Vorremmo ringraziare Ying Yu per Apc Min / + topi genotipizzazione. Questo studio è stato sostenuto da fondi provenienti da INSERM e sovvenzioni (CA057621 e AI053194) dal National Institutes of Health.

NOTA: Tutti gli esperimenti su animali sono stati condotti in conformità con le procedure approvate dalla cura e uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC), UCSF. Tutti gli esperimenti di imaging sono procedure non-sopravvivenza e gli animali sono stati sacrificati immediatamente successivo alla fine della acquisizione delle immagini. 1 Generazione di topi NOTA: Apc Min / + topi, che trasportano una mutazione sul gene Apc, sviluppano spontaneamente 50-100 adenomi nel piccolo intestino. <ol><li> Croce Apc Min / + topi con la linea ACTB-ECFP, che esprime ECFP sotto il promotore actina, e in seguito con la linea c-fms-EGFP, che esprime EGFP sotto il c-fms promotore per rilevare le cellule mieloidi. Animali eterozigoti per ACTB-ECFP e c-fms-EGFP sono utilizzati per rilevare la fluorescenza. </li><li> Utilizzare i topi a 3-4 mesi di età per immagine adenomi chiaramente rilevabili. </li></ol> 2 Preparazione di Materiali prima dell&#39;intervento chirurgico NOTA: I dettagli del microscopio set-up sono stati precedentemente descritto 6,7. <ol><li> Microscopio <ol><li> Accendere la coperta di riscaldamento. Accendere il laser ad argon per 488 nm di eccitazione e lo stato solido 405 nm, 561 nm e 640 nm laser. Accendere il microscopio, la centralina disco rotante, la AOTF, l&#39;unità di controllo laser, e il controller della telecamera. </li><li> Aprire l&#39;otturatore microscopio, che trasforma il LED rosso. Accendere il software per computer e la macchina fotografica. </li></ol></li><li> Imaging Platform <ol><li> Assicurarsi che l&#39;inserto fase è pulito. In caso contrario, pulire con acqua e sapone e poi asciugare. </li><li> Prendete due coprioggetto e utilizzare il nastro di laboratorio per garantire la loro sull&#39;inserto. Collocare l&#39;inserto sul palco e pulirlo con cotone imbevuto di alcol. </li><li> Con del nastro di laboratorio, fissare la coperta di riscaldamento sul lato destro del palco. </li><li> Verificare l&#39;integrità della membrana in gomma sul cono naso e cambiarlo se necessary. Posizionare e fissare il cono per la consegna anestesia isoflurano per l&#39;animale utilizzando una garza e nastro di laboratorio. </li></ol></li><li> Isoflurano Anestesia sistema <ol><li> Riempire il serbatoio isoflurano. </li><li> Accendere il vuoto e regolare a 1,2 L / min. </li><li> Aggiungere acqua distillata per il nebulizzatore e collegare il nebulizzatore al sistema di isoflurano. </li><li> Accendere l&#39;analizzatore di ossigeno e collegarlo al sistema di isoflurano. Accendere la bombola di ossigeno e assicurarsi che l&#39;analizzatore di ossigeno mostra 100%. Regolare il flusso di O 2 a 0,2 L / min. </li><li> Accendere il serbatoio di azoto e regolare il flusso a 0,8 L / min. Accertarsi che l&#39;analizzatore di ossigeno mostra 21%. </li></ol></li><li> Preparazione di strumenti di chirurgia e Platform <ol><li> Pulire le 2 coppie di pinze e forbici dissezione con acqua e sapone. </li><li> Accendere il tallone sterilizzatore caldo e lasciarlo raggiungere i 250 ° C. Sterilizzare gli strumenti di chirurgia per 30 sec. Lasciateli raffreddare. </li><li> Posizionare un soaker laboratorio in panchina chirurgia. </li><li> Utilizzare un coperchio di polistirolo come piattaforma chirurgica. Coprire con un pezzo di laboratorio soaker. Preparare un secondo pezzo di laboratorio soaker a cambiare dopo la rasatura con il mouse. </li><li> Posizionare il cono con la linea di anestesia sul coperchio di polistirolo coperto, e collegarlo al coperchio di polistirolo (non sul soaker laboratorio) con del nastro e usare due aghi su entrambi i lati del cono per tenerlo in posizione. </li><li> Assemblare betadine, cotone imbevuto di alcol, garze sterili, colla super, vetrini da microscopio, rasoio elettrico, e 4 pezzi di nastro di laboratorio. </li></ol></li></ol> 3 Preparazione di iniezioni <ol><li> Sotto il cofano, preparare una siringa da insulina (28 G x ½ in) con 7 ml di brodo AF647-coniugato Ly-6G (Gr1) anticorpo (1 mg / ml) in 100 ml di 2.000 kDa rodamina-destrano (4 mg / ml ) per iniezione retro-orbitale. Iniezione retro-orbitale è raccomandato in Apc Min / + topi in quanto l&#39;anemia che si sviluppa in questi animali rende la vene coda difficult per rilevare attraverso la pelle. </li><li> Preparare una seconda siringa da insulina con 1 mg / kg di atropina diluito in 150 microlitri di PBS per via sottocutanea (sc) iniezione prima di imaging per smorzare i movimenti peristaltici dell&#39;intestino. </li></ol> 4 Preparazione della Intestino for Imaging <ol><li> Verificare che la linea di anestesia per la camera di induzione è aperta, e le linee al tavolo operatorio e il microscopio sono chiusi. </li><li> Trasferire l&#39;animale alla camera di anestesia. Chiudere la camera di anestesia e accendere il isoflurano al 4% (con il 21% O 2). </li><li> Quando il mouse respira profondamente e lentamente (dopo 5-6 min), trasferirlo alla fase chirurgica sul suo fianco e iniettare la soluzione di anticorpi Gr1 e / o soluzione di destrano retro-orbitale. </li><li> Aprire la linea anestesia collegati alla piattaforma chirurgica. Chiudere la linea alla camera di anestesia e mettere il mouse sulla sua schiena con il naso nel cono anestesia. </li><li> Ridurre l&#39;isofluranoconcentrazione dal 4% al 2,5%. </li><li> Verificare che il mouse è ben anestetizzato pizzicando la sua zampa e test del riflesso corneale. </li><li> Aggiungi oftalmico lubrificante unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Fissare le membra del mouse per la fase chirurgica con l&#39;aggiunta di nastro laboratorio. </li><li> Rimuovere il pelo dalla superficie ventrale utilizzando un rasoio elettrico. Rimuovere anche i capelli dalla arto posteriore sinistro per posizionare il saturimetro prima dell&#39;acquisizione. Rimuovere il soaker laboratorio dalla fase chirurgica e sostituirlo con uno pulito per evitare la contaminazione dei capelli. </li><li> Disinfettare la superficie ventrale con cotone imbevuto di alcol e betadine. </li><li> Iniettare la soluzione di atropina (da 3.2) SC in un fianco del mouse. </li><li> Fai da 1 cm ventrale incisione mediana attraverso la pelle e il peritoneo da utilizzando forbici e un paio di pinze. Estrarre delicatamente 3-4 cm di intestino e di individuare uno o più tumori all&#39;immagine. </li><li> Prendete un bicchiere microscope scivolo e la posizione un&#39;ansa dell&#39;intestino su di esso con un tumore in alto. </li><li> Aggiungete un po &#39;di colla super per un paio di posizioni lungo l&#39;intestino per fissarlo alla diapositiva. Attendere un minuto per asciugare la colla. Usare un pennarello per disegnare una linea nella diapositiva che punta al tumore, al fine di agevolarne la localizzazione con il confocale. </li></ol> 5 Posizionamento del mouse sullo stage e preparazione per Image Acquisition <ol><li> Rimuovere il nastro di laboratorio dalle membra. </li><li> Aprire la linea di anestesia alla fase microscopio e chiudere quello alla piattaforma chirurgica. </li><li> Trasferire il mouse con attenzione alla fase microscopio con il lato ventrale verso il basso e il naso nel cono di naso. Fissare la linea di anestesia con del nastro di laboratorio. </li><li> Ri-posizionare il mouse e / o la slitta in modo da avere l&#39;intestino al centro di una delle finestre di copertura-scivolato. Nastro delicatamente il vetrino con nastro di laboratorio. </li><li> Fissare la sonda saturimetro per l&#39;arto sinistro del mouse perseguire il suo cuore e livelli di frequenza e di saturazione di ossigeno arterioso respiratorie. </li><li> Coprire il mouse con la coperta di riscaldamento per evitare l&#39;ipotermia. </li><li> Diminuire la concentrazione di isoflurano dal 2,5% al ​​1-1,5% per l&#39;imaging. </li></ol> 6 Acquisizione di immagini mediante μManager Software <ol><li> Aumentare la velocità CSUX a 2.500 giri per migliorare la qualità dell&#39;immagine nelle impostazioni di configurazione. </li><li> Utilizzare il menu a discesa Obiettivo per scegliere 10X 0.5 NA o 20X 0,75 NA Fluar lente dell&#39;obiettivo. </li><li> Scegli il laser 405 nm dal menu a tendina colore. </li><li> Fare clic su Live e regolare la messa a fuoco con il microscopio. </li><li> Fare clic su Automatico per regolare automaticamente le intensità massime e minime in pixel dell&#39;immagine del display in base ai valori dei pixel estremi dell&#39;immagine. Un istogramma di intensità dei pixel dell&#39;immagine display è presentato nel grafico nella parte inferiore della finestra principale. </li><li> Regolare l&#39;esposizione della fotocamera nella finestra Pannello di controllo Piper dacambiando il numero di orologi (Un orologio è 33,333 msec). </li><li> Se il segnale è troppo luminosa con l&#39;esposizione più bassa, diminuire l&#39;intensità del laser con l&#39;unità di controllo del microscopio. </li><li> Verificare l&#39;intensità del segnale di 488 nm, 561 nm e 640 nm linee laser. Regolare intensità del laser con propria unità del laser di controllo (488 nm e 561 nm) o l&#39;unità di controllo del microscopio. </li><li> Nella finestra Multi D Acquisizione, selezionare la casella punti di orario e digitare il numero di punti di tempo e l&#39;intervallo di tempo desiderato. </li><li> Selezionare la casella di Z-stack, scegliete &quot;Z relativo&quot; e definire Z-start e Z-end rispetto alla posizione attuale. NOTA: Per 10X o 20X obiettivo, iniziare con 3 piani Z, 8 micron o 4 micron a parte, rispettivamente. </li><li> Selezionare la casella posizioni multiple (XY) per l&#39;imaging diverse località, quindi fare clic su Modifica elenco posizione, segnare 4-6 posizioni diverse. </li><li> Selezionare la casella Canali e aggiungere canali da New e selezionare laser linee dal menu a discesa e tipe in esposizione per ogni canale (in multipli di 33.333 msec). </li><li> Controllare Salvare le immagini nella finestra &quot;acquisizione Multi D&quot;. </li><li> Selezionare una cartella e tutte le immagini acquisite vengono salvate automaticamente in questa cartella con il prefisso del nome dato. NOTA: Ogni continua acquisizione verrà salvato in una sottocartella separata come file TIFF individuali per ogni fetta Z in ogni colore in ogni punto. </li><li> Salvare tutte le impostazioni, fare clic su Salva impostazioni nella finestra Multi D acquisizione. </li><li> Fare clic su Acquisisci nella finestra Multi-dimensionale di acquisizione per avviare l&#39;acquisizione. </li><li> Se la sonda ossimetro non è utilizzato o smette di funzionare bene (quando l&#39;impulso non è stabile o difficile da individuare), controllare l&#39;efficienza di anestesia ogni 15 minuti durante la procedura di imaging pizzicando la zampa e il controllo del riflesso corneale. Regolare i anestesia se il mouse è sensibile a questi stimoli. </li><li> Dopo l&#39;acquisizione, eutanasia il mouse aumentando la concent isofluranorazione al 5%. Quando non movimenti respiratori sono rilevabili, togliere il mouse dal palco ed eseguire una dislocazione cervicale. </li></ol> 7 Analisi di immagini mediante Imaris Software <ol><li> Conversione in .ims file (supplementari Figura 1A) <ol><li> Aprire il software della fotocamera, fare clic su File quindi Batch Converter. </li><li> Fare clic su Aggiungi file e selezionare il primo file della prima posizione. Ripetere l&#39;operazione per ciascuna posizione. </li><li> Per ogni file caricato, fare clic su Impostazioni e verificare che le impostazioni &quot;T&quot; per il tempo, &quot;c&quot; per i canali e &quot;z&quot; per Z-stack appaiono in questo ordine. </li><li> Salva nella cartella desiderata. Sfoglia e creare un nuovo file convertito. </li><li> Fare clic su Imposta per tutti e Start. </li></ol></li><li> Regolazioni (complementare Figura 1B) <ol><li> Andate nella cartella convertito specifica e aprire il primo file. </li><li> Nella finestra di regolazione del display, regolare il fondosegnale cutoff modificando il numero minimo per ciascun canale, se necessario. </li><li> Se necessario, regolare l&#39;intensità del segnale modificando il numero massimo (minore è il numero massimo, maggiore è l&#39;intensità del segnale). NOTA: Le regolazioni del segnale intensità / contrasto consentono il punto culminante di un comportamento cellulare o di un vano in modo da avere una visualizzazione più piacevole. Questo non cambia il risultato stesso. </li><li> Fare clic su Modifica e proprietà immagine. </li><li> Modificare le x, y, z e valori (per un obiettivo 10X, x e y = 0,712, z = 8 micron, per un obiettivo 20X: x e y = 0.36, z = 4 micron). </li><li> Clicca su tutti equidistanti per regolare punti di tempo. Aggiungere la data di inizio e l&#39;ora di acquisizione iniziare. Aggiungere la data di fine e la fine di acquisizione (complementare Figura 1C). </li><li> Fare clic sul pulsante Play per guardare il film. </li><li> Fare clic su Modifica e Elimina punti di tempo per cancellare le immagini sfocate. </li><li> Per unire due acquisizioni separate Together in un film, andare all&#39;ultimo punto di volta del primo film e fare clic su Modifica&gt; Aggiungi punti di tempo per aggiungere il secondo file. </li></ol></li><li> Salvataggio di un filmato (complementare Figura 1D) <ol><li> Fare clic su Masterizza, selezionare l&#39;estensione mov e un fattore di compressione di 0. </li><li> Fare clic su Salva. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In questo lavoro, un protocollo dettagliato è descritto per la filatura del disco confocale delle dinamiche di cellule mieloidi in tumori intestinali per diverse ore in un animale vivo, ripresa dal lato sierosa dell&#39;intestino. Per evitare l&#39;infiammazione e di avere condizioni fisiologiche ottimali, imaging dell&#39;intestino deve essere fatto sull&#39;organo intatta. Tuttavia, l&#39;imaging dal lato sierosa dell&#39;intestino è impegnativo, poiché la luce deve passare attraverso diversi strati di tessuto come il muscolo liscio prima di raggiungere l&#39;epitelio. Concentrandosi sul epitelio può essere difficile in alcune aree, in particolare nel actina-ECFP giornalista topi dal actina è altamente espresso dalle cellule muscolari lisce. Sebbene microscopia a due fotoni ha il vantaggio di una più profonda penetrazione nei tessuti rispetto ai microscopi confocali, abbiamo trovato che il microscopio confocale filatura disco è abbastanza potente per ottenere una buona visualizzazione della struttura epiteliale intestinale. I vantaggi omicroscopia disco f filatura includono la capacità di acquisizione molto rapida e sensibilità unica, senza sacrificare la risoluzione confocale. Queste qualità permettono l&#39;osservazione di processi dinamici, anche se alcuni punti di tempo devono essere cancellati a causa di artefatti da movimento, ridurre al minimo fotodanneggiamento, e consentire l&#39;imaging di molecole relativamente debolmente fluorescenti. Imaging intestino dal lato sieroso può essere difficile a causa dei movimenti peristaltici endogeni di questo organo. In questo protocollo, una iniezione sottocutanea di atropina è dato prima di imaging, e diminuisce in modo efficiente il movimento. Tuttavia, è importante notare che il movimento peristaltico è più estesa nell&#39;intestino crasso, ma non è ben inibita mediante trattamento atropina, rendendo l&#39;imaging abbastanza difficile in questa parte dell&#39;intestino. Lo strato di muscolatura liscia del colon è un po &#39;più prominente c ompared al piccolo intestino e sembra essere più contrattile. Pertanto,è quasi impossibile mettere a fuoco l&#39;epitelio nei topi reporter actina-ECFP. Inoltre, in aggiunta a questi movimenti endogeni, organo deriva può verificarsi, ma in questo caso la correzione della deriva posteriore può essere eseguita utilizzando il software della fotocamera. Un&#39;altra grande sfida in esperimenti di imaging invasive è quello di mantenere vivo e sano il più a lungo possibile in anestesia il mouse. L&#39;intestino è raggiunto aprendo la cavità peritoneale. Quindi la procedura è più invasivo rispetto a quello utilizzato per l&#39;imaging del tumore mammario, che può essere fatto per un massimo di 40 ore a causa della integrità del peritoneo. L&#39;acquisizione massimo fatto con la cavità peritoneale aperto è stato di 6 ore, ma il mouse era ancora in vita, con evidenti segni di sofferenza, quindi, anche l&#39;acquisizione più lungo può essere fattibile. In questo studio il comportamento delle cellule mieloidi può essere seguita e analizzata all&#39;interno del tumore intestinale utilizzando topi transgenici fluorescenti e anche coniugato a un fluorocromo tpiloti o anticorpi. Questo approccio può essere utilizzato anche per osservare altri tipi di cellule, come Tregs, cellule dendritiche o fibroblasti utilizzando Foxp3-EGFP o CD11c-DTR-EGFP, o Fsp1-EGFP topi reporter, rispettivamente, come è stato utilizzato per lo studio del tumore mammario 6 . Inoltre, anticorpi fluorescenti contro altre popolazioni cellulari di neutrofili possono essere iniettati iv Inoltre, il comportamento delle cellule può essere analizzata in diverse condizioni, quali ipossia. Tali esperimenti possono fornire nuove informazioni sul comportamento di queste cellule dello stroma dopo il trattamento con la chemioterapia o terapia mirata. Infine, questo protocollo può essere utilizzato in altri modelli murini di cancro intestinale e in diversi stadi di progressione tumorale. Apc Min / + topi sviluppano solo i polipi adenomatosi intestinali, che non progredire di malignità, perché i topi hanno una vita più breve. Sarà interessante studiare la dinamica delle cellule mieloidi in altri modelli di cancro intestinale con più aggtumori ressive e invasivi, come i topi portatori di mutazioni in K-ras 19-21 o Smad4 22 geni, oltre alla mutazione APC.

Prove schiaccianti ora dimostra che il microambiente tumorale, costituito da popolazioni cellulari eterogenee, inclusi i fibroblasti, cellule endoteliali, cellule immunitarie e infiammatorie, matrice extracellulare e fattori solubili, svolge un ruolo cruciale nella iniziazione e progressione dei tumori solidi contribuendo a quasi tutti caratteristiche di cancro 1. Infatti, durante la progressione del tumore, ci sono costanti interazioni dinamiche tra cellule tumorali trasformate e le cellule stromali che si evolvono per generare un microambiente favorevole alla malignità 2. Tra le cellule immunitarie che infiltrano il microambiente tumorale, le cellule mieloidi sono i più abbondanti 3. Composto da macrofagi associati al tumore (TAM), derivati ​​da cellule mieloidi soppressore (MDSCs), cellule dendritiche (DC) e neutrofili (PMN), le cellule mieloidi sono reclutati dal midollo osseo e progressivamente si infiltrano i tumori, rilasciando citochine, fattori di crescita e proteasi che può promuoverela crescita del tumore e la diffusione 4. Il crosstalk tra le cellule tumorali e le cellule mieloidi è complessa ma dinamica. Così la comprensione della natura delle loro interazioni è fondamentale per determinare il motivo per cui queste cellule favoriscono la progressione del cancro, invece di partecipare a una risposta immunitaria anti-tumorale, e può aiutare a trovare nuovi obiettivi per controllarlo. L&#39;osservazione diretta al microscopio intravitale fornisce informazioni sulle dinamiche delle cellule all&#39;interno dei tessuti di topi vivi 5. A quattro colori, multi-regione, disco rotante micro-lensed sistema confocale è stato progettato per studiare le cellule stromali all&#39;interno di tumori mammari 6. Questo approccio consente di imaging continuo a lungo termine e comprende diversi vantaggi, come (a) acquisizione immagini rapide per ridurre al minimo gli artefatti da movimento, (b) l&#39;anestesia-lungo termine, (c) l&#39;acquisizione di quattro colori di seguire diversi tipi di cellule, (d) l&#39;etichettatura fluorescente delle diverse componenti tumorali, e (e) l&#39;osservazione di diversi microambienti tumorali within lo stesso mouse per evitare il mouse per variabilità del mouse 7-9. Con questa tecnologia, i comportamenti cellulari diversi sono stati riportati nel virus del tumore mammario (MMTV) promotore-driven polioma middle T oncogene (PyMT) modello che mostra le fasi progressive della tumorigenesi. Regolamentazione linfociti T (Tregs, visualizzati dal transgene Foxp3 EGFP) migrare preferenzialmente in prossimità di vasi sanguigni che il DCS (CD11c-DTR-EGFP), fibroblasti carcinoma-associata (Fsp1 + / + -EGFP) e cellule mieloidi (c-fms -EGFP) presentano elevata motilità alla periferia del tumore rispetto all&#39;interno della massa tumorale. Nella condizione di ipossia sistemica acuta, le cellule migrate in modo diverso: Tregs fermare la migrazione al contrario di cellule mieloidi che continuano a muoversi 6. Inoltre, nello stesso modello di topo, è stato dimostrato che le variazioni di sensibilità doxorubicina con stadio tumorale, distribuzione del farmaco è legato alla risposta ai farmaci, e doxorubicinatrattamento porta al reclutamento CCR2-dipendente delle cellule mieloidi ai tumori. Così, l&#39;imaging dal vivo può essere utilizzato anche per acquisire conoscenze in risposta ai farmaci in situ e la biologia di chemioresistenza 10,11. Poliposi adenomatosi coli (APC) mutazioni del gene comunemente si verificano in adenomi colorettali umani e carcinomi 12 e mutazione di una singola copia dei risultati gene APC nella poliposi adenomatosa familiare (FAP), che conferisce un altissimo rischio di cancro al colon 13. Il ceppo di topi Apc Min / + porta una mutazione troncamento al codone 850 del gene Apc e si sviluppa spontaneamente più adenomi intestinali tutto il piccolo intestino da 14 a 16. A lungo termine intravitale imaging dell&#39;intestino è impegnativo a causa della invasività della procedura, poiché l&#39;apertura della cavità peritoneale è necessaria per l&#39;accesso a livello intestinale. A breve termine l&#39;imaging dal vivo studies sono stati precedentemente pubblicati sulla salute dell&#39;intestino 17,18, ma l&#39;osservazione diretta a lungo termine dei tumori intestinali non è stato riportato. Una procedura chirurgica è stato progettato e perfezionato per visualizzare i tumori attraverso la superficie sierosa dell&#39;intestino, utilizzando il sistema di microscopia a disco rotante intravitale precedentemente utilizzato per i tumori della mammella immagine 6,10. In questo lavoro, un protocollo è descritto che permette di seguire il comportamento delle cellule mieloidi all&#39;interno dei tumori del piccolo intestino utilizzando Apc Min / + topi.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Apc&lt;sup&gt;Min/+&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt; mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>ACTB-ECFP mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>3773</td><td></td></tr><tr><td>cfms-EGFP mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated</td><td>Invitrogen</td><td>D7139</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td>29450</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>UCSF cell culture facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saline Buffer</td><td>UCSF cell culture facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647</td><td>UCSF Monoclonal antibody core</td><td></td><td>Stock 1 mg/ml. Use at 7 &amp;mu;g/mouse</td></tr><tr><td>Atropine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td>Use at 1 mg/kg mouse</td></tr><tr><td>Alcohol wipes</td><td>Becton Dickinson</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>28 G x 1/2 in. insulin syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>329465</td><td></td></tr><tr><td>Remium cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td>24x50-1</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat blanket</td><td>Gaymar Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hot bead sterilizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td>Turn ON 30 min before use</td></tr><tr><td>Cotton tipped apllicators 6-inch</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72310-10</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia system</td><td>Summit Anesthesia Support</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Zeiss Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Stage insert</td><td>Applied Sientific Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ox oximeter, software and sensors</td><td>Starr Life Sciences</td><td>MouseOx</td><td></td></tr><tr><td>Nebulizer</td><td>Summit Anesthesia Support</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;Manager</td><td>Vale lab, UCSF</td><td></td><td>Open-source software</td></tr><tr><td>ICCD camera</td><td>Stanford Photonics</td><td>XR-Mega-10EX S-30</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk confocal sacan-head</td><td>Yokogawa Corporation</td><td>CSU-10b</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time imaging of myeloid cells dynamics in apcmin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy

Cellule mieloidi sono i più abbondanti cellule immunitarie all&#39;interno di tumori e hanno dimostrato di promuovere la progressione tumorale. Le moderne tecniche di imaging intravitale permettono l&#39;osservazione del comportamento cellulare dal vivo all&#39;interno dell&#39;organo, ma può essere difficile in alcuni tipi di cancro a causa di organo e tumore accessibilità, come l&#39;intestino. L&#39;osservazione diretta dei tumori intestinali non è stato segnalato in precedenza. Una procedura chirurgica qui descritta permette l&#39;osservazione diretta delle dinamiche di cellule mieloidi all&#39;interno dei tumori intestinali nei topi dal vivo utilizzando topi transgenici reporter fluorescente e traccianti iniettabili o anticorpi. A questo scopo, è stato utilizzato un quattro-colore, multi-regione, disco rotante microscopio confocale micro-lensed che consente a lungo termine di imaging continuo con l&#39;acquisizione rapida di immagini. Apc Min / + topi che sviluppano più adenomi nel piccolo intestino è attraversato con i topi c-fms-EGFP per visualizzare le cellule mieloidi e con i topi ACTB-ECFPper visualizzare le cellule epiteliali intestinali delle cripte. Sono inoltre descritte le procedure per etichettare diversi componenti tumorali, come i vasi sanguigni e neutrofili, e la procedura per il posizionamento del tumore per l&#39;imaging attraverso la superficie sierosa. Filmati time-lapse compilati da diverse ore dell&#39;imaging consentono l&#39;analisi del comportamento delle cellule mieloidi in situ nel microambiente intestinale.

Utilizzando filatura disco microscopia confocale, tessuti non tumorali e tumorali nel piccolo intestino di Apc Min / +; ACTB-ECFP; topi c-fms-ECFP possono essere visualizzati dalla superficie sierosa. Dopo l&#39;imaging, software della fotocamera viene utilizzato per analizzare e regolare l&#39;acquisizione (Figura supplementare 1). Dopo endovenosa (iv) l&#39;inserimento di fluorescenza 2.000 kDa destrano-rodamina e un anticorpo coniugato Ly-6G 647, vasi sanguigni e PMN possono essere rilevati rispettivamente (Figura 1). Placche di Peyer, che sono aggregazioni di tessuto linfoide e pieno di cellule mieloidi che si vedono facilmente (Figura 1A). Le cripte del piccolo intestino sono circondati da vasi sanguigni e cellule mieloidi (Figure 1A e 1B). Tessuto tumorale è spesso più vascolarizzata e più infiltrato dalle cellule mieloidi, e la struttura delle cripte è inferiore well organizzata (Figura 1A e 1B) a seconda delle dimensioni del tumore. L&#39;acquisizione può essere fatto utilizzando un NA 10X 0.5 (Figura 1A) e 20X 0,75 lenti NA Fluar (Figura 1B), ma abbiamo ottenuto le migliori prestazioni con il 10X 0.5 NA Fluar lente che era luminoso, consentono l&#39;acquisizione di una grande regione (676 x 676 micron) e potrebbe fornire immagini da fino a 70 micron nel tessuto. Lo strato muscolare che esprime actina-ECFP liscia a volte può rendere la messa a fuoco sul epitelio intestinale difficile (Figura 1B, pannello di destra). Cellule mieloidi dinamiche nei tumori possono essere seguiti in tempo reale per un paio d&#39;ore, come indicato nel animato / Video Figura 2. Mentre neutrofili (GR1 cellule +) circolano nei vasi sanguigni e pattugliano i tessuti, altre cellule mieloidi, per lo più macrofagi, circondare le cripte e sono meno mobili (animato / Video Figura 2). Figura 1 foto rappresentativi ottenuti con il disco confocale filatura di tessuti non tumorali e tumorali da Apc Min / + topi. (A) le immagini a quattro colori (10X Fluar, 0.5 lente NA) dell&#39;intestino tenue epitelio dalla superficie sierosa di Apc Min / +; ACTB-ECFP; CFMS-EGFP topo che ha ricevuto iv fluorescente 2.000 kDa destrano-rodamina (rosso) e Ly-6G 647 anticorpo coniugato (bianco). Il pannello di sinistra mostra l&#39;epitelio non-tumorale e il pannello di destra mostra un tumore dallo stesso Apc Min / +; ACTB-ECFP; CFMS-EGFP mouse. Cellule mieloidi sono verdi e le cellule epiteliali sono blu. Un cluster di c-fms cellule + è visto nel tessuto intestinale non-tumorale in una patch di Peyer (freccia bianca), barra della scala = 100 micron. (B) le immagini a quattro colori (20X Fluar, 0.5 NAlente) del piccolo intestino epitelio dalla superficie sierosa di un Apc Min / +; ACTB-ECFP; CFMS-EGFP tumore. Nel pannello di sinistra, parecchi doppio positivi Gr1 + c FMS + cellule vengono rilevati nel tessuto tumorale. Il pannello di destra mostra un quadro dello strato di muscolatura liscia che esprime actina-ECFP che può rendere la messa a fuoco sul epitelio intestinale difficile, barra della scala = 50 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51916/Animated-Video_Figure_2.mov" target="_blank">Animated / Video Figura 2</a> . dinamiche cellulari mieloidi in un adenoma 3 mm dal un Apc Min / + mouse. Quattro colori time-lapse del piccolo intestino epitelio (10X Fluar, 0.5 lente NA) dalla superficie sierosa di un Apc Min / + ; ACTB-ECFP; CFMS-EGFP topo co-iniettata con fluorescente 2.000 kDa destrano-rodamina (rosso) e una Ly-6G 647 anticorpo coniugato (bianco). Cellule mieloidi sono verdi ecellule epiteliali sono blu. Cellule mieloidi intorno alle cripte non si muovono. Alcuni neutrofili (cellule Gr1 + in bianco) pattugliano nei tessuti. Si tratta di una acquisizione 2 ore e il film è stato accelerato 295 volte. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51916/Supplementary Figure 1.tif" target="_blank">Figura supplementare 1</a> . schermate del software della fotocamera per l&#39;analisi di acquisizione. (A) In primo luogo, i file devono essere convertiti in estensione .ims. (B) Poi, le immagini del display può essere regolata, come ad esempio i segnali specifici può essere aumentato e diminuito di sfondo . (C) Data e bisogno di tempo per essere adeguati al fine di ottenere un filmato in tempo reale. (D) L&#39;acquisizione possono essere salvati come un film.

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Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumori da Spinning Disk Microscopia confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

9.6K Views.  INSERM U661, Functional Genomic Institute. By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model. 

Video: Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the tumor microenvironment and respond adequately to tumor antigens. The recent development of improved imaging approaches, such as 2-photon microscopy, and the use of powerful mouse tumor models have shed light on some of the mechanisms that regulate anti-tumor T cell activities. Whereas such systems have provided valuable insights, they do not always predict human responses. In human, our knowledge in the field mainly comes from a description of fixed tumor samples from human patients, as well as in vitro studies. However, in vitro models lack the complex three-dimensional tumor milieu and, therefore, are incomplete approximations of in vivo T cell activities. Fresh slices made from explanted tissue represent a complex multi-cellular tumor environment that can act as an important link between co-cultured studies and animal models. Originally set up in murine lymph nodes1 and previously described in a JoVE article2, this approach has now been transposed to human tumors to examine the dynamics of both plated3&#160;as well as resident&#160;T cells4.
Here, a protocol for the preparation of human lung tumor slices, immunostaining of resident CD8 T and tumor cells, and tracking of CD8 T lymphocytes within the tumor microenvironment using confocal microscopy is described. This system is uniquely placed to screen for novel immunotherapy agents favoring T cell migration in tumors.

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

This protocol describes a method to image resident tumor-infiltrating CD8 T cells labeled with fluorescently coupled antibodies within human lung tumor slices. This technique permits real-time analyses of CD8 T cell migration using confocal microscopy.

Ex Vivo Imaging dei linfociti T CD8 residente nel tumore del polmone umano mediante microscopia confocale a fette

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Imaging pancreatico murino utilizzando una finestra stabilizzata impiantata

Stabilized Window for Intravital Imaging of the Murine Pancreas

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have high morbidity and mortality. Intravital imaging (IVI) is a powerful technique enabling the high-resolution imaging of tissues in both healthy and diseased states, allowing for real-time observation of cell dynamics. IVI of the murine pancreas presents significant challenges due to the deep visceral and compliant nature of the organ, which make it highly prone to damage and motion artifacts. 
Described here is the process of implantation of the Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP). The SWIP allows IVI of the murine pancreas in normal healthy states, during the transformation from the healthy pancreas to acute pancreatitis induced by cerulein, and in malignant states such as pancreatic tumors. In conjunction with genetically labeled cells or the administration of fluorescent dyes, the SWIP enables the measurement of single-cell and subcellular dynamics (including single-cell and collective migration) as well as serial imaging of the same region of interest over multiple days. 
The ability to capture tumor cell migration is of particular importance as the primary cause of cancer-related mortality in PDAC is the overwhelming metastatic burden. Understanding the physiological dynamics of metastasis in PDAC is a critical unmet need and crucial for improving patient prognosis. Overall, the SWIP provides improved imaging stability and expands the application of IVI in the healthy pancreas and malignant pancreas diseases.

Autore in primo piano: Rivoluzionare la comprensione della malattia pancreatica attraverso l'imaging intravitale avanzato 

We present a protocol for the surgical implantation of a stabilized indwelling optical window for subcellular-resolution imaging of the murine pancreas, allowing serial and longitudinal studies of the healthy and diseased pancreas.

Finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas murino

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Immunologia e infezioni

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizzazione di formazione di aderenze in cellule per mezzo di avanzati filatura microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale disco

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Bioingegneria

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

Videomicroscopia microscopia del sistema vascolare del tumore-associati utilizzando avanzate dorsale dello Skinfold finestra Chambers su topi transgenici fluorescenti

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Medicina

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in

Riepilogo

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