Ringraziamo Weixan Lu per l&#39;assistenza tecnica nella cultura e nella manutenzione degli stock cellulari Sf9. LAY stato supportato da una Medical Research Council (MRC), laureato borsa di studio. RJCG era una Royal Society University Research Fellow. La Divisione Oxford di Biologia Strutturale è parte del Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Wellcome Trust Nucleo concessione di una sovvenzione Numero 090532/Z/09/Z.

Questo protocollo presuppone che il mouse kindlina-3 gene (FERMT3) è stato clonato con successo in un vettore a valle del promotore molto tardi p10 e che il vettore possiede sequenze fiancheggianti baculovirus consentire ricombinazione con il bacmid BAC10 KO: 1629 sviluppato da IM Jones e colleghi 28. Per questo protocollo, il kindlina-3 gene è stato clonato in pOPINE 29 e gli inneschi e la strategia di clonazione utilizzati possono essere trovate descritto altrove 12. Il plasmide è stato progettato in modo che il gene FERMT3 (kindlina-3) è sotto il controllo del promotore p10 baculovirali e il vettore contiene 5 &#39;UTR/ORF603 e ORF il 1629 e codifica una C-terminale suo 6-tag per la purificazione a valle 29. 1. Coltura cellulare insetti e manutenzione <ol><li> Prima di baculovirus ricombinante amplificazione, cellule di Spodoptera frugiperda atto a coltura in sospensione (cellule Sf9) dovrebberoessere coltivate e mantenute. Cellule di insetto devono essere trattati con tecniche asettiche in un tessuto culturale cappa dedicato. </li><li> Colture in sospensione di cellule di insetto sono incubati in Sf-900 II (SFM) siero mezzo liquido libero supplementato con penicillina 100 pg / ml e 100 pg / ml di streptomicina in beute a 27 ° C con agitazione a 100 rpm. </li><li> Mantenere la gamma di densità di coltura cellulare di insetto tra 1 x 10 6 - 1 x 10 7 cellule / ml di scissione e diluendo la coltura cellulare con fresche Sf-900 II media. Nota: sano celle devono guardare dimensioni uniformi e devono essere di forma sferica. </li><li> Contare le cellule in un volume di campione con un emocitometro e microscopio ottico per calcolare la densità cellulare cultura. </li></ol> 2. Generazione di ricombinante Baculovirus <ol><li> Cultura e mantenere le cellule Sf9 in sospensione utilizzando Sf-900 II multimediale integrato con 100 pg / ml penicillin e 100 pg / ml streptomicina. Per la generazione baculovirus, cellule di insetto dovrebbero essere coltivati ​​per una gamma di densità di 5 x 10 5 - 1 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Seme di circa 1 x 10 6 cellule Sf9 per pozzetto di un tessuto 6 pozzetti piastra di coltura sterile in 2 ml di Sf-900 II supporto integrato con penicillina 100 pg / ml e 100 pg / ml streptomicina. Lasciare le cellule Sf9 a temperatura ambiente sotto cappa di aderire alla base dei pozzetti di plastica e quindi formare un monostrato. </li><li> Eseguire ricombinante generazione baculovirus da cotransfecting bacmid DNA e DNA plasmidico sulla cultura monostrato. <ol><li> Per ogni trasfezione, mescolare 1-2 mg di purificato pOPINE-mFERMT3, che possiede le ORF1629 elementi baculovirus, con 0,5 mg di purificato BAC10 KO: 1629 in 100 ml di Sf-900 II SFM senza antibiotici (soluzione A). </li><li> In un tubo separato, diluire 6 ml di Cellfectin II reagente con 100 ml di Sf-900 II SFM senza lottaantibiotici per ciascuna reazione trasfezione (Soluzione B). A &#39;master mix&#39; può essere creato qui, per la manipolazione dei liquidi ridotta, se sono necessarie molte transfezioni. </li><li> Mescolare le due soluzioni (A e B, di circa 200 microlitri) e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per formare un complesso lipide-DNA. </li><li> Diluire i complessi lipide-DNA con 800 microlitri Sf-900 II SFM senza antibiotici. Con attenzione aspirare i media monostrato cellulare Sf9 e pipetta con attenzione la soluzione A / B e dei media sulla parte superiore del monostrato Sf9. </li><li> Incubare le cellule trasfettate in un incubatore umidificato a 27 ° CO / N e aggiungere altre 1 ml di Sf-900 II SFM senza antibiotici ad ogni coltura monostrato il giorno seguente. Incubare le cellule a 27 ° C per altri 5 giorni. </li></ol></li><li> Raccogliere il baculovirus ricombinante direttamente dal terreno di coltura (circa 2 ml in totale) e trasferire in una provetta da centrifuga pulita (ad esempio un tubo Falcon 15 ml). <ol><li> Chiarire qualsiasi debr cella Sf9è per centrifugazione a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il virus, che è nel supernatante risultante e denotato P1, in una provetta pulita e conservare a 4 ° C al buio fino al momento dell&#39;uso. In questa fase il restante monostrato Sf9 può essere utilizzato per valutare generazione virus ricombinante per valutare la presenza di ricombinante kindlina-3 nelle cellule di insetto. </li></ol></li><li> Risospendere il monostrato con 0,5 ml di PBS e diluire un campione di 10 ml con volumi uguali di 2x tampone SDS-PAGE carico. Riscaldare i campioni a&gt; 95 ° C per almeno 10 min. <ol><li> Sonicare il campione per 1 sec al 10% di ampiezza con una punta di micro-sonicator se è troppo viscoso per il corretto caricamento del gel. </li></ol></li></ol> 3. Amplificazione del ricombinante Baculovirus <ol><li> Per l&#39;amplificazione del virus in sospensione, utilizzare una densità cellulare di 1,4 x 10 6 cellule / ml e questo dovrebbe occupare a 1/20 del volume totale pallone (cioè 50 ml in culturaun pallone da 2 L). </li><li> Conseguire l&#39;amplificazione del virus ricombinante infettando la coltura cellulare di insetto con lo stock virale P1 ad una molteplicità di infezione (MOI) di 0,1 utilizzando la seguente formula; <img alt="" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51206/51206eq1.jpg" width="400" /> Nota: generazione di virus P1 può presumere di avere un titolo virale previsto di 1 x 10 7 pfu / ml. Tuttavia, un saggio di placca può essere eseguito prima di questa fase. </li><li> Incubare la cultura P1 insetto infettate a 27 ° C con agitazione a 100 rpm per 3 giorni (72 ore). </li><li> Raccogliere il virus separando le cellule dal supporto mediante centrifugazione a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Salvare il pellet cellulare risultante in questa fase per la conferma della produzione di virus ricombinante valutando kindlina-3 espressione proteica mediante SDS-PAGE e western blotting. </li><li> Trasferire i mezzi di virus arricchita chiarito in una provetta pulita e conservare a 4 ° C inbuio fino al momento dell&#39;uso. Questo stock virale è indicata come P2. Nota: Un titolo virale di 2 x 10 8 pfu / ml (o un tasso di amplificazione di 100 pfu / cell) può essere previsto. </li></ol> 4. Espressione di kindlina-3 in Baculovirus-Infected Sf9 <ol><li> Crescere un volume adeguato di cellule Sf9 colture in sospensione in Sf-900 II SFM supplementato con 100 pg / ml di penicillina e 100 pg / ml streptomicina, prima larga scala ricombinante kindlina-3 espressione per la purificazione. Incubare le colture in sospensione a 27 ° C con agitazione a 100 rpm e con un volume totale cultura: pallone rapporto in volume di 1:5. </li><li> Infect colture in sospensione di Sf9 ad una densità di 2 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Supplemento culture Sf9 con una concentrazione finale di 1% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) seguita da virus ricombinante amplificato (P2-virale magazzino) invia un MOI di 1. Incubare le colture infettate a 27 ° C con agitazione a 100 rpm. </li><li> Harvest ricombinazionent kindlina-3-6-CHIS cellule esprimenti Sf9 72 ore dopo l&#39;infezione mediante centrifugazione a 1000 xg &#160; e il pellet cellulare risultante conservato a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso, o -80 ° C per una conservazione a lungo termine. </li></ol> 5. Purificazione di ricombinante kindlina-3 <ol><li> Scongelare congelati cellule di insetto baculovirus infettate (Sf9) Pellets esprimono ricombinante kindlina-3 sul ghiaccio. </li><li> Risospendere il pellet cellulare scongelato con tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 500 mM, 1% (v / v) Tween-20), supplementato con libero-EDTA cocktail inibitore di proteasi e 1.000-2.000 U di DNase1. Nota: In alternativa, tampone fosfato modificato (PBS) può anche essere utilizzato, dove la concentrazione di NaCl viene regolata a 500 mM per evitare interazioni aspecifiche tra endogeni proteine ​​cellulari Sf9 e la colonna di affinità metallo immobilizzato utilizzato per la purificazione a valle (vedi sotto). </li><li> Lisare le cellule incubando le cellule risospese con il detersivo e vortexing. Sonicare (40% di ampiezza, 10 cicli di 10 sec impulsi seguita da raffreddamento 10 sec) il campione per ulteriore distruzione cellulare in un bagno di ghiaccio o in alternativa utilizzare un omogeneizzatore Dounce. </li><li> Chiarire il lisato tramite centrifugazione a 48,000 xg per 1 ora a 4 ° C. Caricare il supernatante risultante su una colonna HisTrap (5 ml volume della colonna), pre-equilibrata con tampone di lisi, a 4 ° C ad una velocità di 1 ml / min. Nota: In alternativa, il lisato chiarificato può essere incubato con un 1-5 ml volume del letto di pre-equilibrata sefarosio perline di nichel (Ni es Sepharose 6 Fast Flow) a 4 ° C per 1-2 ore. Una colonna di Ni sefarosio può essere formato dopo la fase di legame utilizzando una colonna a gravità. </li><li> Lavare la colonna con 10 volumi di colonna di tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazolo 10 mM) per rimuovere il materiale non legato. </li><li> Utilizzare un gradiente di imidazolo lineare 10-500 mm ad una velocità di 10 mm / ml (o in 10 volumi di colonna) utilizzando un ÄKTA FPLC eluirela kindlina-3-CHIS ricombinante legato 6. </li><li> Frazionare l&#39;eluizione in 0,5-1 ml frazioni utilizzando la ÄKTA FPLC, con le frazioni contenenti kindlina-3-6 CHIS solito eluizione ad una concentrazione di 300 mM imidazolo. </li><li> Valutare la composizione proteica dell&#39;eluente mediante SDS-PAGE e purificazioni per la prima volta confermare mediante Western blotting utilizzando un anti-His 6 o anticorpo anti-topo kindlina 3-anticorpo. </li><li> Si riuniscono le frazioni contenenti kindlina-3 e buffer di scambio in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM tramite una serie di diluizioni in tampone e concentrazioni del campione utilizzando una proteina concentratore centrifugo con un peso molecolare di 50 kDa cut-off (MWCO) a 4 ° C. Nota: In alternativa, Dializzare soluzione proteica utilizzando Slide-A-lizzatore dialisi cassette con un MWCO di 30 kDa a 4 ° C per 4 ore a O / N in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM. Nota: per scambio ionico (vedi sotto) una minore concentrazione di NaCl, <em&gt; ie 50 mM, può essere ed è stato utilizzato per questo passo. </li><li> Applicare la soluzione tampone proteina a scambio su una colonna HiTrap eparina HP pre-equilibrata (5 volumi colonna ml) usando un ÄKTA FPLC ad una velocità di 0,5 ml / min. Nota: Il kindlina-3 legato viene eluito con un gradiente lineare di NaCl (0,2 M NaCl 1 M NaCl) nello stesso tampone, aumentando a una velocità di 10 mm / ml. Kindlina-3-CHIS6 dovrebbe eluire a ~ 0,6 M NaCl. </li><li> Frazionare l&#39;eluizione in 0,5-1 ml frazioni e valutare la composizione delle proteine ​​mediante SDS-PAGE e western blotting, se del caso. Nota: ci si può aspettare una purezza della proteina di quasi il 95%, come valutato mediante SDS-PAGE. </li><li> Frazioni piscina contenente kindlina-3 e concentrare utilizzando un concentratore proteina centrifuga con una kDa MWCO 50 ad un volume finale di 0,5-2 ml. </li><li> Nella fase finale, lucidare il proteica concentrata e buffer scambiare la proteina mediante cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). <ol><li> Applicare la proteina purificata su un Superdex S200 (16/60) o (10/30) pre-equilibrata in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM, DTT 1 mM ad una velocità di 1 ml / min o 0,5 ml / min a seconda delle dimensioni della colonna utilizzato. Nota: cromatografia di esclusione dimensionale può essere eseguita anche in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), se necessario. </li><li> Purificare le proteine ​​secondo la dimensione del buffer applicando sulla colonna ad una velocità di 1 ml / min o 0,5 ml / min, a seconda delle dimensioni della colonna utilizzata. Nota: La proteina eluizione dalla colonna è frazionato e monitorata usando l&#39;assorbanza a 280 nm. </li><li> Un singolo picco di assorbanza deve essere previsto dal SEC, che è frazionato e valutata mediante SDS-PAGE per determinare omogeneità, ed è tipicamente&gt; 95% puro dopo questo passaggio. </li></ol></li><li> Concentrare il purificato kindlina-3-CHIS 6 usando un concentratore proteina centrifuga con una kDa MWCO 50 a ~ 15 mg / ml, valutata spettrofotometricamente utilizzando un coefficiente di estinzione calcolato (ε) di 109.320 M -1 cm -1 &lt;/ Sup&gt; (supponendo che tutti i residui di cisteina sono ridotti). </li><li> Per la conservazione a -20 ° C e conservare a lungo a -80 ° C, la proteina aliquota in provette per PCR e flash congelare i campioni in azoto liquido. In alternativa, la proteina può essere utilizzato direttamente per indagini utilizzando un numero di tecniche biochimiche e biofisiche. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sistemi di espressione baculovirus stanno diventando sempre più popolare e uno strumento importante per la produzione di quantità milligrammo di proteina ricombinante per la caratterizzazione di proteine ​​mediante studi biofisici, tra cui cristallografia a raggi X. Pur essendo più esigenti sperimentalmente i sistemi di espressione baculovirus offrono diversi vantaggi rispetto E. coli uno dei quali è un ambiente quasi nativa per le proteine ​​di origine eucariotica esempio la presenza di accompagnatori e opportunità per modificazione post-traduzionale appropriate. Nei nostri sforzi per esprimere kindlina-3, padroni di espressione alternativi sono stati usati tra cui linee cellulari di mammifero e ceppi batterici di espressione (osservazioni non pubblicate). Generalmente, il numero E. coli ceppi testati prodotte piccole quantità di ricombinante kindlina-3 (~ 0,5 mg / L di cultura, osservazioni non pubblicate). Tuttavia, l&#39;espressione baculovirus-driven in cellule di insetto è stato particolarmente efficace e, in comparison di espressione transiente in cellule di mammifero, più suscettibili di generare la grande biomassa necessaria per isolare una milligrammi di proteine ​​ricombinanti citoplasmatici (osservazioni non pubblicate). Noi ipotizziamo che la presenza accompagnatori eucariotiche possono consentire la produzione efficiente di kindlina-3. Le Baculoviridae infettare cellule di insetto e per l&#39;espressione della proteina ricombinante baculovirus utilizzato in questo lavoro è basata sul Autographa californica virus della poliedrosi nucleare (AcNPV). In natura il AcNPV, che infetta il Autographa californica (erba medica lopper) larve di insetti, richiede la proteina poliedrina per formare occlusioni cui i virons sono incapsulati in una matrice proteica cristallina fornendo così la protezione necessaria per il loro rilascio. In cellule in coltura non è necessaria la formazione di organi di occlusione per la replica ed è quindi superfluo. Nel caso di esprimere proteine ​​estranee gene della proteina poliedrina può essere replaced in un AcNPV ricombinante con il gene per la proteina di interesse. AcNPV può infettare altre specie di lepidottero e ai fini della proteina ricombinante espressione esercito verme Spodoptera frugiperda vengono utilizzati cellule ovariche di pupa. Nell&#39;approccio qui delineato, il bacmid AcNPV (BAC10) è progettato in modo che un gene virale essenziale, ORF1629, è inattivata mediante l&#39;inserimento di cloramfenicolo acetil transferasi conseguente bacmid knock-out (BAC10: KO 1629), tale che sia incapace di formare baculovirions infettive 28. Cotrasfezione di cellule Sf9 con BAC10 linearizzato: KO il 1629 e il FERMT3 contenenti trasferimento vettoriali ripara il ORF1629 inattive, attraverso il recepimento, risultando in un genoma vitale che ha anche incorporato il gene FERMT3 sotto il controllo del promotore poliedrina 28. Descriviamo un protocollo di purificazione per l&#39;isolamento di elevata purezza topo ricombinante kindlina-3 tramite un three passo approccio cromatografico. I metodi utilizzati qui possono essere facilmente applicati ad altre proteine ​​His-tagged. Abbiamo impiegato un passo scambio ionico per purificare ulteriormente kindlina-3 ma riteniamo che questo è un ulteriore passo pseudo-affinità come kindlina-3 presenta un gran numero di residui basici, compreso un tratto di poli-lisina nel suo dominio F1. Inoltre, è considerato kindlina-3 di legarsi e interagire con la faccia citoplasmatica della membrana plasmatica, dove funziona, e quindi si prevede che il raggruppamento di residui di base consentirà la proteina per contrastare la membrana carica negativa. I buffer descritti nei protocolli di purificazione sono considerati standard e sono spesso utilizzati in biologia strutturale. Il saggio thermofluor (Figura 5) dimostra che kindlina-3 è stabile in condizioni di eccessiva suddetto tampone pH 6.0. Questo è stato particolarmente utile e importante per informare i nostri esperimenti nello studio kinldin-3: β1Una interazione coda mediante NMR, che ha dato ottimi spettri a pH 6.1 con basse concentrazioni di NaCl 12. Prima di ogni studio biofisico può essere intrapreso, è importante dimostrare che la proteina purificata di interesse è infatti piegata correttamente ed è funzionalmente attiva. In una precedente pubblicazione abbiamo dimostrato che la kindlina-3 ricombinante espressa e purificata con questo metodo è stato un monomero e monodisperso in soluzione, come valutato mediante cromatografia dimensione esclusione, dispersione della luce dinamica, ultracentrifugazione analitica e piccolo X-ray scattering angolo, ed era anche in grado di legare e riconoscere il NPxY membrana-distale e monte serina / treonina grappolo di β 1A code citoplasmatiche 14, confermando così che si comporta come proteina nativa, che è in linea con precedenti studi cellulari e fisiologici 14,20,22. L&#39;uso di un saggio di stabilità termica è un ulteriore modo di suggerire the corretto ripiegamento di una proteina di interesse, come proteina correttamente ripiegata si tradurrà in un fondo elevato fluorescenza a causa di residui idrofobici esposti. La famiglia kindlina delle proteine ​​è stato al centro di molta attenzione in quanto il loro ruolo inatteso come coactivators essenziali di integrine in vivo è stato scoperto. Questo ha innescato molto sforzo per esprimere loro ricombinante e risolvere le loro strutture. Fino ad oggi un successo limitato è stata riportata ad esprimere quantità milligrammi di piena lunghezza proteina ricombinante ma abbiamo qui descritto l&#39;uso di un sistema di baculovirus che permette l&#39;espressione larga scala a livelli dove studi strutturali diventano fattibili. Generando grandi quantità di ricombinante kindlina-3 possiamo anticipare che questo sarà di aiuto ulteriori studi su questa proteina. Il metodo e la purificazione workflow baculovirus-driven qui descritta per ricombinante murino kindlina-3 potrebbe anche essere usato per esprimere e purificare le altre isoforme kindlina, Che sono anche difficili da esprimere e anche possedere tratti poli-lisina, e può essere ulteriormente adattato per altre proteine ​​citoplasmatiche, quali le proteine ​​di legame di acido nucleico, che non riescono ad esprimere in ceppi batterici.

Le proteine ​​della famiglia kindlina sono una componente fondamentale di montaggio adesione focale, e quindi essenziale per la vita complessa. Kindlins, di cui ci sono tre isoforme di mammiferi (kindlina-1, kindlina-2, e kindlina-3), sono considerati coactivators dei recettori extracellulari integrine accanto Talin 1. Integrina-mediata adesione cellulare collega la superficie cellulare alla matrice extracellulare (ECM) in eucarioti superiori. Si tratta di un processo critico e comune in una pletora di fenomeni fisiologici, che includono l&#39;integrità dei tessuti, embriogenesi, metabolismo osseo, emostasi, e l&#39;immunità. Integrin mediata adesione cellulare si attiva tramite inside-out trasduzione del segnale tramite il legame di Talin e kindlina le integrine β-subunità code citoplasmatici (TA) presso i loro motivi NPxY conservati. L&#39;importanza biomedica di proteine ​​kindlina estende tuttavia fino al nucleo, dove kindlina-2 è stato dimostrato in diversi rapporti recenti per essere coinvolti nella trascrizioneal controllo 2,3. Kindlins sono proteine ​​multidominio di circa 75 kDa, caratterizza per il possesso di un FERM bipartito C-terminale (4.1 band, ezrina, radixina, moesina) del dominio, che viene interrotto da una omologia pleckstrin (PH) dominio al centro del suo sottodominio F2 4,5. Gli studi dei domini kindlina-2 e kindlina-3 PH hanno dimostrato che si lega al secondi messaggeri lipidici fosfatidilinositolo-(3,4,5)-trifosfato e fosfatidilinositolo-(4,5)-bisfosfato 6-8. Tuttavia, studi del dominio kindlina-1 PH mostrano che si lega a PtdIns (3,4,5) P 3 con un&#39;affinità molto inferiore, che può essere spiegato in kindlina-1 da un ponte salino specifico isoforma impedendo lipidi di legarsi 9. Inoltre, vi è un loop ~ 100 aminoacidi inserito nel dominio F1 dei kindlins che è previsto per essere spiegato ma si lega alla fosfatidilserina nel foglietto interno della membrana plasmatica 10,11. Il FERM kindlinadominio è considerata omologa al dominio FERM Talin, sebbene il dominio FERM Talin non possiede un dominio pleckstrin omologia. Entrambi kindlins e talin interagiscono con motivi NPxY sulle integrine β-code attraverso la regione F3 del loro dominio FERM, ma kindlina si lega alla membrana motivo distale, mentre talin rivolge prossimale membrana quella 12-16. Kindlins e talin sia in aggiunta possiedono un dominio F0 N-terminale con una piega ubiquitina-simile che non si trova in altre proteine ​​FERM 11,17. Studi sul dominio F0 di kindlina-2 hanno dimostrato che si lega in modo indipendente per fosfatidilinositolo-(4,5)-bisfosfato membrane arricchite 17. I kindlins presentano pattern di espressione dei tessuti specifici paralogo-e le funzioni fisiologiche non ridondanti. Kindlina-1 è espresso principalmente nell&#39;epidermide, ma anche in misura minore i colon, stomaco e reni; kindlina-2 è espresso ubiquitariamente ma è concentrata in striato e lisciomuscolare ed è l&#39;unico kindlina espressa nello sviluppo embrionale 4 e kindlina-3 è espresso nei tessuti ematopoietici con la più alta concentrazione di kindlina-3 trovati nei megacariociti 18. Tuttavia, studi più recenti hanno suggerito che la proteina funzionale è espressa in tessuti endoteliali e 19. Kindlina-3 è di interesse medico acuta dovuta al suo importante ruolo fisiologico nel sangue. E &#39;fondamentale per l&#39;aggregazione piastrinica e la diffusione durante la formazione di trombi 20, leucociti laminazione in risposta alle infezioni e infiammazioni 21,22 e la formazione di osteoclasti podocita nel riassorbimento osseo 23. Inoltre, l&#39;esaurimento delle kindlina-3 in esseri umani porta a deficit di adesione leucocitaria di tipo III - una malattia caratterizzata da disturbi emorragici potenzialmente letali e infezioni batteriche ricorrenti 20,24,25. Kindlina-3 studi knock-out nei topi hanno mostrato la funzione essenziale della proteina inl&#39;adesione cellulare KIND3 -. / - mice visualizzare fenotipi distinti, come sanguinamento grave a causa di integrine inattivi piastrine, grave osteopetrosi, e alterata adesione dei leucociti 20,22, simile a sintomi nell&#39;uomo manca kindlina-3. Dati strutturali ad alta risoluzione sui kindlins, ad oggi, è stato limitato a sottodomini individuali come l&#39;omologia pleckstrin (PH) dominio del kindlina-1 9 e kindlina-2 26,27 e il dominio F0 di kindlina-1 11 e kindlina -2 17. La maggior parte dei sottodomini di ogni polipeptide kindlina hanno comunque resistito clonazione e analisi strutturale (Yates e Gilbert, osservazioni non pubblicate), e gli studi delle proteine ​​full-length sono stati ostacolati dalla difficoltà di esprimere e purificante quantità sufficienti con E. coli (osservazioni non pubblicate e Harburger et al. 14). C&#39;è un notevole interesse medico in kindlina-3 e la sua function, accanto agli altri due membri della famiglia, e di recente abbiamo generato quantità milligrammi di esso mediante espressione ricombinante in cellule di Spodoptera frugiperda guidati da infezione baculovirus 12. Abbiamo quindi qui descrivere i metodi per la produzione di quantità milligrammo di topo ricombinante kindlina-3 in coltura cellulare di insetto, adatto per lunghi studi strutturali e analisi biochimica. In questo protocollo ci avvaliamo di un bacmid knockout allestita (BAC10 KO: 1629) cioè, da solo, in grado di produrre virioni vitali 28. Il DNA virale viene quindi salvato da ricombinazione con un vettore di trasferimento che in questo caso comprende anche la kindlina-3 gene (FERMT3) e risultati nel gene FERMT3 sostituendo il virus molto tardi gene, che è altamente espressa ma ridondante, risultando in un ricombinante virus che esprime topo kindlina-3 come parte del ciclo vitale del virus 28. Abbiamo identificato questaProcedimento per la produzione di kindlina-3 dopo i tentativi di esprimere e purificare in altri host di espressione dimostrato proibitivo (osservazioni non pubblicate), ma anche grazie alla versatilità della suite vettore Popin, che abbiamo usato per la clonazione e che possono distribuito in molti espressione ospita 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1147">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Sf-900 II serum free media (SFM) 1X liquid</td>
			<td style="width:123px;">Life Technoligies</td>
			<td style="width:119px;">10902-096</td>
			<td style="width:439px;">store at 4&#176;C and warm to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Cellfectin II Reagent</td>
			<td style="width:123px;">InVitrogen</td>
			<td>10362-100</td>
			<td>Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Streptomycin Sulphate (solid)</td>
			<td style="width:123px;">Melford</td>
			<td>S0148</td>
			<td>Sterilise filter (0.22&#956;m filter) before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Penicillin G, potassium salt (solid)</td>
			<td style="width:123px;">Melford</td>
			<td>P0580</td>
			<td>Sterilise filter (0.22&#956;m filter) before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate</td>
			<td style="width:123px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>10100-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8849</td>
			<td>Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">HisTrap FF (5ml)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">GE Heathcare</td>
			<td>17-5286-01</td>
			<td>Requires an &#196;kta FPLC machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">HiTrap Heparin (5ml)</td>
			<td style="width:123px;">GE Heathcare</td>
			<td>17-0407-01</td>
			<td>Requires an &#196;kta FPLC machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane)</td>
			<td style="width:123px;">Millipore</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td style="width:439px;">15ml capacity and a MWCO of 50kDa protein concentrator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient production and purification of recombinant murine kindlin-3 from insect cells for biophysical studies

Kindlins coattivatori sono essenziali, con talin, dei recettori di superficie cellulare integrine e anche partecipare integrina outside-in di segnalazione, e il controllo della trascrizione genica nel nucleo della cellula. I kindlins sono ~ 75 kDa proteine ​​multidominio e si legano ad un motivo NPxY e monte T / S grappolo della integrina β-subunità coda citoplasmatica. Il hematopoietically importante isoforma kindlina, kindlina-3, è fondamentale per l&#39;aggregazione piastrinica durante la formazione di trombi, leucociti a rotazione in risposta alle infezioni e l&#39;infiammazione e la formazione di osteoclasti podocita nel riassorbimento osseo. Il ruolo di kindlina-3 in questi processi ha portato in ampi studi cellulari e fisiologici. Tuttavia, vi è la necessità di un metodo efficace di acquisire quantitativi milligrammi di alta qualità della proteina per ulteriori studi. Abbiamo sviluppato un protocollo, qui descritto, per l&#39;espressione efficiente e purificazione di ricombinante kindlina-3 murina mediante uso di un baculovirus-driven sistema di espressione in cellule Sf9 cedendo una quantità sufficiente di elevata purezza proteina intera per consentire la sua caratterizzazione biofisica. Lo stesso approccio potrebbe essere presa nello studio delle altre isoforme kindlina mammiferi.

L&#39;espressione larga scala di topo ricombinante kindlina-3 utilizzando cellule Sf9 baculovirus-infette può richiedere meno di due settimane per ottenere quantità milligrammo, come illustrato nello schema Figura 1A e richiede soltanto una piccola quantità di DNA plasmidico da un kit QIAprep Miniprep, per esempio. La generazione di baculovirus ricombinante si ottiene cotransfecting cellule Sf9 con il mouse kindlina-3 (FERMT3) contenenti plasmide con un bacmid linearizzato ingegnerizzato (BAC10: KO 1629) e raccogliendo i virioni neoformati dopo 5-7 giorni, come mostrato nella Figura 1A. Questo metodo di generazione baculovirus risultati in 100% virus ricombinanti e sostanzialmente eroga la necessità di purificazione di placca 28,30. Una cultura rappresentante piccola scala (2 ml monostrato) genererà una soluzione contenente il virus ricombinante con un titolo virale previsto di unità formanti 1 x 10 7 placca (pfu) per ml dicultura. Si può eseguire un saggio di placca per determinare il titolo virale reale, ma questo è forse troppo alta intensità di manodopera, quando un elevato numero di costrutti sono testati per studi strutturali. Il successo della fase di generazione di virus può essere valutato utilizzando un plasmide contenente eGFP in parallelo, o, per questo kindlina-3 costrutto, il monostrato Sf9 può essere risospeso in PBS e valutata mediante SDS-PAGE e western blotting, che dimostra tipicamente una netta banda corrispondente ad un 75 kDa proteina His-tag, come mostrato nella Figura 1B. Il virus viene successivamente amplificato per generare quantità sufficienti per larga scala (volumi litri) infezione di cellule di insetto e l&#39;isolamento della proteina ricombinante. Il secondo virus passaggio (P2) è generato da infettare colture in sospensione con un MOI approssimativo di 0,1 (vedi protocollo). E &#39;fondamentale che l&#39;amplificazione Sf9 coltura in sospensione occupa solo un ventesimo del volume totale pallone. Questo aerazione supplementare assicura che il vir risultanteci contenenti supporti, raccolto dopo 3 giorni (72 ore) post-infezione, genererà una quantità sufficiente di kindlina-3 nella cultura espressione successiva. Lo stock del virus amplificato (P2) si presume di possedere un titolo virale previsto di 2 x 10 8 pfu / ml in base a una stima prudente di 100 pfu / cella utilizzando una densità cellulare di 2 x 10 6 cellule / ml durante l&#39;amplificazione 31. Generalmente, per l&#39;amplificazione ottimale baculovirus e la produzione di proteine, le cellule Sf9 devono essere uniformi per dimensioni e sferica, come mostrato nella Figura 1C. Inoltre, l&#39;amplificazione e la proteina espressione virale è massima in 72 ore post infezione, ed entrambi sono significativamente ridotti in 96 ore post infezione. Una volta che il virus è stato amplificato e utilizzato per infettare cellule Sf9 in esperimenti su larga scala ricombinante kindlina-3 è parzialmente purificato in virtù della sua ingegnerizzato C-terminale suo 6-tag mediante cromatografia di affinità metallo immobilizzatofase gassosa, come mostrato nella Figura 2. È importante effettuare la purificazione a 4 ° C e sono stati aggiunti che gli inibitori della proteasi sufficienti per impedire proteolisi. Il kindlina-3 parzialmente purificato viene ulteriormente purificato per quasi omogeneità mediante scambio cromatografia ionica (IEC) usando una colonna di eparina, come mostrato nella Figura 3. Abbiamo impiegato l&#39;uso di una colonna di eparina invece di una colonna di scambio ionico convenzionale, come abbiamo previsto che il gran numero di residui basici, compreso un tratto di poli-lisina all&#39;interno del dominio kindlina-3 F1, sarebbe interagire fortemente con i gruppi solfato carica negativa della colonna. Questa strategia è particolarmente utile per RNA-binding proteins-DNA e con le zone di base di acido nucleico vincolante, ad esempio il terminale-RNA vincolante uridylyltransferase Cid1 32. Infine kindlina-3 purezza è &quot;lucido&quot; di dimensioni cromatografia ad esclusione per rimuovere aggregati e omogeneizzazione, come mostrato nellaFigura 4. I buffer specificati nei protocolli sono tamponi standard frequentemente utilizzati nella purificazione della proteina per l&#39;analisi strutturale. Generalmente, tamponi a base di fosfati sono evitati per la purificazione di proteine ​​per studi strutturali, soprattutto cristallizzazione di screening a causa della formazione di cristalli di fosfato nelle gocce di cristallizzazione (in particolare per esperimenti a 4 ° C). Tuttavia, abbiamo eseguito un saggio di spostamento termico basato Thermofluor per determinare quali tamponi sono stati stabilizzati per kindlina-3, come illustrato nella Figura 5. In breve, una soluzione di proteina purificata è diluita nel buffer che coprono un range di pH e sodio cloruri, quindi formando uno schermo da 2-dimensionale. La fusione della proteina viene misurata osservando la fluorescenza da Sypro colorante arancio (sonde molecolari), che si lega ai residui idrofobici all&#39;interno del nucleo proteina ripiegata, per il range di temperatura 20-95 ° C (293-368 K). La temperatura media punto in cui the la proteina svolge (temperatura di transizione, T m) è stato calcolato utilizzando il software Opticon Monitor ed è descritto altrove 33. Kindlina-3 è stata osservata per essere stabile a concentrazioni di cloruro di sodio alta (500 mm) entro l&#39;intervallo di pH 7,0-9,0, con una temperatura di transizione coerente (T m) di 55 ° C. Inoltre è stato osservato che la T m di kindlina-3 era di circa 55 ° C nell&#39;intervallo di pH 7.0-7.5 indipendentemente dalla concentrazione di cloruro di sodio. Abbiamo scoperto che c&#39;era proteolisi limitata di kindlina-3 durante la purificazione ma l&#39;analisi SDS-PAGE delle proteine ​​altamente concentrata (~ 15 mg / ml) ha dimostrato contaminazione limitata con due polipeptidi addizionali di uguale intensità. Stranamente, tuttavia non vi è alcuna indicazione di altre specie mediante cromatografia ad esclusione dimensionale, come mostrato in Figura 4. Si è quindi pensato che la proteina viene scalfito da proteasi ma rimane piegato e hydrodynamically indistinguibile dalla proteina full-length. È interessante notare, Calpain è una proteasi noto che scinde kindlina-3 a Tyrosine373, che è nel loop β1-β2 dell&#39;omologia pleckstrin (PH) dominio 34 e possono spiegare le nostre osservazioni. Inoltre, western blotting rivela che uno dei doppietti polipeptidiche possiede un C-terminale His-tag e il peso molecolare apparente del doppietto, quando sommati, uguale a 75 kDa, lo stesso peso molecolare della proteina nativa. La resa di purificato kindlina-3 ricombinante per litro di cellule Sf9 (~ 2 g di peso cellulare) è, nella migliore delle ipotesi, 5 mg. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica Panoramica delle cellule di insetto espressione della proteina eterologa baculovirus-infettati. (A) Un schematizzata di generatio baculovirusn ed espressione di kindlina-3 in cellule Sf9. Negli schemi vettore DNA, 5&#39;UTR / ORF603 è colorato in rosso, il ORF1629 è colorata in verde e, il gene della proteina di interesse (POI) è di colore blu. (B) Western Blot, utilizzando un anti-His anticorpo 6, di sei piccoli (2 ml monostrato) culture (corsie etichettati secondo la cultura) di cellule che producono Sf9 baculovirus ricombinante e ricombinante kindlina-3 murino. (C) Immagine luce microscopia di cellule Sf9 sane coltivate in sospensione in Sf-900 II SFM integrato con antibiotici e trasferito in un piatto di coltura di tessuti e 35 mm (vedi protocollo). L&#39;immagine è 20X di ingrandimento. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2.jpg" /> Figura 2. RAPPRESEpurificazione ntative di kindlina-3 da immobilizzato cromatografia di affinità metallo (IMAC). SDS-PAGE di nichel purificato per affinità ricombinante murino kindlina-3 espressa in baculovirus infettate cellule Sf9 (~ 2 g di peso cella). Proteina adsorbita è stata eluita con un gradiente di imidazolo (mostrato sopra il gel). Lanes sono etichettati come segue: MW, marcatore di peso molecolare; Lys, tutta lisato cellulare, FT, il flusso attraverso (non legato), WI, lavare 1; WII, lavare 2. Analisi Western blot (sotto) è stato effettuato anche utilizzando le frazioni di eluizione per confermare la presenza di ingegneria His-tag sulla proteina ricombinante. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3.jpg" /> Figura 3. Rappresentantidepurazione rappresentativo del kindlina-3 da eparina affinità e cromatografia. (A) profilo di eluizione osservata a 280 nm (blu) la visualizzazione di un singolo picco simmetrico eluizione sotto un gradiente di cloruro di sodio lineare (verde) utilizzando l&#39;intervallo di concentrazione di NaCl di 0,05-1,0 M. ( B) analisi SDS-PAGE della eluizione frazionata dimostrare la presenza della proteina 75 kDa, kindlina-3 (K3 etichetta). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4.jpg" /> Figura 4. Rappresentativa cromatografia di gel filtrazione e concentrato kindlina-3. (A) gel filtrazione profilo di eluizione purificato kindlina-3 usandoun Superdex S200 (16/60) in Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM e 1 mM DTT a 20 ° C. Sulla base del volume di eluizione, kindlina-3 migra come previsto per una proteina di 75 kDa, suggerendo che è prevalentemente monomerico. (B) SDS-PAGE altamente concentrato ricombinante purificata kindlina-3 a 14,5 mg / ml. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5.jpg" /> Basato Thermofluor Figura 5. Saggio di spostamento termico per Buffer Screening. Kindlina-3 è stato diluito in vari buffer comprendenti uno schermo bidimensionale del pH rispetto alla concentrazione di cloruro di sodio. Temperature di transizione (temperatura punti medi) sono stati osservati per fluorescenza dellacolorante idrofobicamente legato, Sypro arancione (sonde molecolari) e calcolati utilizzando il software Opticon Monitor. (A) Un istogramma 3D delle temperature di transizione è tracciata con (B) il cambiamento della temperatura di transizione dalla media calcolata di 50,4 ° C. Per chiarezza, le barre sono colorate secondo la gamma di temperature a cui corrispondono. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins sono fondamentali per l&#39;adesione cellulare tramite integrine ma gli studi di loro sono stati ostacolati dalla difficoltà incontrata ad esprimere loro ricombinante in ospiti batterici. Descriviamo qui metodi per la loro produzione efficiente in cellule di insetto baculovirus-infette.

Produzione efficiente e purificazione di ricombinante murino kindlina-3 da cellule di insetto per Biofisica Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

efficient-production-purification-recombinant-murine-kindlin-3-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

23.3K Views.  University of Oxford.  Kindlins sono fondamentali per l'adesione cellulare tramite integrine ma gli studi di loro sono stati ostacolati dalla difficoltà incontrata ad esprimere loro ricombinante in ospiti batterici. Descriviamo qui metodi per la loro produzione efficiente in cellule di insetto baculovirus-infette. 

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A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

Un metodo per la produzione di proteine ​​ricombinanti mCD1d in cellule di insetto.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Ricerca

Biologia

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purificazione dei mitocondri da cellule di lievito

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Un&#39;analisi comparativa di espressione della proteina ricombinante in diversi biofabbriche: batteri, cellule di insetto e impianti

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Efficiente Espressione cellulari di mammifero e Passo singolo Purificazione di extracellulare glicoproteine ​​per cristallizzazione

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. Three-dimensional (3D) cell culture techniques are a recent innovation developed to address the shortcomings of adherent cell culture. While several techniques for generating tissue analogues in vitro have been developed, these methods are frequently complex, expensive to establish, require specialized equipment, and are generally limited by compatibility with only certain cell types. Here, we describe a rapid and flexible protocol for aggregating cells into multicellular 3D spheroids of consistent size that is compatible with growth of a variety of tumor and normal cell lines. We utilize varying concentrations of serum and methyl cellulose (MC) to promote anchorage-independent spheroid generation and prevent the formation of cell monolayers in a highly reproducible manner. Optimal conditions for individual cell lines can be achieved by adjusting MC or serum concentrations in the spheroid formation medium. The 3D spheroids generated can be collected for use in a wide range of applications, including cell signaling or gene expression studies, candidate drug screening, or in the study of cellular processes such as tumor cell invasion and migration. The protocol is also readily adapted to generate clonal spheroids from single cells, and can be adapted to assess anchorage-independent growth and anoikis-resistance. Overall, our protocol provides an easily modifiable method for generating and utilizing 3D cell spheroids in order to recapitulate the 3D microenvironment of tissues and model the in vivo growth of normal and tumor cells.

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Un metodo delle celle di aggregazione efficiente e flessibile per il 3D Spheroid Produzione

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

Espressione transitoria e Localizzazione cellulare di proteine ​​ricombinanti in cellule in coltura per insetti

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

Espressione di proteine di fusione fluorescenti in macrofagi e cellule dendritiche derivate da midollo osseo Murine

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...