fig10large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura animata 11" src="/files/ftp_upload/52940/52940animfig1.jpg" /> Animato / video Figura 1: il video rappresentante l&#39;andatura di un mouse a un post-operatorio giorno. Peso è stata osservata cuscinetto. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52940/Animated_Figure1.MOV" target="_blank">Cliccate qui per vedere il video.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis at JoVE.com

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.

Istituzione di un segmentale femorale critico-size difetto del modello in topi stabilizzati da osteosintesi Piastra

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

establishment-segmental-femoral-critical-size-defect-model-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.0K Views.  Université Paris Diderot. Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.

Video: Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Istituzione e Propagazione dei Tumori retinoblastoma umani in topi privi di sistema immunitario

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Ricerca

Medicina

Adjustable Stiffness, External Fixator for the Rat Femur Osteotomy and Segmental Bone Defect Models

The mechanical environment around the healing of broken bone is very important as it determines the way the fracture will heal. Over the past decade there has been great clinical interest in improving bone healing by altering the mechanical environment through the fixation stability around the lesion. One constraint of preclinical animal research in this area is the lack of experimental control over the local mechanical environment within a large segmental defect as well as osteotomies as they heal. In this paper we report on the design and use of an external fixator to study the healing of large segmental bone defects or osteotomies. This device not only allows for controlled axial stiffness on the bone lesion as it heals, but it also enables the change of stiffness during the healing process in vivo. The conducted experiments have shown that the fixators were able to maintain a 5 mm femoral defect gap in rats in vivo during unrestricted cage activity for at least 8 weeks. Likewise, we observed no distortion or infections, including pin infections during the entire healing period. These results demonstrate that our newly developed external fixator was able to achieve reproducible and standardized stabilization, and the alteration of the mechanical environment of in vivo rat large bone defects and various size osteotomies. This confirms that the external fixation device is well suited for preclinical research investigations using a rat model in the field of bone regeneration and repair.

One constraint of preclinical research in the field of bone repair is the lack of experimental control over the local mechanical environment within a healing bone lesion. We report the design and use of an external fixator for bone repair with the ability to change fixator stiffness in vivo.

Rigidità regolabile, fissatore esterno per le Rat Femore osteotomia e segmentale Bone Difetto Models

The mechanical environment around the healing of broken bone is very important as it determines the way the fracture will heal. Over the past decade there ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Femorale aspirazione del midollo osseo in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Un semplice Critical dimensioni femorale Difetto Modello in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

A Murine Model of Arterial Restenosis: Technical Aspects of Femoral Wire Injury

Cardiovascular disease caused by atherosclerosis is the leading cause of death in the developed world. Narrowing of the vessel lumen, due to atherosclerotic plaque development or the rupturing of established plaques, interrupts normal blood flow leading to various morbidities such as myocardial infarction and stroke. In the clinic endovascular procedures such as angioplasty are commonly performed to reopen the lumen. However, these treatments inevitably damage the vessel wall as well as the vascular endothelium, triggering an excessive healing response and the development of a neointimal plaque that extends into the lumen causing vessel restenosis (re-narrowing). Restenosis remains a major cause of failure of endovascular treatments for atherosclerosis. Thus, preclinical animal models of restenosis are vitally important for investigating the pathophysiological mechanisms as well as translational approaches to vascular interventions. Among several murine experimental models, femoral artery wire injury is widely accepted as the most suitable for studies of post-angioplasty restenosis because it closely resembles the angioplasty procedure that injures both endothelium and vessel wall. However, many researchers have difficulty utilizing this model due to its high degree of technical difficulty. This is primarily because a metal wire needs to be inserted into the femoral artery, which is approximately three times thinner than the wire, to generate sufficient injury to induce prominent neointima. Here, we describe the essential surgical details to effectively overcome the major technical difficulties of this model. By following the presented procedures, performing the mouse femoral artery wire injury becomes easier. Once familiarized, the whole procedure can be completed within 20 min.

The mouse femoral artery wire injury model of restenosis is technically challenging. In this protocol we show the key technical details essential for successfully performing wire injury to induce consistent&#160;neointima for studies of restenosis.

Un modello murino di restenosi arteriosa: aspetti tecnici del femore Wire Injury

Cardiovascular disease caused by atherosclerosis is the leading cause of death in the developed world. Narrowing of the vessel lumen, due to ...

A Rat Tibial Growth Plate Injury Model to Characterize Repair Mechanisms and Evaluate Growth Plate Regeneration Strategies

A third of all pediatric fractures involve the growth plate and can result in impaired bone growth. The growth plate (or physis) is cartilage tissue found at the end of all long bones in children that is responsible for longitudinal bone growth. Once damaged, cartilage tissue within the growth plate can undergo premature ossification and lead to unwanted bony repair tissue, which forms a "bony bar." In some cases, this bony bar can result in bone growth deformities, such as angular deformities, or it can completely halt longitudinal bone growth. There is currently no clinical treatment that can fully repair an injured growth plate. Using an animal model of growth plate injury to better understand the mechanisms underlying bony bar formation and to identify ways to inhibit it is a great opportunity to develop better treatments for growth plate injuries. This protocol describes how to disrupt the rat proximal tibial growth plate using a drill-hole defect. This small animal model reliably produces a bony bar and can result in growth deformities similar to those seen in children. This model allows for investigation into the molecular mechanisms of bony bar formation and serves as a means to test potential treatment options for growth plate injuries.

The growth plate is a cartilaginous region in children's long bones where longitudinal growth occurs. When injured, bony tissue can form and impair growth. We describe a rat model of growth plate injury that leads to bony repair tissue, allowing the study of repair mechanisms and growth plate regeneration strategies.

Un modello di lesione della tibia di crescita del ratto per caratterizzare i meccanismi di riparazione e valutare le strategie di rigenerazione delle piastre di crescita

A third of all pediatric fractures involve the growth plate and can result in impaired bone growth. The growth plate (or physis) is cartilage tissue found ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies that promote efficient bone healing are non-existent and in high demand. Effective and reproducible animal models of fractures healing are needed to understand the complex biological processes associated with bone regeneration. Many animal models of fracture healing have been generated over the years; however, murine fracture models have recently emerged as powerful tools to study bone healing. A variety of open and closed models have been developed, but the closed femoral fracture model stands out as a simple method for generating rapid and reproducible results in a physiologically relevant manner. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice and facilitate a post-fracture stabilization of the femur by inserting an intramedullary steel rod. Although devices such as a nail or a screw offer greater axial and rotational stability, the use of an intramedullary rod provides a sufficient stabilization for consistent healing outcomes without producing new defects in the bone tissue or damaging nearby soft tissue. Radiographic imaging is used to monitor the progression of callus formation, bony union, and subsequent remodeling of the bony callus. Bone healing outcomes are typically associated with the strength of the healed bone and measured with torsional testing. Still, understanding the early cellular and molecular events associated with fracture repair is critical in the study of bone tissue regeneration. The closed femoral fracture model in mice with intramedullary fixation serves as an attractive platform to study bone fracture healing and evaluate therapeutic strategies to accelerate healing.

The murine closed femoral fracture model is a powerful platform to study fracture healing and novel therapeutic strategies to accelerate bone regeneration. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice using an intramedullary steel rod to stabilize the femur.

La generazione delle fratture chiuse femorale in topi: un modello per studiare la guarigione ossea

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Un modello del Glaucoma indotto da sutura Circumlimbal nei ratti e nei topi

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

Istituzione di un modello di occhio secco severo utilizzando la dacrigofectomia completa nei conigli

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

Una lesione segmentale del palloncino segmentale controllato dalla pressione carotide del ratto con applicazione terapeutica periadventitiale

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...