The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).

Tutte le procedure di manipolazione e di trattamento del mouse dovrebbero aderire alle regole stabilite dai programmi legislatore e / o la cura degli animali e approvati da un comitato di cura degli animali locale. Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del Consiglio canadese cura degli animali, con l&#39;approvazione del comitato di cura degli animali locale. ATTENZIONE: Tutti i lavori con la radioattività (tra cui, ma non solo, il trattamento del trizio, γ-irradiazione esterna, la gestione tessuti animali radioattivi, rifiuti biancheria da letto) deve rispettare le regole stabilite dalle autorità legislatore e / o di protezione dalle radiazioni ed è realizzato da personale autorizzato personale in un laboratorio e / o struttura certificata. 1. Lavoro Animal <ol><li> Raggruppamento degli animali <ol><li> Se i topi sono in arrivo da un organismo esterno, acclimatarsi animali per almeno 10 giorni nella struttura degli animali. Se lo studio include più gruppi di trattamento, in modo che il fornitore di animali in grado di inviare alanimali l come un unico lotto. </li><li> Casualmente allocare topi per gruppi di trattamento di 10 topi per gruppo. Se si utilizzano topi maschi del ceppo C57BL / 6, hanno il fornitore di animali pre-organizzare la randomizzazione di giovanissimi C57BL / 6 maschi nella loro struttura per attenuare i problemi di aggressione. </li></ol></li><li> L&#39;esposizione cronica di topi su Internal β-Radiation <ol><li> Preparare le concentrazioni di lavoro di trizio (10 kBq / L e 1 MBq / L) in acqua potabile del mouse diluendo lo stock originale di HTO e OBT (una miscela di prolina triziata, alanina e glicina acidi amminoacidi) soluzioni. </li><li> Convalidare le concentrazioni finali di trizio nell&#39;acqua potabile misurando la radioattività utilizzando un contatore a scintillazione liquida. Regolare concentrazioni, se necessario. </li><li> Trattare gli animali per un mese, fornendo l&#39;accesso ad libitum all&#39;acqua trizio. Se l&#39;acqua si sta scaricando il trattamento durante il periodo di due settimane, aggiungere più acqua. Altrimenti, modificare bottiglie a due settimane. </li><li> Trattare sham-irradiati controllotopi identico. Tenerli in una stanza separata &quot;pulito&quot; o su un telaio di montaggio &quot;pulito&quot; sotto pressione positiva per evitare trizio contaminazioni dall&#39;aria. </li></ol></li><li> L&#39;esposizione cronica di topi a γ-radiazioni esterne Nota: impianto γ-irraggiamento / attrezzatura varia a seconda della posizione. </li><li> Utilizzando metodi disponibili di dosimetria, determinare le distanze da una fonte γ-radiazioni che hanno campi di radiazione che producono le dosi desiderate. Garantire l&#39;omogeneità dei campi di radiazione all&#39;interno delle aree che coprono le gabbie per gli animali. Nota: 1,7 Gy / h è equivalente ad una dose prodotto da 1 MBq / L trizio nel corpo. </li><li> Esporre topi collocando gabbie topo alle distanze determinati nella fase 1.3.1 per un mese. Minimizzare interruzione giornaliera di γ-irradiazione a 30 min. Utilizzare dosimetri a termoluminescenza per misurare totale dosi assorbite. </li></ol> 2. Sacrifici e campionamento <ol&gt; <li> Preparare strumenti chirurgici sterili, 60 millimetri piastre di Petri con inseriti filtri di cellule di 70 micron, 15 ml e provette da 1,5 ml, i media RPMI integrato con siero fetale bovino 5% (FBS) e posto tutto all&#39;interno di un armadio di sicurezza biologica. Garantire la sterilità del lavoro è cruciale. </li><li> Dispensare 5 ml di media RPMI in ogni 60 millimetri Petri. </li><li> Sacrifica topo, utilizzando un metodo approvato dal comitato cura degli animali locale. Dislocazione cervicale è una buona scelta per il lavoro splenocyte descritto in questo protocollo. Tuttavia, se sono necessari campioni di sangue per gli altri test (ad esempio, per la mFISH, il micronucleo blocco citocalasina o altri dosaggi genetoxicity comune), utilizzare la puntura intra-cardiaca dopo l&#39;anestesia con isoflurano. </li><li> Posto l&#39;animale in decubito dorsale, con la testa rivolta lontano da voi. Spruzzare il mouse verso il basso con il 70% di etanolo. Utilizzando pinze, afferrare la pelle anteriormente all&#39;apertura uretrale e fare una piccola incisione con le forbici nella regione perineale. <ol&gt; <li> Da questa incisione, tagliare lungo la linea mediana ventrale alla cavità toracica, facendo attenzione a tagliare solo la pelle e non il muro muscolo sotto. Sezionare la pelle di distanza dalla linea mediana. </li><li> Afferrare la parete addominale con una pinza e tagliare lungo l&#39;asse mediano della parete muscolare per aprire la cavità addominale. </li></ol></li><li> Accise la milza con una leggera presa con una pinza sterile e delicatamente tirando su di esso e contemporaneamente tagliando via il tessuto connettivo con le forbici. </li><li> Tagliare un piccolo pezzo della milza (circa 1/10 della milza) e posto in una provetta da 1,5 ml. Snap congelare in azoto liquido per la successiva conservazione a -80 ° C per saggi supplementari. </li><li> Mettere il resto della milza in un colino cella all&#39;interno una capsula di Petri 60 mm Con 5 ml di mezzi già erogato RPMI. </li><li> Procedere alla prossima mouse. Nota: Estratto milze possono essere tenuti in 60 millimetri piatti con supporti (fino a 2 ore), mentre il resto dei topi sono Sacrificed. A seconda del numero di persone che partecipano, tra 5 e 15 topi possono essere elaborati in un giorno. </li></ol> 3. Preparazione delle Culture splenocyte <ol><li> Omogeneizzare la milza tritando dentro un colino cella con una pinza sterile con una estremità ricurva. </li><li> Rimuovere il filtro cellulare e raccogliere la sospensione cellulare filtrato dalla parabola di 60 mm nel tubo 15 ml. </li><li> Risciacquare il filtro cellule con 5 ml di media per raccogliere il resto delle cellule. </li><li> Tubi centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Decantare il surnatante e risospendere pellet in 10 ml di RPMI. </li><li> Tubi centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Decantare il surnatante e risospendere pellet in 5 ml di RPMI. </li><li> Trasferimento 4 ml di sospensione cellulare in un pallone di coltura tissutale da 25 ml e trasportarlo in un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% CO 2, 80% di umidità) </li></ol> 4. Sfidare irradiazione e di fissaggio <ol><li> Trasferire ilrestante 1 ml di sospensione cellulare dal punto 3.8 in una provetta da 1,5 ml su ghiaccio e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Danno al DNA misurata in questo campione rappresentare sia un danno indotto dal trattamento e t = 0 dati punti per la costruzione di una curva di riparazione del DNA. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante utilizzando una pompa a vuoto. Delicatamente risospendere pellet in 1 ml di tampone TBS (20 mM Tris pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 2,7 mM). </li><li> Provette per centrifuga a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Con attenzione aspirare il surnatante utilizzando una pompa a vuoto. Delicatamente risospendere pellet in 300 ml di TBS. </li><li> Mentre miscelazione su un vortex a bassa velocità, aggiungere 700 ml di -20 ° C 100% di etanolo. Chiudere il coperchio e capovolgere un paio di volte per mescolare. </li><li> Conservare i campioni a -20 ° C. Splenociti fissati in etanolo possono essere conservati a -20 ° C per almeno 12 mesi senza alcuna perdita evidente nel segnale γH2AX. </li><li> Irradiare la cultura splenocyte dal punto 3.8 con un impegnativo γ-rad<html> Dose iation di 2 Gy in un dosaggio ≥ 200 mGy / min utilizzando disponibili dispositivo di irradiazione. Nota: Lo scopo di questo irradiazione è indurre DSB DNA per tentare la riparazione macchinari. I raggi X possono anche essere utilizzati per questo scopo. </li><li> Restituire immediatamente le culture per un incubatore CO 2. </li><li> 1 ora dopo la sfida 2 Gy di irradiazione, rimuovere le culture dal termostato di una cappa di sicurezza biologica. Per raccogliere un campione rappresentativo un&#39;aliquota, delicatamente risospendere cellule usando una pipetta e trasferire 1 ml di sospensione cellulare in una provetta da 1,5 ml su ghiaccio. Riportare le colture cellulari di un incubatore CO 2. </li><li> Provette per centrifuga a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Con attenzione aspirare il surnatante utilizzando una pompa a vuoto. Delicatamente risospendere pellet in 1 ml di TBS. </li><li> Ripetere i passaggi 4,3-4,5. </li><li> 24 ore dopo la sfida 2 Gy γ-irradiazione, raccolta e fissare a = campione 24 ore come descritto al punto 4,8-4,10. </li></ol>tle &quot;&gt; 5. immunofluorescente Etichettatura con Anti-γH2AX anticorpo Nota: in genere, 15-30 campioni al giorno possono essere immunofluorescently etichettati e dosati con citometria a flusso in un unico passaggio. Al fine di garantire un confronto accurato tra i gruppi di trattamento, includere campione (s) per ogni gruppo. Riferimenti 16 per ulteriori dettagli. <ol><li> Preparare una serie etichetta di tubi per il numero di campioni da processare e posto sul ghiaccio. Utilizzare 12 x 75 mm tubi di vetro senza cappuccio. La sterilità non è necessario per questo lavoro. Includere un campione di controllo storico aggiuntivo per l&#39;etichettatura con anticorpo secondario solo (&quot;solo 2 ° Ab&quot;). Utilizzare questo esempio di controllo storico in ogni citometria a flusso eseguito all&#39;interno di uno studio. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di TBS ghiacciata a ciascuna provetta. </li><li> Rimuovere splenociti fissi da -20 ° C, vortex per 5 secondi e trasferire 0,5 ml aliquota da provette preparate con TBS. Mettere il resto dei campioni di nuovo in -20 ° C e stoccaggiomantenere come campione di backup. </li><li> Splenociti centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante e delicatamente risospendere pellet in 1 ml di ghiacciata TBS contenente 1% FBS </li><li> Cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il supernatante e delicatamente risospendere pellet in 1 ml di tampone TST (0,05% Triton X-100, 2% FBS in TBS). Incubare per 20 min in ghiaccio. </li><li> Cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante e delicatamente risospendere pellet in 200 ml di anticorpo anti-γH2AX primario diluito 1: 150 in tampone TST. Utilizzare 200 ml di TST per il &quot;solo 2 ° Ab&quot; campione di controllo. </li><li> Tubi posizione su un agitatore rotante a un angolo di 45 - 60 ° e agitare per 1,5 ore a 300 xg a RT. </li><li> Mentre tubi sono incubazione preparare un volume sufficiente (200 pl / campione) di capra anti-topo coniugato con anticorpo secondario Alexa-488 ad una diluizione 1: 200 in tampone TST. Nota: Tutti i lavori che coinvolgono Alexa-488anticorpo coniugato (passi 5,10-5,16 sotto) dovrebbe essere fatto in condizioni di luce fioca e campioni etichettati deve essere protetto dalla luce avvolgendo i tubi in un foglio di alluminio. </li><li> Una volta che il 1,5 ore di incubazione è completato, aggiungere 1 ml di TBS ghiacciata contenente 2% FBS a ciascuna provetta e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il supernatante e delicatamente risospendere pellet in 1 ml di TBS contenente 2% FBS. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante e delicatamente risospendere pellet in 200 ml di soluzione di anticorpo secondario dal punto 5.8. </li><li> Incubare i campioni su una piattaforma che agita per 1 ora come al punto 5.7. </li><li> Aggiungere 1 ml di TBS ghiacciata contenente 1% FBS. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante e delicatamente risospendere pellet in 1 ml di TBS ghiacciata. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare il supernatante e delicatamente risospendere pellet in 0,5 ml di TBS contenente 50 mg / mlpropidio ioduro. </li><li> Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. </li><li> Analizzare i campioni su un citofluorimetro utilizzando protocolli specifici dello strumento 16. Leggere almeno 10.000 cellule per campione. </li></ol>

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The authors declare that there are no known competing financial interests.

Il protocollo presentato in questo documento è utile per lo svolgimento di grandi dimensioni del mouse scala studi in vivo che esaminano gli effetti genotossici di bassi livelli di vari agenti chimici e fisici, incluse le radiazioni ionizzanti. La nostra struttura unica specifica senza germe patogeno animale dotato di una GammaBeam 150 irradiatore e una sala lunga irradiazione 30 metro permette la conduzione di studi per tutta la vita che coinvolgono irradiazioni rateo di dose bassa o molto bassa su centinaia o addirittura migliaia di topi. Impianti di irradiazione più piccole per irradiazione cronica a basse dosi può essere impostato in una università o in un ambiente ospedaliero dove vengono condotti regolarmente studi radiobiologia e le linee guida in materia di radioprotezione / norme siano applicate. Tuttavia, normative più severe normalmente applicano agli impianti progettati per irradiazione animale interna dove la manipolazione di radionuclidi, come trizio, viene effettuata. Anche se raro, laboratori certificati per questo tipo di studi di esposizione alle radiazioni interne esistono in vari reistituti di ricerca in tutto il mondo e le loro capacità uniche possono essere utilizzati per studi descritti in questo protocollo. All&#39;interno del protocollo, si usa l&#39;etichettatura immunofluorescenza di γH2AX di valutare con precisione i tassi DSB DNA prodotti da esposizioni sperimentali. Livello Ancora più importante, l&#39;introduzione di una irradiazione impegnativo consegnato ex vivo per splenociti estratti rende possibile valutare l&#39;integrità della risposta DSB DNA (livello γH2AX a 1 ora dopo il challenge) e del DNA riparazione DSB (γH2AX a 24 ore rispetto ai 0 ore). Va notato che la quantificazione delle γH2AX foci per cella mediante microscopia a fluorescenza può fornire una maggiore sensibilità rispetto a citometria a flusso. Ad esempio, dosi a partire da 0.001 sono stati segnalati Gy per produrre un aumento significativo nel numero di focolai γH2AX per cella. Tuttavia, l&#39;uso di rilevamento basato su citometria a flusso di γH2AX offre vantaggi rispetto a fluorescenza microscopia becautilizzarlo richiede meno tempo per le misurazioni, non richiede personale altamente specializzato / addestrato e evita soggettivo processo decisionale in materia di γH2AX Foci il riconoscimento e il conteggio. Questi vantaggi sono fondamentali per studi animali larga scala. Un esperimento animale tipico con 10 gruppi di trattamento e 10 topi per gruppo comporterà 100 campioni x 3 = 300 milza, se il metodo proposto (Figura 1) è seguita. Per generare i dati da questo numero di campioni, circa 100 ore saranno tenuti in citometria a flusso. In alternativa, se fatto da analisi al microscopio manuale, lo stesso compito ci vorranno almeno 300 ore, utilizzando una stima prudenziale di 40 minuti di tempo microscopio altamente impegnativo per campione. Sebbene siano stati fatti tentativi per automatizzare l&#39;analisi e il punteggio di foci γH2AX 17-19, tutti hanno una serie di limitazioni. In particolare, la forma rotonda e di piccole dimensioni di splenociti di topo e linfociti rende impraticabile per risolvere tutto individual γH2AX Foci microscopio. Mentre le cellule aderenti sono stati segnati con successo da sistemi automatizzati per microscopia γH2AX fuochi, senza successo è stato dimostrato sia per splenociti di topo o linfociti. Il modo migliore per eliminare giorno per giorno variabilità dei valori misurati di segnale γH2AX mediante citometria di flusso è quello di includere i campioni di gruppo e di controllo sperimentale nello stesso periodo e per calcolare i cambiamenti γH2AX entro il termine di ogni corsa. Ulteriori raccomandazioni includono: a) un controllo storico costituito da non trattati e 2 Gy irradiata campione viene utilizzato in ogni corsa; b) una persona realizza tutte le procedure di etichettatura di anticorpi; c) un solo magazzino di buffer e un singolo lotto di anticorpi, sia primari che secondari, viene utilizzato per l&#39;intero insieme di campioni all&#39;interno di un esperimento. E &#39;anche fondamentale per eseguire un citofluorimetro controllo di qualità consigliato dal produttore dello strumento di routine e prima di ogni serie di campioni. Questo è required per verificare sistema di allineamento e fluidica ottica dello strumento e anche aiuta minimizzando variazione giorno per giorno in fluorescenza misurata γH2AX tra i campioni da confrontare o riunito in un unico gruppo. Va sottolineato che l&#39;utilizzo di un numero maggiore di punti temporali (per esempio, 1, 2, 4, 6 ore) irradiazione postale impegnativo può aiutare analizzare e misurare breve termine cinetica riparazione DSB DNA in maggior dettaglio 16. Tuttavia, il potenziale riparazione complessiva e la probabilità di effetti sulla salute ritardati sarebbero rappresentati da danni residua misurata solo a 24 ore e rispetto a quello osservato per il punto temporale iniziale (t = 0) 13-15 (Figura 4). Poiché i livelli basali γH2AX sono noti per aumentare in animali vecchi o cellule senescenti 20, per l&#39;interpretazione più precisa dei risultati ottenuti in studi topo esposizione a lungo termine (&gt; 6 mesi) con il metodo descritto, the l&#39;uso di una giovane gruppo non trattato, in aggiunta a un controllo di pari età, sarebbe auspicabile. Sebbene alcuni rapporti indicano che γH2AX può aumentare nelle cellule proliferanti, che non sarebbe in relazione con DSB DNA, questo può facilmente essere controllato misurando fase S e G2 / M-fase frazioni cellulari utilizzando istogrammi di DNA (Figura 2A, D). Se certe condizioni sperimentali impediscono ancora un ricercatore di utilizzare γH2AX come marcatore di danno al DNA (per i motivi di cui sopra o la loro combinazione), un&#39;altra proteina che forma il DNA danni focolai, come 53BP1, può essere utilizzato 21. Anche se non abbiamo cercato di utilizzare questo metodo per tessuti non linfoidi, come i muscoli, il cuore, il cervello e gli altri, sembrerebbe difficile elaborarli per citometria a flusso. Le sezioni di tessuto e la microscopia per γH2AX conteggio focolai sarebbe il metodo di scelta, se è necessaria un&#39;analisi di tali tessuti. Tuttavia, altre cellule linfoidi, come sangue periferico lymphocytes, linfociti midollo osseo o timociti, possono essere utilizzati per misurare i livelli γH2AX con il metodo descritto. Il vantaggio di utilizzare linfociti splenici è la relativa semplicità di preparazione sospensione cellulare e il gran numero di celle che possono essere isolate da un milza. Questo diventa ancora più vantaggioso se punti finali supplementari sono inclusi nello studio. Nella nostra esperienza, un rendimento tipico di splenociti per il mouse consente la raccolta di almeno 10 aliquote, ogni adatto per uno dei seguenti saggi: citometria a flusso, RT-qPCR per gene o miRNA, Western Blot, DNA genomico per CpG metilazione test. Così, aliquote splenocyte aggiuntivi raccolti in parallelo a quelli per il punto finale γH2AX possono essere usati per misurare l&#39;espressione di geni coinvolti nella segnalazione e riparazione risposte danno del DNA. Tali geni come Gadd45a e CDKN1A, che sono normalmente trascrizionalmente up-regolata in risposta a trattamenti citotossici 22, possono fornire un indizio per stuzzicarele sue cellule sono adeguatamente rispondendo all&#39;influenza sforzo impegnativo. Allo stesso modo, i livelli di proteina e modificazioni post-traduzionali coinvolte nella risposta allo stress possono essere valutate. Infine, non si prevede che una qualsiasi delle fasi della procedura di estrazione, se eseguita come descritto qui, può indurre γH2AX in splenociti. Sarebbe utile e altamente raccomandato per assaggiare organi e tessuti supplementari durante i sacrifici per integrare DNA danno e riparazione dati ottenuti per splenociti come da protocollo presentato con altri punti finali. Per esempio, abbiamo quotidianamente raccogliamo le cellule del midollo osseo per la in vivo del midollo osseo test del micronucleo, vari tessuti per senescenza associata β-galattosidasi e di espressione genica misure di riparazione del DNA. La capacità di raccogliere altri tessuti potrebbero dipendere il supporto tecnico disponibile durante i sacrifici; tuttavia, può contribuire in modo significativo nella corretta interpretazione dei risultati e la costruzione di un much biologicamente più immagine sistemica rilevante della risposta al trattamento di basso livello in fase di studio.

Polemiche significativo sopra i potenziali effetti dannosi di una dosi basse o molto basse di radiazioni e la paura del pubblico delle radiazioni, guidata da immagini dei bombardamenti atomici di Hiroshima e Nagasaki e di incidenti impianti nucleari rari ionizzanti (aggravato dai mass media), ha portato a molto regolamento sulla radioprotezione rigorosa e standard che non sono potenzialmente scientificamente giustificata. Negli ultimi tre decenni, numerosi studi hanno documentato sia la mancanza di nocivo e la presenza di effetti biologici potenzialmente benefici indotti da radiazioni a basso dosaggio 1-4. Il principale fattore di rischio per la salute di radiazioni è la probabilità di cancro, stimato sulla base di studi epidemiologici di sopravvissuti alla bomba atomica che ricevono dosi medio-alti di radiazioni. Estrapolazione lineare di questi dati (cosiddetti lineare senza soglia o il modello LNT) viene utilizzato per stimare i rischi di cancro a basse dosi. Tuttavia, questo approccio non ha ricevuto l&#39;accettazione scientifica a livello mondialeed è fortemente dibattuto 5. E &#39;evidente che sono necessari ulteriori studi per chiarire questo punto e possibilmente migliorare gli standard di protezione dalle radiazioni. Tali studi dovrebbero coinvolgere trattamenti cronici (meglio ravvicinamento delle esposizioni ambientali e professionali), in modelli animali in vivo (migliore per gli effetti per la salute umana estrapolando) e tali end-point come la frequenza dei danni del DNA, riparazione del DNA e mutagenesi. E &#39;noto che il DNA è l&#39;obiettivo primario per danneggiare gli effetti delle radiazioni e incomplete o mis-riparazione può portare a mutagenesi e cancro sviluppo 6. DNA rotture del doppio filamento (DSB) sono uno dei tipi più deleteri di lesioni del DNA e possono portare a morte cellulare e tumorigenesi 7. È quindi importante poter affidabile e preciso misurare il livello di DSB dopo esposizione a radiazioni dose bassa e / o di altri fattori di stress, come le sostanze chimiche. Uno dei marcatori più sensibili e specificidi DSB DNA è fosforilata istone H2AX, chiamato γH2AX 8, ma altri indicatori e metodi sono stati suggeriti 9,10. Si stima che migliaia di molecole H2AX, in prossimità di un DSB indotto, sono coinvolti nella formazione del γH2AX consentire l&#39;individuazione dei singoli DSB, mediante l&#39;etichettatura immunofluorescenza con un anti-γH2AX anticorpi e microscopia a fluorescenza 11. La risposta è molto rapida, raggiungendo il massimo tra 30 e 60 min. Esistono prove che γH2AX facilita la riparazione del DNA DSB, attirando altri fattori di riparazione per i siti di pause e modificando la struttura della cromatina per ancorare le estremità del DNA rotto e l&#39;accesso di altre proteine ​​di riparazione (recensito in 12). Al termine della riparazione di DSB DNA, γH2AX viene de-fosforilata e / o subisce il degrado, e le molecole di nuova sintesi H2AX sostituire γH2AX nelle zone colpite della cromatina 10. Formazione e la perdita di γH2AX monitoraggio può,di conseguenza, fornire una stima accurata dei DSB DNA cinetica di riparazione. Questo approccio è stato utilizzato per studiare la riparazione di DSB in varie linee cellulari tumorali umane irradiate con dosi elevate di radiazioni e il suo tasso e livelli DSB residui hanno dimostrato di correlazione con radiosensibilità 13-15. Abbiamo modificato questo approccio sperimentale e applicata a un studio sui topi in vivo per esaminare gli effetti di basse dosi di γ- cronica e β-irradiazione sui livelli e di riparazione (Figura 1) DSB DNA. In primo luogo, abbiamo dimostrato un metodo per eseguire un lungo periodo di esposizione cronica di topi di β-radiante emessa da trizio (idrogeno-3) in forma di acqua triziata (HTO) o trizio organicamente (OBT) disciolto in acqua potabile . Le due forme dovrebbero accumulo e / o distribuire diverso nel corpo e, quindi, produrre diversi effetti biologici. Entrambe le forme sono potenziali rischi nel settore nucleare. Questo trattamentoè affiancata da esposizione cronica a γ-radiazioni ad una dose equivalente di consentire un corretto confronto tra i due tipi di radiazione, che è cruciale per la valutazione della loro efficacia biologica relativa. Beta-radiazioni è composto di elettroni, il che rende molto diversa dalla γ-radiazioni, fotoni ad alta energia. A causa di questa differenza, Β-radiazioni rappresenta pericolo per la salute principalmente interno e può produrre effetti biologici diversi rispetto a γ-radiazioni. Questa complicanza provocato controversie significativi rispetto alla regolazione di esposizione a β-radiazione emessa da HTO. Pertanto, i livelli di regolamentazione degli HTO in acqua potabile per il pubblico variano da 100 Bq / L in Europa a 75.000 Bq / L in Australia. È, quindi, importante confrontare gli effetti biologici di HTO a dosi equivalenti di γ-radiazioni. In secondo luogo, il tasso di DSB DNA viene misurata in splenociti isolati al completamento delle esposizioni croniche utilizzando immunofluorescently etichettato γH2AX rilevarecato mediante citometria di flusso. Ciò permette di valutare l&#39;entità del danno al DNA inflitto dalle esposizioni in vivo. Tuttavia, è ragionevole aspettarsi che tali esposizioni di basso livello non può produrre alcun tasso rilevabili di DNA DSB; invece, alcune modifiche nascosti / risposte si può aspettare che interesserebbe la capacità delle cellule per riparare i danni del DNA. Questi cambiamenti, se trovato, possono essere sia stimolante (producendo un effetto benefico) o inibitoria (producendo un effetto deleterio). Il protocollo proposto permette di rivelare tali cambiamenti sfidando i splenociti estratti con una dose elevata di radiazioni che produce una notevole quantità di danni (per esempio, 2 Gy producendo circa il 50 DNA DSB per cellula o un 3 -. Aumento di 5 volte del livello γH2AX totale) . Successivamente, la formazione e la perdita di γH2AX, che riflette l&#39;avvio e il completamento della riparazione DSB, è monitorato mediante citometria a flusso. In questo modo, non solo basale e livelli indotte dal trattamento di DSB DNA possono essere misurate, maanche il suo potenziale effetto sulla capacità delle cellule di rispondere e riparare i danni al DNA indotti da livelli molto più alti stressanti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HTO: tritiated water, [3H]</td>
			<td>locally obtained from a nuclear reactor&#160;</td>
			<td></td>
			<td>stock activity 3.7 GBq/mL;&#160; can be substituted with HTO from Perkin Elmer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET348005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET004005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET323005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tritiated water, [3H] (HTO)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET001B005MC</td>
			<td>substitute for HTO of local origin&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GammaBeam 150 irradiator</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Limited</td>
			<td>locally manufactured</td>
			<td>can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tween-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025501</td>
			<td>Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1051-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-gH2AX antibody, clone JBW301</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Life Technologies (formerly Invitrogen)</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4864-10ML</td>
			<td>1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P006-EAAN</td>
			<td>500ml bottles Absolute Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2682550</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td>P110403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 x 75 mm mL uncapped glass tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K60B1496126</td>
			<td>disposable borosilicate glass tubes with plain end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA15708-120</td>
			<td>nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14068-12</td>
			<td>Wagner scissors 12cm sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>Semken forceps 13cm, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-12</td>
			<td>Narrow Pattern forceps 12 cm, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA25382-100</td>
			<td>BD Falcon tissue culture dish 60x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainers, 70 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Falcon cell strainers 50/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200mL of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS recipe: to make 10X Stock,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30g TRIS HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-1KG</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>88g NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Sodium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2g KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Potassium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissolve in 1L of deionized water, adjust pH to 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring dna damage and repair in mouse splenocytes after chronic in vivo exposure to very low doses of beta- and gamma-radiation

Esposizione radiazione bassa dose può produrre una varietà di effetti biologici che sono diversi nella quantità e qualità degli effetti prodotti dalle alte dosi di radiazioni. Affrontare le questioni relative alla sicurezza della salute ambientale, occupazionale e del pubblico in modo adeguato e scientificamente giustificata pesantemente si basa sulla capacità di misurare con precisione gli effetti biologici degli inquinanti a basso dosaggio, come ad esempio le sostanze ionizzanti radiazioni e chimiche. Danno al DNA e riparazione sono i più importanti indicatori precoci di rischi per la salute a causa delle loro potenziali conseguenze a lungo termine, come il cancro. Qui si descrive un protocollo per studiare l&#39;effetto di cronica esposizione vivo a basse dosi di γ- e β-radiazione sul danno e riparazione del DNA nelle cellule del mouse milza. Con un pennarello comunemente accettata di DNA rotture del doppio filamento, fosforilata H2AX istone chiamato γH2AX, dimostriamo come può essere utilizzato per valutare non solo i livelli di danno al DNA, ma cambia anchenella capacità di riparazione del DNA potenzialmente prodotto da basse dosi di esposizione in vivo. Citometria a flusso consente la misurazione veloce, precisa e affidabile di immunofluorescently etichettato γH2AX in un gran numero di campioni. DNA a doppio filamento break riparazione può essere valutata esponendo splenociti estratte ad una dose di 2 Gy impegnativo per produrre un numero sufficiente di DNA rompe per innescare riparazione e misurando l&#39;indotto (1 hr post-irradiazione) e danno al DNA residuo (24 ore post-irraggiamento). Danno al DNA residuo sarebbe indicativo di riparazione incompleta e il rischio di instabilità genomica a lungo termine e il cancro. In combinazione con altri metodi e punti finali che possono essere facilmente misurati in tali studi in vivo (ad esempio, aberrazioni cromosomiche, frequenze micronuclei in reticolociti midollo osseo, l&#39;espressione genica, ecc), questo approccio consente una valutazione accurata e contestuale degli effetti biologici dei fattori di stress di basso livello.

La figura 2 mostra esempi di citometria a flusso grafici previsti per splenociti preparate con il metodo descritto qui. Le cellule vengono prima gated in base alla &lt;elettronica scatter volume-side&gt; diagramma a dispersione (Figura 2A e 2D, il volume elettronico equivale a scatter in avanti). FL3 / Propidium istogrammi iodio (figura 2B e 2E) confermano distribuzione normale ciclo cellulare. Media segnale γH2AX calcolato utilizzando il canale FL1 conferma un aumento&gt; 2 volte in DSB DNA in 2-Gy cellule (Figura 2F) irradiato rispetto al controllo non trattato (Figura 2C). Avanti, abbiamo esaminato la sensibilità del metodo descritto di misurare immunofluorescently etichettato γH2AX mediante citometria di flusso in splenociti mouse. Figura 3A mostra livelli γH2AX, indicativi di DSB DNA, in splenociti di topo 1 ora dopo l&#39;esposizione ex vivo a uno basso (0,1Gy) o (2 Gy) alte dosi di γ-radiazioni rispetto al controllo non trattato. Si può notare che 0,1 Gy indotto un lieve incremento del livello DSB e tale aumento era statisticamente significativa. Il forte induzione 3 volte era atteso e rilevata dopo l&#39;esposizione 2 Gy. Per convalidare la specificità di etichettatura immunofluorescenza γH2AX come descritto nel protocollo, cellule marcate sono state esaminate con un microscopio a fluorescenza. Il modello foci simile marcato osservato indica che il segnale di fluorescenza origina dall&#39;individuo DSB DNA all&#39;interno della cromatina (Figura 3B). Risultati rappresentativi della valutazione del tasso DSB DNA e loro riparazione in splenociti di topi esposti per un mese a concentrazioni molto basse di acqua triziata (10 kBq / L) sono presentate nella figura 4. Si può vedere (Figura 4A) che, sebbene la trattamento hanno portato ad un aumento del 10% del livello γH2AX basale, la variazione erat statisticamente significativa (N = 5, un campione test t di Student). Inoltre, la formazione misurata e la perdita di γH2AX dopo l&#39;impegnativo 2 Gy, che rappresenta la cinetica di riparazione DSB DNA, non era differente fra le cellule dal controllo e topi HTO-trattati (Figura 4B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52912/52912fig1.jpg" /> Figura 1. Schema sperimentale per valutare l&#39;effetto di irradiazione cronica in vivo sul danno al DNA e riparazione del DNA. Dopo il trattamento in vivo di topi con irradiazione cronica per un periodo di tempo desiderato, i topi vengono sacrificati e culture splenocyte sono stabiliti ed esposti ad un impegnativo irradiazione. Aliquote splenocyte sono raccolti e fissati in vari momenti dopo la dose impegnativo. I livelli di γH2AX sono poi misurati con immunofluorescenza labeling e rilevamento mediante citometria a flusso. La trama sulla parte inferiore della figura è uno schema dei dati attesi. Gamma-H2AX livello aumenta drasticamente subito dopo l&#39;irradiazione impegnativo, seguito da una diminuzione di nuovo al valore di controllo, se la riparazione del DNA è completa. Danno al DNA Δ rappresenta il danno prodotto a causa del trattamento sperimentale di topi e riparazione del DNA Δ rappresenta l&#39;effetto del trattamento di topi su DSB DNA la capacità di riparazione. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52912/52912fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52912/52912fig2.jpg" /> Flusso Figura 2. Rappresentante citometria a dati grezzi. (A, D) diagrammi a dispersione e le regioni di gating per splenociti e detriti cellulari ed eritrociti. (B, E) istogrammi di DNA che rappresentano distribuzioni del ciclo cellulare. <strong&gt; (C, F) γ-H2AX fluorescenza istogramma e valori medi di fluorescenza. I dati in set (AC) sono stati ottenuti da un rappresentante non trattati cellule della milza di controllo, mentre i dati nei set (D- F) sono stati ottenuti da cellule irradiate con 2 Gy γ-radiazioni e raccolte 1 ora dopo l&#39;irradiazione. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52912/52912fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per visualizzare un versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52912/52912fig3.jpg" /> Figura 3. Rilevamento di H2AX γ mediante citometria di flusso è sensibile e specifico. (A) Splenociti appena isolate da topi CBA sesso maschile sono stati irradiati con o 0.1 o 2 Gy di γ-radiazioni, o sham trattati e ha permesso di sviluppare la risposta γH2AX per 1 ora. Le cellule sono state poi fissati, immunofluorescentlymarcato con un anticorpo anti-γH2AX e analizzate mediante citometria a flusso. Valori medi normalizzati ± DS sono mostrati (N = 12). * E *** significare differenza statistica con p &lt;0.05 ep &lt;0.001, rispettosamente (su un unico campione di Student t-test). (B) microfotografie rappresentativi di controllo non trattato (UT) o 2 Gy irradiato splenociti immunofluorescently marcate con anti-γH2AX anticorpo. Il modello foci-come di fluorescenza verde ribadisce la specificità dell&#39;etichettatura di immunofluorescenza per γH2AX. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52912/52912fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52912/52912fig4.jpg" /> Figura 4. Risultati rappresentativi mostrano la mancanza di effetto prodotto da 1 mese l&#39;esposizione di topi a tardo triziatar (HTO) a livello e la riparazione del DNA DSB. (A) Gli splenociti sono stati isolati da topi trattati con 10 kBq / L di HTO in acqua potabile e di controllo degli animali. Il livello di γH2AX stata misurata utilizzando etichettatura immunofluorescenza e citometria a flusso come descritto nel protocollo. Significano γH2AX livelli di fluorescenza rispetto a quelle del controllo ± SD sono mostrati (N = 5). Questi dati sono stati generati dalla t = 0 time-point che è stato utilizzato nella Figura 3B per la valutazione di riparazione DSB DNA. (B) isolato splenociti sono stati esposti ad una sfida 2 dosi Gy di γ-radiazioni e aliquote di cellule sono state fissate a tempi t = 0, 1 e 24 ore dopo l&#39;irradiazione impegnativo. Fluorescenza γH2AX rispetto al proprio t = 0 controllo medio è mostrato ± SD (N = 5). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52912/52912fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation at JoVE.com

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Misurazione danno al DNA e ripristina in mouse Splenociti Dopo cronica<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;esposizione a dosi molto basse di beta e gamma Radiazioni

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

measuring-dna-damage-repair-mouse-splenocytes-after-chronic-vivo

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

11.0K Views.  Canadian Nuclear Laboratories. A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented. 

Video: Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

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Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

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Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

La stimolazione dei citoplasmatici DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA arricchimento da una tecnologia basata trasposasi-NGS per l&#39;analisi della sequenza intera<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, e 9 geni coinvolti nella riparazione del DNA Damage

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the different aspects of visual, cross-modal and developmental plasticity along the mammalian visual system1-4.
Here, we demonstrate an elegant and straightforward technique for the removal of one or both eyes in the mouse, which is validated in mice of 20 days old up to adults. Briefly, a disinfected curved forceps is used to clamp the optic nerve behind the eye. Subsequently, circular movements are performed to constrict the optic nerve and remove the eyeball. The advantages of this technique are high reproducibility, minimal to no bleeding, rapid post-operative recovery and a very low learning threshold for the experimenter. Hence, a large amount of animals can be manipulated and processed with minimal amount of effort. The nature of the technique may induce slight damage to the retina during the procedure. This side effect makes this method less suitable as compared to Mahajan et al. (2011)5 if the goal is to collect and analyze retinal tissue. Also, our method is limited to post-eye opening ages (mouse: P10 - 13 onwards) since the eyeball needs to be displaced from the socket without removing the eyelids. The in vivo enucleation technique described in this manuscript has recently been successfully applied with minor modifications in rats and appears useful to study the afferent visual pathway of rodents in general.

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

The removal of eyes, also called enucleation, provides a useful strategy to study aspects of visual, cross-modal, and developmental plasticity along the mammalian visual system since it induces irreversible partial (monocular) or complete (binocular) vision loss. Here we describe a highly reproducible and straightforward approach to perform in vivo enucleation.

Un metodo altamente riproducibile e semplice da eseguire<em&gt; In Vivo</em&gt; Oculare enucleazione del mouse dopo apertura degli occhi

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Misurazione glutatione indotta risposta alimentazione a Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Rilevamento e analisi del danno al DNA nel muscolo scheletrico mouse<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzo del metodo TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

La convalida di un modello di topo per Disrupt LINC Complessi in modo specifico-Cell

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In Vivo alcalina Comet Assay e l&#39;enzima modificato alcalina Comet Assay per la misurazione rotture del DNA Strand e danno ossidativo del DNA in fegato di ratto

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Misurare la rigidità<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorte Utilizzando microscopia a forza atomica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...