This work was supported by NIH grant GM085232 and an Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (to A.A.).

1. Lipid Preparazione <ol><li> Aliquota lipidi quantità desiderata in un tubo di vetro trasparente. Vedi. coli estratto lipidico polare, ma la maggior parte delle composizioni lipidiche possono essere usati. Se i lipidi sono in forma di polvere, risospendere in cloroformio ad una concentrazione di 20 mg / ml. Asciugare i lipidi a RT in N 2 gas fino a quando tutto il solvente è evaporato. </li><li> Risospendere i lipidi in pentano e asciugare nuovamente un flusso costante di gas N 2 per eliminare tracce residue di cloroformio. Dry fino a che tutto il solvente è evaporato. Mentre l&#39;essiccazione, ruotare delicatamente il tubo in modo che il lipide è distribuito in una pellicola uniforme che copre la parte inferiore del tubo piuttosto che formare una densa massa sul fondo. </li><li> Aggiungere il tampone di ricostituzione contenente detersivo (KCl 300 mm, 50 acido citrico mM, 25 mm K 2 HPO 4, pH 4.5, 35 CHAPS mm) per sciogliere i lipidi. Utilizzare altri detergenti delicati per questo passo se la proteina è scarsamente tollerante CHAPS. </li><li> Resuspend i lipidi di chiarezza con un sonicatore bagnomaria. Immergere il tubo nel centro del bagno sonicatore acqua alla potenza massima breve (30 sec-1 min) con impulsi brevi (30 sec-1 min) interrompe. La soluzione dovrebbe diventare chiaro. NOTA: Il grado finale di chiarezza raggiunto dipende dalla composizione lipidica specifico utilizzato. Alcune variazioni da lotto a lotto in questa fase, anche tra lipidi nominalmente identici, è anche possibile. Haze residuo è dovuta alla dispersione della luce da grandi particelle in sospensione, che può essere rimosso mediante centrifugazione. </li><li> Incubare i lipidi risospeso a RT per 20-60 min. </li></ol> 2. Proteoliposome Formazione NOTA: Diverse strategie può essere impiegato per inserire la proteina detergente solubilizzato in liposomi. Per CLC-EC1 dialisi funziona bene ed è quindi il metodo di scelta 6,9,10. <ol><li> Aggiungere la proteina purificata alla desiderata proteina-to-lipidi (P / L) Rapporto (espressa in mg o<html> f Proteine ​​/ mg lipidi). La scelta del rapporto P / L dipende dallo scopo dell&#39;esperimento. <ol><li> Se l&#39;obiettivo è quello di valutare l&#39;attività della proteina di interesse, ricostituire ad alta P / L&#39;s per massimizzare il segnale, in quanto ogni liposoma contiene più copie della proteina. Per quantificare l&#39;attività e / o velocità di trasporto unitario della proteina, ricostituire in un regime di diluizione Poisson a bassa P / L&#39;s, in modo che ogni vescicola contiene in media 1 proteine. Vedere il punto 7 e discussione per una più approfondita analisi di quando usare ogni regime. </li></ol></li><li> Per determinare i valori ottimali P / L per i vari regimi, effettuare una titolazione completa dell&#39;attività in funzione della concentrazione proteica 8,11-13. Tuttavia, per ogni proteina per la quale il peso molecolare (MW, espresso in kDa) dell&#39;unità attiva è noto i seguenti valori P / L possono essere utilizzati come guesstimates iniziali: pg &quot;/&gt; <img alt="Equazione 2" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq2.jpg" /></li><li> Caricare la miscela di proteine ​​e lipidi in un tubo di dialisi pre-bagnata o una cassetta. Posizionare il dispositivo di dialisi in un becher contenente 500-1,000x il volume del buffer lipidi ricostituzione (cioè, 1 tampone L per 1 ml di lipidi risospensione) sotto leggera agitazione. <ol><li> Change tampone 3-4 volte a intervalli&gt; 3 ore. Ad ogni cambio soluzione, lavare la cassetta / tubo e il bicchiere con acqua distillata e riempire il bicchiere con tampone di ricostituzione fresca. Includere 1-2 O / N intervalli per il cambio soluzione. Il numero esatto e durata delle modifiche soluzione dipende lipide esatta e detergenti utilizzati. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;ultimo passo, rimuovere i liposomi dalla nave di dialisi, le aliquote in tubi e flash li congelare in N liquido 2 o congelamento a -80 ° C. </li></ol> 3. Registrazione Set-up &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTA: La registrazione set-up (Figura 2A) si compone di due camere (cilindri a fondo piatto, ~ 3-4 volumi ml), un Cl - (vedi sotto) elettrodo, un pH-metro con un analogo o uscita digitale elettrica, un digitalizzatore, e un computer con un appropriato software di acquisizione. <ol><li> Collegare il Cl - elettrodo al pH-metro, l&#39;uscita del misuratore di pH al digitalizzatore, che è collegata al computer. Inserire l&#39;elettrodo di riferimento in una camera e il filo ricodifica nell&#39;altro (Figura 2B). NOTA: La polarità dei fili è corretto se ΔV Cal (vedi punto 6.4 e 7.2) è positivo. </li><li> Mettere le camere su un piatto mescolare con un ancoretta in camera di registrazione (Figura 1B). Assicurarsi che la ancoretta non tocchi l&#39;elettrodo. </li><li> Collegare camere utilizzando un ponte di agar (Figura 2B) (KCl 100 mM e 2% agarosio). Conservare i ponti Agar in KCl 100 mm. </li&gt; </ol> 4. Preparazione del Cl - Elettrodo <ol><li> Prendete un vecchio e -possibly- elettrodo non funzionante pH. Rompere il rivestimento di vetro per rivelare completamente i fili d&#39;argento. </li><li> Rimuovere delicatamente il rivestimento dai fili d&#39;argento con una lama di bisturi. Pulire i fili con abbondanti quantità di H 2 O e EtOH. </li><li> Mettere in una soluzione satura di FeCl 3 (o candeggina) fino fili sono coperti con un mantello scuro uniforme di AgCl. </li></ol> 5. Preparazione di unilamellari vescicole <ol><li> La notte prima degli esperimenti, si gonfiano 1 g di Sephadex G-50 perle in 15 ml di tampone esterna (1 mM KCl, 150 mm K 2 SO 4, acido citrico 25 mM, pH 4.5) con agitando delicatamente (non mescolare) per almeno 3 ore a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. Ogni esperimento richiede ~ 3 ml di perle gonfie. Mantenere le perle gonfie a 4 ° C per pochi giorni al massimo. </li><li> Mentre i liposomi sono scongelamento a RT, versare in ogni colonna ~ 3 ml di gonfiore G-50 perline. Lasciate asciugare per flusso di gravità a RT; questo richiede di solito 1-2 min. </li><li> Preparare vescicole unilamellari estrudendo i proteoliposomi 11 volte attraverso un mini-estrusore utilizzando un taglio 0,4 m Teflon. </li><li> Porre la colonna in un tubo a fondo tondo di plastica. Gira le colonne per rimuovere la soluzione in eccesso. Centrifugare per 20-30 secondi a 1.400 xg in una centrifuga clinica. </li><li> Scartare flow-through, colonna posto in un tubo di vetro 13 x 100 mm e aggiungere 100 ml di vescicole estrusi alla colonna. Spin colonna per 1 min a 500 xg in una centrifuga clinica. </li><li> Raccogliere ~ 200 ml di flusso continuo che verranno aggiunti alla camera di registrazione al punto 6.5. </li></ol> 6. Efflux misura <ol><li> 2 ml di KCl 100 mm di riferimento (terra) da camera e 1,8 ml del tampone esterna (1 mM KCl, 150 mm K 2 SO 4, 25 acido citrico mM, pH 4,5) per la camera di registrazione. Il leggero squilibrio osmotico tra l&#39;internoe soluzioni esterne non influisce </li><li> Avviare il programma di acquisizione. Lasciate che la linea di base equilibrare, l&#39;operazione potrebbe richiedere alcuni minuti. </li><li> Una volta che il segnale raggiunge una linea di base stabile (liposomi sono pronti e le colonne asciugare), avviare la registrazione (Figura 3A). </li><li> Aggiungere 15 ml di una soluzione 10 mM KCl per calibrare il sistema (Figura 2A). </li><li> Aggiungi liposomi. Un piccolo salto potrebbe essere visibile a causa della rimozione incompleta di Cl esterni - dalle proteoliposomi (Figura 3A). Aspetta la linea di base si stabilizza. </li><li> Aggiungere Valinomicina (1 ml a 1 mg / ml in EtOH) per avviare efflusso (Figura 3A). </li><li> Lasciate che l&#39;efflusso suo corso tempo fino a che altipiani (Figura 3A). </li><li> Aggiungere 40 ml di 1,5 M β-octylglucoside (β-OG) preparato nel buffer esterna per sciogliere tutti liposomi (Figura 3A). Terminare la registrazione. </li></ol> 7. Dati AANALISI <ol><li> Esportare il file di traccia da in formato ASCII o testo e importarlo nel programma di analisi di scelta. </li><li> Misurare la tensione nei seguenti punti (Figura 3A): All&#39;inizio della registrazione (V 0); Dopo aggiunta dell&#39;impulso di taratura (V cal); Dopo l&#39;aggiunta dei liposomi (V lipo); Alla fine del efflusso (V fin); Dopo l&#39;aggiunta di detergente (V tot); Baseline le tensioni in modo che V 0 = 0. </li><li> Utilizzare l&#39;equazione di Nernst-Plank per determinare il valore sperimentale <img alt="Equazione 3" fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq3.jpg" /> misurando <img alt="Equazione 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq4.jpg" /> Dove Vol Cal è il volume dell&#39;impulso di taratura in ml, 1.800 è il volume della camera all&#39;inizio dell&#39;esperimento espressa1; l, [Cl] cal / a sono il Cl - concentrazioni di impulso di calibrazione e del cuscinetto esterno in mM e ΔV cal è il salto in mV misurata dopo l&#39;impulso di taratura. NOTA: Questa determinazione empirica di α tre scopi: garantisce che il sistema risponde correttamente, offre una misura della coerenza della risposta dello strumento tra esperimenti e controllare che errori sono stati fatti nella fabbricazione soluzione. </li><li> Calcolare le concentrazioni Cl dopo ogni passaggio come segue: <img alt="Equazione 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq5.jpg" /> <img alt="Equazione 6" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq6.jpg" /> <img alt="Equazione 7" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq7.jpg" /> Il fattore 3/400 proviene dalla diluizione dell&#39;impulso di taratura 15 microlitri nel volume finale di 2000 ml. </li><li> Calculmangiato i cambiamenti [Cl] ad ogni passo, ΔCl lipo / def / tot. </li><li> Convertire V (t) in Cl (t) con <img alt="Equazione 8" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq8.jpg" /> Direttamente determinare i valori [Cl] nei punti critici e confrontarle con i valori calcolati come controllo interno. </li><li> Normalizzare la traccia in modo che la lipo Cl rel = 0 e Cl rel tot = 1 <img alt="Equazione 9" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq9.jpg" /></li><li> Montare corso tempo di efflusso la seguente equazione: <img alt="Equazione 10" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq10.jpg" /> Quando L è il tasso di Cl - perdita che è sperimentalmente determinata misurando Cl - efflusso da liposomi privi di proteine ​​preparati nelle stesse condizioni e τ è la costante di tempo del processo. </li><li> Calcolare v, la velocità iniziale: Dove ΔCl pinna è espresso in millimolare e V è il volume della camera in microlitri. </li><li> Calcolare il tasso di trasporto / conduttanza <img alt="Equazione 12" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq12.jpg" /> Dove P è il P / L, MW è il peso molecolare del complesso attivo espresso in kDa </li></ol>

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	<li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14, 673-681 (2006).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li><li>Almo, S. C., Love, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+and+faster:+improvements+and+optimization+for+mammalian+recombinant+protein+production.">Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production.</a> Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).</li><li>Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cells+to+improve+protein+expression.">Engineering cells to improve protein expression.</a> Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).</li><li>Accardi, A., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+active+transport+mediated+by+a+prokaryotic+homologue+of+CLC+Cl-+channels.">Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels.</a> Nature. 427, 803-807 (2004).</li><li>Nguitragool, W., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+a+CLC+Cl-/H++exchange+transporter+by+polyatomic+anions.">Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions.</a> J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).</li><li>Walden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+and+turnover+in+a+Cl-/H++exchange+transporter.">Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter.</a> J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).</li><li>Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+currents+mediated+by+a+prokaryotic+homologue+of+CLC+Cl-+channels.">Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels.</a> J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).</li><li>Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+required+for+H(+)/Cl(-)+exchange+mediated+by+a+CLC+transporter.">Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter.</a> Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).</li><li>Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+purified+human+Hv1+H++channels.">Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels.</a> Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).</li><li>Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+TMEM16A+is+sufficient+to+form+Ca2++activated+Cl-+channels.">Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).</li><li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel.">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nature Communications. 4, 2367 (2013).</li><li>Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basis+of+substrate+binding+and+conservation+of+selectivity+in+the+CLC+family+of+channels+and+transporters.">Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).</li><li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+potentiator+VX-770+(ivacaftor)+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).</li><li>Stockbridge, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+resistance+and+transport+by+riboswitch-controlled+CLC+antiporters.">Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).</li><li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsin+is+a+phospholipid+flippase.">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr Biol. 21, 149-153 (2011).</li><li>Nimigean, C. M., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na++block+and+permeation+in+a+K++channel+of+known+structure.">Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure.</a> J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).</li><li>Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bern&#232;che, S., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+substrate+binding+determines+the+stoichiometry+of+transport+of+a+prokaryotic+H(+)/Cl(-)+exchanger.">Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger.</a> Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).</li><li>Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sided+functions+of+an+arginine-agmatine+antiporter+oriented+in+liposomes.">Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes.</a> Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).</li><li>Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+a+prokaryotic+K++channel.">Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel.</a> J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).</li><li>Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ing&#243;lfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+regulation+of+membrane+protein+function:+gramicidin+channels+as+molecular+force+probes.">Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes.</a> J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).</li><li>Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride-dependent+interruption+of+the+transport+cycle+of+a+CLC+Cl(-)/H(+)+antiporter.">Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter.</a> Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).</li><li>Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+fluoride-specific+ion+channels+with+dual-topology+architecture.">A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture.</a> Elife. 2, e01084 (2013).</li><li>Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cyclic+nucleotide+modulated+prokaryotic+K++channel.">A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel.</a> J Gen Physiol. 124, 7 (2004).</li><li>Brohawn, S. G., del M&#225;rmol, ., J, R., MacKinnon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structure+of+the+Human+K2P+TRAAK,+a+Lipid-+and+Mechano-Sensitive+K++Ion+Channel.">Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel.</a> Science. 335, 436-441 (2012).</li><li>Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+slow+CLC+Cl-/H++antiporter+from+a+cyanobacterium.">Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium.</a> Biochemistry. 50, 788-794 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Abbiamo descritto un protocollo dettagliato per misurare Cl - il trasporto mediato da canali anione selettivo purificati o trasportatori ricostituiti in liposomi. L&#39;esempio è stato utilizzato il procariote H + / Cl - Scambiatore CLC-EC1. Tuttavia, il metodo può essere facilmente adattato per studiare canali gated da ligandi 12,13,15, 11,12 tensione, o sportive diversa selettività anionico 15,16 sostituendo l&#39;Ag: Elettrodo AgCl con uno adatto ione in esame. Elettrodi selettivi per gli ioni diversi Cl -, come H +, I - e F -, sono disponibili in commercio. Una discussione di alcune delle fasi critiche e ipotesi seguono. Limiti della diluizione assunzione Poisson La derivazione del tasso unitario (equazione 7-9) è valida solo in un regime di diluizione Poisson, quando la maggior parte liposomi contun solo ain proteina attiva in modo che la probabilità di avere più copie di un dato vescicole è bassa e la costante di tempo di efflusso macroscopica della popolazione vescicole è ben approssimata da quello di liposomi contenenti una singola proteina. Infatti, un confronto della Cl - momento efflusso mediato da liposomi ricostituiti con CLC-EC1 a basso (nero, 0,2 ug / mg) e alta P / L (grigio, 5 ug / mg) (Figura 3C) mostra che nel quest&#39;ultimo caso la cinetica di efflusso diventa più veloce e f 0 diminuisce, indicando che una frazione minore dei liposomi totale contiene 0 proteine. La quantità totale di Cl - contenuta in entrambi i campioni vescicole era paragonabile, ~ 0.7 e ~ 0,55 umoli, rispettivamente, il che indica che i volumi totali interne delle vescicole nei due campioni erano simili e che la quantità di proteine ​​ricostituito non modificano la dimensione le vescicole. Montaggio alta P corso tempo / L efflusso di equazioni 7 produce valori di τ<html> ; (5 ug / mg) = 8.8 sec e f 0 (5 ug / mg) = 0,06, indicando che solo ~ 6% delle vescicole non contengono attivi dimeri CLC-EC1 contrariamente al ~ 31% trovato quando P / L = 0,2 mg / mg. Pertanto, la stima del tasso di turnover unitario ad alta P / L è γ ~ 450 Cl - sec -1, circa 6 volte inferiore a quella ottenuta a partire P / L e di dati pubblicati 8,14. Pertanto, l&#39;analisi di efflusso corsi tempo liposomi ricostituiti ad alto P / L&#39;s sarà sottovalutare la velocità di trasporto unitario della proteina ricostituito. Così, per determinare con precisione la velocità di trasporto unitario di una nuova proteina è di importanza fondamentale per determinare con precisione la quantità di proteine ​​ricostituito e lavorare a bassa P / L&#39;s, in un regime di diluizione Poisson. Questo è idealmente ottiene determinando una completa analisi delle proteine ​​di titolazione per identificare il regime ottimale per lavorare. Determinazione della massa del complesso attivo tenda &quot;&gt; L&#39;analisi descritta sopra assume che la stechiometria del complesso attivo è noto e la proteina ricostituita è pienamente attivo. Tuttavia, per nuovi preparati questi quantitativi non essere noti a priori. In questo caso è possibile determinare direttamente tali parametri misurando la f 0 &#39;s in proteine ​​diverso da rapporti di lipidi <img alt="Equazione 13" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq13.jpg" /> dove p è la densità di proteine, <img alt="Equazione 14" fo:content-width=".65in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq14.jpg" /> , Ρ è il numero di liposomi per massa di lipidi, N A è il numero di Avogadro, M P è la massa del complesso canale funzionale e φ è la frazione di proteine ​​attive. Con il montaggio del determinato sperimentalmente f 0 &#39;s in vari proteine ​​per i rapporti lipidi è possibile determinare p 0, e quindi M P e φ. Una frazione finita di liposomi è refrattario alla incorporazione La derivazione della velocità di trasporto unitario presuppone che ad alta P / L&#39;s tutti liposomi conterranno almeno una proteina di trasporto attivo. Tuttavia, in alcuni casi non è risultato essere il caso: ad alta P / L&#39;s una frazione significativa di liposomi rimane refrattario alla ricostituzione di alcune proteine ​​11-13,17. Mentre l&#39;origine di questo fenomeno non sono chiare è concepibile che le proteine ​​più grandi possono essere esclusi da vescicole con raggi piccole riducendo così il numero di liposomi disponibili. In questo caso Equazione 10 deve essere modificata per: <img alt="Equazione 15" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq15.jpg" /> dove θ è la frazione di liposomi refrattari a Protein incorporazione. È importante sottolineare che, ρ e φ sono influenzati anche dal metodo ricostituzione poiché diverse procedure avranno diversi recuperi di lipidi e proteine ​​durante liposomi ricostituzione e la formazione. Assumendo 100% di resa per entrambi porterà ad un mis-stima γ. Pertanto, per ottenere una quantificazione precisa del fatturato unitario / conduttanza è importante determinare sperimentalmente la frazione di lipidi e proteine ​​perso durante la ricostituzione 8,11. Orientamento delle proteine ​​ricostituite Una delle ipotesi formulate durante l&#39;analisi è che tutte le proteine ​​ricostituiti sono funzionalmente equivalenti. Tuttavia, molti canali e trasportatori hanno preferito le direzioni di trasporti, un fenomeno noto come la rettifica. Questa asimmetria funzionale potrebbe portare ad un errore di stima del tasso di turnover. Inoltre, l&#39;orientamento delle proteine ​​ricostituite è a priori </em&gt; casuale, in modo che il tasso di rotazione unitaria misurata è la media ponderata dei tassi della proteina durante il funzionamento in avanti o all&#39;indietro. Diversi metodi possono essere usati per determinare l&#39;orientamento delle proteine ​​ricostituite, ad esempio misurando la frazione di un tag che è scindibile dalla soluzione extraliposomal o misurando la sidedness della reattività di un singolo residuo di cisteina introdotta in una regione solubile accessibili . Infine, è possibile aggirare questo problema funzionalmente tacere una delle due popolazioni utilizzando inibitori lato o da attivare selettivamente solo proteine ​​in un orientamento tramite l&#39;aggiunta di attivare composti a lato solo o impostando la tensione transmembrana a valori opportuni utilizzando K + gradienti, per i canali e trasportatori che sono legame- o voltaggio-dipendente. Considerazioni sulla formazione dei liposomi stretti Uno dei fattori chiave che consentono l&#39;uso of dosaggio efflusso qui descritto è la formazione di liposomi stretti. Tre variabili importanti da considerare a tal fine sono la scelta del detersivo utilizzato per solubilizzare la proteina, la strategia detergente rimozione e la scelta della composizione lipidica dei liposomi. Nel protocollo qui presentato, CLC-EC1 viene solubilizzato in Decyl-Maltopyranoside (DM), un detergente con una elevata concentrazione micellare (CMC) valore critico che è quindi facilmente rimosso. Tuttavia, una varietà di detergenti sintetici e naturali sono stati utilizzati per purificare proteine ​​che successivamente ricostituiti in liposomi stretti senza effetti sulla tenuta delle vescicole. Questi detergenti hanno una vasta gamma di CMC, alto come millimolare (come DM o Digitonin) ed a partire da micromolare (come Dodecyl- Maltopyranoside (DDM) o dioctylpropane-bis-maltopyranoside (DMNG)). È importante notare, tuttavia, che i lipidi utilizzati per formare i liposomi vengono solubilizzati mediante CHAPS, o un&#39;altra detergente delicato, E quindi le micelle ibridi risultanti dalla miscela di proteine ​​e lipidi possono avere chimico-fisiche diverse da quelle dei detergenti madri. È quindi possibile che in alcuni casi la rimozione del detersivo residuo che potrebbero destabilizzare i liposomi che portano a perdite più pronunciati. Per aggirare questo problema è opportuno studiare strategie di rimozione detergente alternative, come biobeads 12,13, colonne di rotazione 15 o gel filtrazione 18. Infine, la composizione lipidica delle vescicole è un parametro importante come miscele specifici potrebbero essere permeabile ai diversi ioni in determinate condizioni. Ad esempio, liposomi formata da E. estratto lipidico polare coli sono stretti a Cl - a pH acido di ma diventano progressivamente più permeabile il pH aumenta 19 o liposomi formati da una miscela 3: 1 di 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidil-etanolammina (PAPA) e 1-palmitoyl- 2-oleoile fosfatidilglicerolo (POPG) Visualizzare una permeabilità molto inferiore a H + di quelle formate da E. coli lipidi polari estrarre 20. È importante notare, tuttavia, che la composizione lipidica delle vescicole potrebbe anche influenzare l&#39;attività della proteina 13,21,22 ricostituito. Pertanto, è importante determinare con precisione le proprietà delle vescicole privi di proteine ​​preparati in ogni condizione, quindi di valutare come questo influenza le proprietà della proteina ricostituito. Generalizzazione ai canali non CLC-tipo e trasportatori Il saggio efflusso, come qui descritto, può essere utilizzato direttamente per determinare le proprietà di singola molecola di qualsiasi Cl - canale -selettivo o trasportatore, e ad esempio è stato usato per caratterizzare le proprietà del Ca 2+ -activated Cl - canale TMEM16A 12 . Ora discutiamo come adattare il dosaggio efflusso di indagare le proprietà dei trasportatori o channels che non sono Cl - selettiva e / o hanno tassi di trasporto unitari che sono significativamente diversi da ~ 10 3 ioni sec -1 di CLC-EC1. Il caso più semplice è che la proteina in esame è anione-selettiva. In questo caso l&#39;unica regolazione necessaria è la sostituzione del Ag: Elettrodo AgCl con un disponibile in commercio una selettività del caso, come è stato fatto per la F - Flucs -selettivo e CLCs 16,23,24 o I - canali permeabili quali CFTR 15 . Se, invece, la proteina ricostituita è selettiva per i cationi, uno ionoforo diverso valinomicina deve essere utilizzato per avviare efflusso. Data la scarsità di convalidato Cl - Ionofori sostituto utile è un H + ionoforo, come carbonile cianuro 4- (trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP). In questo caso è importante assicurare che il pH intravesicular viene mantenuta costante, per esempio aumentando il buffercapacità della soluzione interna ing. Una strategia alternativa è quella di seguire catione efflusso attraverso un canale o trasportatore ricostituito utilizzando protoni come controione e monitoraggio H + trasporto utilizzando un pHmetro 25 o un raziometrica pH-sensibili sonda 26. Tuttavia, la natura indiretto di queste misurazioni rende quantificazione delle proprietà di trasporto della proteina ricostituito difficile. Infine, elettrodi selettivi per un numero di cationi esistono e sono disponibili in commercio. Un terzo scenario è che la proteina in esame è permeabile sia anioni e cationi, ad esempio un canale poco selettiva 13 o un catione / Cl - cotransporter. In questo caso, i liposomi ricostituiti non mantengono un gradiente KCl durante il processo di scambio soluzione (passaggi 5,4-5,5) in modo che perdono il loro contenuto di sale. Pertanto in questo caso tutte le informazioni cinetica viene persa. Tuttavia, la frazione di liposomi contenenti almeno un prot attivaein, f 0, può ancora essere determinato aggiungendo il detersivo e misurando il residuo intrappolato Cl - contenuto (passo 6,8). Questo consente la determinazione della massa molecolare della proteina effettuando una titolazione proteine ​​e utilizzando l&#39;equazione 10. Un altro aspetto da considerare è la possibilità che velocità di trasporto unitaria della proteina ricostituita è ordini di grandezza diversa da quella di CLC-EC1. Ad esempio, la maggior parte dei trasportatori hanno tassi di turnover di 1-10 sec -1, 2-3 ordini di grandezza inferiori a CLC-EC1, mentre la maggior parte dei canali di ioni condotta a 10 6 -10 7 sec -1, 3-4.000 volte più veloce di CLC -ec1. Per trasportatori rallentare il tasso di Cl - perdite da liposomi privo di proteine ​​può diventare limitante, come il suo peso relativo nel processo d&#39;efflusso aumenta al diminuire dei tassi di trasporti della proteina. Nella nostra esperienza il tasso di perdita varia leggermente da preparazioni ed è solitamente dell&#39;ordine di unpochi secondi ion -1. Pertanto, quando si lavora con trasportatori lenti è consigliabile preparare privo di proteine ​​liposomi affiancati a ciascun ricostituzione per misurare accuratamente la perdita corrispondente a ciascun lotto di vescicole. Il saggio efflusso è stato utilizzato con successo per determinare il tasso unitario dei trasportatori lenti con tassi di turnover intorno 1-10 ion sec -1, come ad esempio un cianobatteri CLC 27. La situazione opposta si verifica quando la proteina ricostituito ha un&#39;alta conducibilità, ad esempio un canale ionico. In questo caso le cinetiche di efflusso sono troppo veloci da risolvere come il tempo di miscelazione (~ 1-2 sec) e il tempo di risposta intrinseca della elettrodo di registrazione diventato tasso limitativo. In questo caso, le informazioni cinetica viene perso, ma la massa del complesso attivo può ancora essere determinato 24. Vale la pena notare che anche altri approcci, come registrazioni planare doppio strato lipidico o liposomi patch di bloccaggio sono più adatti per studiare i canali ionici purificati come questi terie fornire direttamente informazioni singola molecola con elevata risoluzione temporale.

Negli ultimi due decenni la capacità di iperespressione e purificare proteine ​​di trasporto di membrana è drammaticamente aumentato: i canali ionici, trasportatori primari e secondari sono ormai di routine purificati da sistemi di espressione eterologhi e fonti naturali. Nuovi approcci per monitorare l&#39;espressione, di migliorare e facilitare l&#39;estrazione e migliorare la stabilità di queste proteine ​​sono in continua evoluzione 1-5. Queste innovazioni tecnologiche sono state fondamentali per innescare l&#39;esplosione di livello atomico informazioni sulla struttura delle proteine ​​di membrana che, a sua volta, migliorato la nostra comprensione delle basi strutturali della loro funzione. Al contrario, la nostra capacità di sondare le proprietà funzionali delle proteine ​​purificate non aumenta alla stessa velocità, in modo che in alcuni casi alta risoluzione informazione strutturale è accompagnato da dati qualitativi funzionali, limitando così la possibilità di verificare quantitativamente predizioni basati sulla struttura. Quindi, la SVILUPPOt di saggi funzionali quantitativi e generalizzabili è un passo fondamentale verso la delucidazione delle basi meccanicistiche della funzione delle proteine ​​di membrana. Qui si descrive un saggio di efflusso che può essere usato per determinare quantitativamente importanti proprietà funzionali purificati e ricostituiti Cl - canali e trasportatori. I principi alla base del dosaggio può essere generalizzati ad una varietà di sistemi di trasporto, nonché proteine ​​non-ionici trasporto. I liposomi vengono ricostituiti con purificati Cl - canale / trasportatori in presenza di un grande Cl - gradiente (Figura 1A, B). Cl - efflusso viene avviata mediante l&#39;aggiunta di uno ionoforo per consentire flusso contro-ione, nel nostro caso il K + ionoforo valinomicina, che shunt la tensione stabilita dal Cl - gradiente e impostare il potenziale di membrana iniziale al potenziale di equilibrio di K + 6,7. Senza tegli ionoforo significative netto Cl - verifica efflusso, in quanto è impedita dalla generazione di un potenziale transmembrana. I dati sono quantitativamente descritto da due parametri misurabili (Figura 1C): τ la costante di tempo di Cl - efflusso, e f 0, la frazione di liposomi contenenti una proteina attiva. Da τ e f 0 unitario Cl - velocità di trasporto, la frazione di proteine ​​attive e la massa molecolare del complesso attivo possono essere derivate 8. La tecnica è illustrata qui utilizzando proteoliposomi ricostituiti con CLC-EC1, un ben caratterizzato CLC-type H + / Cl - scambiatore di struttura e funzione nota. Questo saggio è facilmente generalizzabile a canali o trasportatori con selettività ionica differente o la cui attività dipende dalla presenza di tensione e / o leganti. Inoltre, questo test può essere utilizzato per determinare se piccole molecole influenzano direttamente la proteina ricostituito,per quantificare gli effetti di questi composti e come composizione membrana o reagenti ipolipemizzanti influiscono sulla funzione dei canali ricostituiti e trasportatori.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="995">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:337px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:337px;">&#160;Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>610200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IEC Centra CL2 Benchtop</td>
			<td style="width:337px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>These can be found on Ebay.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Non-functional pH probe</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160; DI-710 Data Logger</td>
			<td style="width:337px;">DATAQ instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WinDAQ acquisition software</td>
			<td style="width:337px;">DATAQ instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml</td>
			<td style="width:337px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td>29922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:337px;">Kimble Chase</td>
			<td>73500-13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extruder Set With Holder/Heating Block</td>
			<td style="width:337px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proteoliposome-based efflux assay to determine single-molecule properties of cl- channels and transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

Descriviamo un protocollo dettagliato e robusto per misurare Cl - il trasporto mediato da purificato CLC-EC1, un procariotico CLC-tipo H + / Cl - scambiatore, ricostituito in liposomi. Una rappresentazione schematica dell&#39;esperimento è mostrato in Figura 3 proteoliposomi ricostituiti con purificato CLC-CE1 e con alta Cl interna -. Sono immersi in una soluzione bagno contenente bassa Cl -. In queste condizioni net Cl - efflusso è impedita dalla accumulo di carica positiva in liposomi (Figura 3A). Aggiunta di Valinomicina permette K + per spostarsi attraverso la membrana manovra così il potenziale elettrico e avviare Cl - efflusso (Figura 3B). L&#39;andamento nel tempo del flusso è controllata mediante un Cl - elettrodo -selettivo e la quantità totale di Cl - contenuta nelle vescicole viene misurata direttamente solubilizzando utilizzando detergente. Da questeesperimenti bulk è possibile determinare le proprietà delle proteine ​​ricostituite singole, come turnover, stechiometria del complesso attivo e frazione di proteina attiva. Utilizzando Equazioni 7-9 per adattarsi al corso tempo di efflusso e stimare la velocità di trasporto unitario di CLC-EC1 troviamo che τ (0.2 mcg / mg) = 41 sec e f 0 (0.2 mcg / mg) = 0,31, indicando che ~ 1 / 3 dei liposomi contiene 0 proteine ​​attive. Da questi valori si calcola che il tasso di trasporto unitario è γ ~ 2500 Cl - sec -1, in buon accordo con i valori pubblicati 8,14. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52369/52369fig1.jpg" /> Figura 1: Cl - saggio efflusso (A - B) Rappresentazione schematica del Cl - saggio -efflux per liposomi privo di proteine ​​(A) o CLC-EC1.vescicole ricostituite (B). (C) decorso simulato di ionophore avviati Cl - efflusso da proteoliposomi (nero) o liposomi privo di proteine ​​(linea tratteggiata grigia). Efflux viene iniziata mediante aggiunta di ionoforo (*) e termina con l&#39;aggiunta di detergente per dissolvere liposomi (^). Linea rossa tratteggiata rappresenta una misura esponenziale per determinare la costante di tempo, τ, di Cl -. Efflusso da liposomi contenenti almeno 1 copia attiva del CLC-EC1 ed f 0 è la frazione di liposomi contenenti 0 proteine ​​attive <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52369/52369fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per visualizzare un grande versione di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52369/52369fig2.jpg" /> Figura 2: Registrare istituito (A) La registrazione istituito.. (B) Primo piano delle camere. &lt;a href = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52369/52369fig3.jpg" /> Figura 3: trace campioni e analisi (A) tipica V (t) tracce di esperimenti di efflusso da proteoliposomi ricostituiti con WT CLC-EC1 a 0.2 mcg / mg P / L.. Le frecce indicano i tempi di aggiunta dell&#39;impulso KCl calibrazione, liposomi, valinomicina e β-OG. Le linee tratteggiate indicano i valori di ΔV in varie fasi. (B) V (t) viene convertito in traccia Cl (t) usando l&#39;equazione 5, normalizzati utilizzando Equazione 6 e il tempo di efflusso corso è opportuno Equazione 7 (linea rossa tratteggiata). (C) normalizzati efflusso corsi tempo proteoliposomi ricostituiti con WT CLC-EC1 a 0.2 mcg / mg P / L (nero) o al 5 mcg / mg P / L (grigio). Linea tratteggiatas sono più adatte dei corsi tempo di efflusso all&#39;equazione 7.

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A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay per determinare le proprietà singola molecola di Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canali e trasportatori

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

9.7K Views.  Weill Cornell Medical College. Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

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Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

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In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

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The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Un test di screening a fluorescenza per l&#39;identificazione di modulatori Canali GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Studiare Looping DNA a singola molecola FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Misura e Analisi di extracellulare Acido prodotte per determinare glicolitica Tasso

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...