Questo lavoro è stato supportato dal Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology, iBio, Inc. e la Defense Advanced Research Projects Agency (sovvenzione # HDTRA1-07-C-0054). Gli autori riconoscono i doni generosi di Drs. Stanton Gelvin di Biological Science Dept., Purdue University (Agrobacterium tumefaciens ceppi) e Wayne Fitzmaurice di Large Scale Biology Corp. (N. semi excelsiana), così come Jennifer Nicholson di US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. semi Excelsior ). Gli autori ringraziano Margaret Shillingford e Christopher Hull per la fornitura di impianti e un&#39;eccellente assistenza tecnica. Gli autori ringraziano anche Drs. Stephen Streatfield e Natasha Kushnir per l&#39;assistenza editoriale.

1. Pianta che cresce Per la successiva agroinfiltration abbiamo valutato due wild-type Nicotiana specie (N. benthamiana e N. Excelsior) e un ibrido (N. excelsiana) coltivate idroponicamente in lana di roccia in strutture al coperto. <ol><li> Immergere lastre di lana di roccia in una soluzione fertilizzante per le piante. </li><li> Seminare semi di wild-type N. benthamiana, N. excelsior e N. excelsiana (ibrido di N. benthamiana × N. excelsior) sui nutrienti bagnato superficie di lana di roccia. </li><li> Crescere le piante dai semi in condizioni controllate (24 ° C e 40-65% di umidità relativa) e un fotoperiodo lungo giorno (14 ore di luce e 10 ore scuro, con illuminazione di 130-150 μE m -2 s -1) per 4-5 settimane per N. e N. benthamiana excelsiana, e 5-6 settimane per N. excelsior. </li></ol> 2. Costruzione di vettori per Agroinfiltratione <ol><li> Inserire un gene reporter sintetico (la proteina fluorescente verde [GFP]), full-length emoagglutinina (HA) del ceppo A/California/04/2009 del virus dell&#39;influenza (HAC1), e re-ingegnerizzato lichenasi enzima (LicKM) 18 separatamente in il lancio vettore pBID4 18 (vector-based TMV) per ottenere pBID4-GFP, pBID4-HAC1 e pBID4-LicKM, rispettivamente, 18,32,41,47. </li><li> Introdurre 10-50 ng di pBID4 trasportare GFP o HAC1 in cellule elettrocompetenti di A. tumefaciens ceppo GV3101 e LicKM in cellule elettrocompetenti di A. tumefaciens ceppi GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, At77 e A4 con il elettroporatore gene MicroPulser. </li><li> Utilizzare il Agrobacteria trasformata per esperimenti di infiltrazione, se non diversamente indicato. </li></ol> 3. Aspirare Infiltrazione di Agrobacterium in Nicotiana Piante <ol><li> Crescere A. tumefaciens ceppi overnight (O / N) in mezzo LB, med YEBium o AB medie completato con 50 mg / L di kanamicina a 28 ° C in agitazione a 200-250 rpm. </li><li> Diluire Agrobacteria in acqua Milli-Q di densità ottica a 600 nm (A 600) di 0,5 o centrifuga tumefaciens cellule coltivate in LB o YEB o AB a 4.000 × g per 10 min a 4 ° C, risospendere in mezzo ad induzione (sale 1x MS, MES 10 mM, 200 mM acetosyringone, 2% di saccarosio [MMA]) A 600 di 0,5, e agitare a temperatura ambiente per 1-3 hr, se non diversamente specificato. </li><li> Infiltrarsi piante in una camera a vuoto immergendo tessuti aeree della pianta Nicotiana in sospensione Agrobacterium e applicando un vuoto 50-400 mbar per 30 o 60 secondi. L&#39;infiltrazione ottimale viene normalmente applicato a 50-100 mbar per 60 sec. </li><li> Una volta eliminato il sottovuoto, togliere piante dalla camera sotto vuoto, lavare in acqua, e crescere per 5-7 giorni nelle stesse condizioni di crescita utilizzate per la crescita di pre-infiltrazione. </li><li> Per testare l&#39;efficaciadi sostanze chimiche che inducono Agrobacterium gene vir, diverse concentrazioni di acetosyringone (0, 100, 200 o 400 mM) sono stati aggiunti al Agrobacteria sospesa in tampone infiltrazione (1x MS, MES 10 mM, 2% di glucosio). Per l&#39;effetto di monosaccaride sull&#39;induzione di geni vir, diverse percentuali di glucosio (0, 1, 2 o 4%) sono stati aggiunti a Agrobacteria sospesa nel buffer infiltrazione (1x MS, MES 10 mM, 200 mM acetosyringone). N. piante benthamiana sono stati infiltrati come già detto in fasi 3.3 e 3.4). </li><li> Laboratorio Agrobacterium ceppi GV3101, C58C1 e LBA4404 e wild-type ceppi A4, AT06, AT10, e At77 ospitare il vettore pBID4-LicKM sono stati diluiti in acqua Milli-Q A 600 del 0.5. N. piante benthamiana sono stati infiltrati con ogni sforzo particolare per quanto detto sopra in passi 3.3 e 3.4. </li></ol> 4. Procedura Co-agroinfiltration per il silenziamento soppressore Viral <ol><li> Mix i Milli-Q-diluita di acqua Agrobacterium GV3101 culture che trasportano il gene GFP e virale silenziamento soppressore p19 di pomodoro virus del rachitismo cespuglioso (TBSV) a 1:1, 2:1, 3:01 e 4:01 rapporti. Infiltrati N. benthamiana piante come descritto sopra. </li><li> Infiltrati N. piante benthamiana con una miscela di due Milli-Q-diluita di acqua Agrobacterium GV3101 culture: il primo porta il plasmide pBID4-HAC1 e la seconda trasporta uno dei soppressori di silenziamento - p19 di TBSV o p23 di Citrus tristeza virus, in plasmide pCassp ( pCassp19) e nel PGR plasmide binario sotto il promotore 35S (PGR-P23), rispettivamente, in rapporto 4:1. </li></ol> 5. Western Blot analisi <ol><li> Raccogliere campioni di foglie casuali da N. benthamiana, N. excelsior o N. piante excelsiana a 4-7 dpi e polverizzare in azoto liquido a una polvere finissima. </li><li> Aggiungere tre volumi di tampone PBS 1x contenente 0,5% TritonX-100 per ciascun campione. </li><li> Agitare delicatamente i campioni estratti per 15 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugare l&#39;estratto per 5 minuti e raccogliere proteine ​​totali solubile in una provetta pulita Eppendorf. </li><li> Diluire gli estratti di una diluizione appropriata (1:50 1:100) in tampone di estrazione 1x PBS, e aggiungere 5 × tampone campione (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], il 10% SDS, 0.5% blu di bromofenolo, 50% glicerolo v / v, e DTT 500 mm) per una finale 1 × concentrazione. </li><li> Campioni bollire per 5 min. </li><li> Proteine ​​separate del 10% SDS-PAGE, trasferiscono sulla membrana di trasferimento Immobilon-P, e bloccano con 0,5% I-block. </li><li> Controllo GFP usando policlonale di coniglio anti-GFP antisiero a 1/5.000 e HAC1 mediante anticorpo monoclonale anti-poli-istidina mouse 1:1000 in soluzione bloccante per 1 ora. </li><li> Dopo marcatura anticorpo primario, lavare le membrane tre volte per 10 minuti ciascuno con 1 × PBST-20 e incubare con perossidasi di rafano (HRP)-coniugato anticorpo anti-coniglio a 1/5.000 o un HRP-coniugatod anticorpo anti-topo a 1:10.000 per 1 ora, per la GFP e la rilevazione HAC1, rispettivamente. </li><li> Elaborare Western blot utilizzando il substrato SuperSignal Ovest Pico Chemiluminescent. </li><li> Utilizzare il Software GeneTools analizzare intensità della banda della proteina e avere la quantità calibrata band. </li></ol> Produzione di proteine: (calibrato quantità x diluizione del campione) / quantità di campione caricato) x 4 = mg / kg. Equazione: Produzione di proteine ​​(P), quantità calibrata (C), diluizione del campione (D) e la quantità di campione caricato (S). 6. Zymogram Assay <ol><li> N. Raccogliere pBID4-LicKM-infiltrati benthamiana campioni di tessuto casuale. </li><li> Estrarre proteine ​​usando gli stessi metodi descritti sopra per analisi Western blot e quindi analizzare del 10% SDS-PAGE con 0.1% lichenan incluso nel gel. </li><li> Dopo l&#39;elettroforesi, lavare i gel due volte per 10 minuti ciascuno in tampone di lavaggio (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] e 0,1% Triton X-100) E poi incubare in tampone di lavaggio a 65 ° C per 1 ora. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, scartare il tampone di lavaggio e macchiare i gel con 0,5% Congo Red per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare i gel in acqua Milli-Q per tre volte per 10 minuti ciascuno, e aggiungere 1 M NaCl per visualizzare l&#39;attività lichenasi. La proteina lichenasi batterico purificato è stato utilizzato come controllo positivo per l&#39;attività enzimatica. </li></ol> 7. GFP Imaging <ol><li> Eseguire il rilevamento visivo di fluorescenza GFP in piante intere transitoriamente trasformate usando una lampada UV di lunghezza d&#39;onda a mano. </li><li> Fotografia transitoriamente trasformato piante con una macchina fotografica digitale attraverso un giallo 8, ES 52 filtro (tempo di esposizione, 15 sec). </li><li> Ottenere immagini da analisi Western blot utilizzando il software GeneSnap su un GeneGnome e quantificare i risultati utilizzando il software GeneTools, con una curva di calibrazione basato sullo standard GFP purificata. </li><li> Quantificare proteina HAC1 utilizzando una curva di calibrazione basato sulla depurazioneed HAC standard di proteine ​​dal ceppo A/Indonesia/05/05 del virus dell&#39;influenza. </li><li> Calcolare i valori medi di 3-4 replicati per tutti gli esperimenti. </li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

In questo studio, abbiamo sviluppato un semplice protocollo agroinfiltration per la produzione di proteine ​​transitoria di routine in specie di Nicotiana selezionati utilizzando ceppi tumefaciens che portano il lancio vettore. Inoltre, abbiamo identificato le condizioni ottimali per raggiungere il massimo livello di produzione della proteina ricombinante nel nostro sistema di espressione transiente pianta. Vacuum infiltrazione della A. tumefaciens ceppo diluito GV3101 ospitare i pBID4 vettore di lancio in N. benthamiana, N. excelsiana e N. excelsior portato a livelli più elevati di produzione di proteine ​​bersaglio entro 7 dpi rispetto ad altre specie vegetali, come Pisum sativum infiltrata con GV3101 ospitare Alfalfa mosaic virus - o Cucumber mosaic virus-vettori basati esprimono il gene reporter GFP sotto il promotore 35S 41, o Lactuca sativa, Solanum Lycopersicum e Arabidopsis thaliana infiltrati con il ceppo C58C1 di A. tumefaciens che portano la beta-glucuronidasi giornalista gene 57. N. e N. benthamiana excelsiana erano facili da aspirare infiltrarsi a 50 mbar per 30-60 secondi, con il 90-95% di efficienza infiltrazione. Il restante 5-10% della superficie del foglio non è stato infiltrato causa di qualche fluttuazione di foglie sulla superficie della sospensione Agrobacterium durante l&#39;applicazione del vuoto. Dal lancio vettore ha la capacità di movimento 18 cellula-cellula, accumulo di proteine ​​transitorio si verifica in foglie intere nonché piccioli a 7 dpi. A 10 dpi, la produzione stimata GFP era leggermente inferiore in quanto il vettore di espressione pBID4 è in grado di muoversi da una cella all&#39;altra, ma non per spostare sistemica 18; Pertanto, le foglie di nuova produzione non contengono il vettore e non contribuiscono alla produzione di destinazione. Inoltre, la degradazione della proteina ricombinante nel tempo may contribuire a ridurre il livello di proteine ​​a 10 dpi. I nostri risultati hanno mostrato che l&#39;infiltrazione del A. alti livelli tumefaciens ceppo GV3101 mediate di produzione di proteine ​​transitoria in N. benthamiana. Inoltre, proteina bersaglio può essere progettato come fusioni N-terminale, C-terminale o interne alla lichenasi (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanasi, che è un enzima termostabile da Clostridium thermocellum e conferisce stabilità termica a molti di destinazione proteina di fusione 18. Infiltrazione di N. benthamiana con A. tumefaciens ceppi wild-type (AT6, AT10 e at77) ospitano il gene di interesse suscitato sintomi lievi o gravi: foglia di curling, picciolo allungamento, e curling. Senza sintomi patologici sono stati osservati in N. benthamiana infiltrato con la GV3101 ceppo di laboratorio ospitare vuoto pBID4 vettore, mentre alcuni geni inseriti in pBID4 e trasformate in laboratorio ceppi GV3101, C58C1 o LBA4404 suscitato reazioni necrotiche miti e fogliaclorosi / ingiallimento sintomi nelle regioni infiltrati di foglie. I sintomi necrotici causati da wild-type Agrobacterium o ceppi disarmati in solanacee sono stati segnalati in precedenza 56,57. La risposta necrotico potrebbe derivare da fattori di virulenza del sistema di secrezione di tipo III, proteine ​​batteriche trasferite alla cellula vegetale dal sistema di secrezione di tipo IV, e / o sensibilità alla flagellin 58-60. Abbiamo trovato che la produzione di proteine ​​eterologhe transitorio può anche suscitare patogenicità e una risposta ipersensibile in pianta infiltrato foglie. Molti ricercatori hanno riferito che agroinfiltration di diverse specie di piante con piante vettori binari prodotti fino a 5-20 volte più alti livelli di produzione di proteine ​​transitoria rispetto agli impianti stabilmente trasformate 28,57. I nostri dati mostrano che N. benthamiana infiltrato con GV3101 ospitare pBID4-GFP transitoriamente espressi alti livelli di GFP, che è simile al rendimento GFP riportato perN. benthamiana infiltrato con Agrobacteria portando il vettore virale Pich-GFPSYS (fino al 80% delle proteine ​​totali solubili) 44. Agroinfiltration utilizzando il nostro lancio vettore provocato alta produzione della proteina LicKM termostabile, 50 volte superiore a quella osservata utilizzando un plasmide standard binario 18. Per testare l&#39;infettività A. tumefaciens e la stabilità del lancio vettore, abbiamo infiltrate per piano di N. benthamiana ogni ora per un massimo di 8 ore utilizzando la stessa Milli-Q cultura diluito con acqua del GV3101 ospitare plasmide pBID4-GFP. I nostri dati hanno mostrato che il ceppo GV3101 è efficacemente infettivo per almeno 8 ore e pBID4 (il lancio vettore) è molto stabile durante la 8 ore di lungo infiltrazione. Stock di glicerolo di tensione GV3101 ospitare il vettore di lancio pBID4-HAC1 (banca di cellule), conservato a -80 ° C ha dimostrato di essere molto stabile per tre anni senza variazioni di prote transitoriain produzione negli impianti di infiltrati. N. benthamiana piante coltivate in condizioni ottimali e tra 35 e 42 giorni dopo la semina erano ottimali per il vuoto espressione genica transiente infiltrazione mediata 40. Piante giovani (3-4 settimane) non possono essere infiltrati completamente a causa delle foglie che galleggiano sulla superficie sospensione cellulare e danni ai tessuti dagli effetti meccanici di applicazione di un vuoto. Negli impianti più vecchi di 45 giorni, N. benthamiana bullonatura palco, sotto le condizioni di luce ottimali utilizzati, il livello di espressione transiente è basso. Composti a basso peso molecolare fenolici (acetosyringone) e monosaccharaides (glucosio) sono noti per indurre i geni vir in A. tumefaciens 55,61. Inoltre, infiltrazione di N. benthamiana con il vettore pCAMBIA binario (GFP) in presenza di acetosyringone alle concentrazioni di 50-600 mM hanno mostrato di aumentare leggermente transitoriaespressione genica 40. Abbiamo studiato l&#39;effetto di diverse concentrazioni di acetosyringone e glucosio nel nostro sistema con l&#39;aggiunta di questi composti a culture GV3101 ospitano pBID4-GFP in MMA per 3 ore, e abbiamo trovato nessuna differenza di espressione GFP. È interessante notare che, culture GV3101 ospitano pBID4-GFP e diluito in acqua Milli-Q per un A 600 di 0,5 e infiltrati senza l&#39;induzione gene vir espresso le stesse quantità di GFP come quelli infiltrati con le culture indotte. Il A. Agrobacterium gene vir (s) potrebbe potenzialmente essere indotta da composti vegetali fenolici (acetosyringone e acido sinapinic) e monosaccharaides vegetali (glucosio e fruttosio) presenti nel tessuto fogliare. Pertanto, ipotizziamo che i livelli simili di espressione GFP in presenza o assenza di induttori esogeni gene vir possono essere il risultato dell&#39;effetto di citoplasmatici vir induttori gene presente durante la replicazione del lancio vettore GFP che esprimono in cellule vegetali. N. benthamiana è stato usato come modello host per la produzione di proteine ​​transitorio 49. Tuttavia, relativamente bassa resa in biomassa s &#39;N. benthamiana ostacola la sua applicazione per la produzione su larga scala di proteine ​​ricombinanti. L&#39;host ottimale dovrebbe combinare un alto livello di espressione transiente, facile crescita in una serra, e sia suscettibile di Agrobacterium infiltrazione 2. Per selezionare un host alternativo, abbiamo infiltrati due diverse specie di Nicotiana (N. benthamiana e N. excelsior) wild-type e un ibrido N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) con la A. tumefaciens ceppo GV3101 ospitare il plasmide pBID4-GFP. Tra queste tre specie, il livello di espressione GFP era leggermente superiore in N. benthamiana. N. piante Excelsior hanno mostrato difficoltà a agroinfiltration vuoto a causa delle loro foglie coriacee, e N. excelsianaprodotto circa due volte più biomassa nelle stesse condizioni di crescita. La produzione transitoria di GFP a 7 dpi è relativamente simile in N. e N. benthamiana excelsiana. Pertanto, N. excelsiana può essere una serie più adatto per la produzione di proteine ​​ricombinanti. Produzione di proteine ​​transiente mediata da Agrobacterium è limitato dal PTGS 26, che può essere superata mediante co-espressione di silenziamento genico soppressori di origine virus vegetale 62. Produzione di proteine ​​Transient è stato precedentemente dimostrato essere migliorata 50 volte in presenza della proteina p19 di TBSV, che inibisce PTGS nei tessuti infiltrati 34. Nel nostro studio, abbiamo valutato l&#39;effetto di due soppressori di silenziamento virali (p19 e p23) separatamente co-infiltrati con il vettore di lancio pBID4-HAC1. Il co-infiltrazione di questi soppressori di silenziamento sembrava avere poca influenza sulla espressione transiente di HAC1, con solo un leggero aumento HAC1accumulo di proteine ​​(15-25%) in presenza di co-p23 o p19 infiltrato. Per influenzare positivamente la produzione di proteine, soppressori di silenziamento può essere necessario appositamente selezionati per essere efficace per le specie vegetali bersaglio e vettore virale 63. TMV elicasi ha un soppressore dell&#39;attività del silenziamento dell&#39;RNA 64,65. I nostri dati confermano questa osservazione come co-infiltrazione di p23 o p19 con pBID4-HAC1 comportato alcun aumento di GFP o un leggero aumento della produzione di proteine ​​HAC1 transitoria. In conclusione, abbiamo modificato e ottimizzato pianta e condizioni di crescita tumefaciens e migliorato l&#39;efficienza di infiltrazione sotto vuoto. Questa tecnologia ci ha permesso di crescere e infiltrarsi centinaia di chilogrammi di materiale vegetale in poche ore. Abbiamo automatizzato con successo la pianta tecnica espressione transitoria per la produzione di vaccini high-throughput a bilance industriali sotto current Good Manufacturing Practices (cGMP) condizioni. Per ulteriori informazioni about automazione ed utilizzazione transitoria sistema di produzione di proteine ​​per la produzione di proteine ​​ricombinanti, inclusa candidati vaccini subunità, in condizioni di cGMP, si rimanda al sito <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

Le piante sono ormai riconosciuto come una piattaforma sicura, affidabile, scalabile ed economica per la produzione di biofarmaci ricombinanti eterologhi e proteine ​​industriali 1-3 e avere importanti vantaggi rispetto ai sistemi di espressione delle cellule microbiche e animali 4. Le piante sono in grado di esprimere le proteine ​​ripiegate correttamente con modificazioni post-traslazionali, tra cui gli anticorpi multimerici assemblati 5-7. Diverse proteine ​​farmaceutiche ricombinanti derivati ​​da piante sono in fase di valutazione clinica 8. Questi includono i vaccini paziente-specifici ricombinanti idiotipo (scFv) per il trattamento del linfoma non-Hodgkin 9, pandemia a base di emoagglutinina e stagionali candidati vaccino influenzale 10,11 (Cummings et al., Presentato al vaccino), anti-antigene di superficie Streptococcus I / anticorpo II per il trattamento della carie dentale 12, e l&#39;insulina umana per il trattamento del diabete 13. Inoltre, reco umanaglucocerebrosidasi mbinant per la terapia enzimatica sostitutiva nei pazienti con malattia di Gaucher è stato approvato in Israele e negli Stati Uniti ed è previsto nell&#39;ambito del programma di accesso allargato al di fuori degli Stati Uniti 14,15. Proteine ​​eterologhe possono essere prodotti in modo stabile trasformato (transgenici o transplastomic) o transitoriamente piante trasformate. Produzione di proteine ​​Transient offre diversi vantaggi rispetto alla produzione in piante transgeniche, incluse breve periodo di tempo per ottenere espressione e di accumulo 16, e può essere realizzata introducendo vettori binari batteriche o vettori virali vegetali ricombinante nei tessuti vegetali 4. Il sistema più avanzato espressione transiente è basato sull&#39;uso di «vettori di lancio &#39;che combinano componenti di virus vegetali e plasmidi binari, e sono forniti da agroinfiltration 17,18. Agroinfiltration di un vettore lancio basato su virus del mosaico del tabacco (TMV) è stata applicata con successo al laboratorioscala per la produzione di antigeni vaccinali contro gli agenti patogeni come il virus del papilloma umano 19, Yersinia pestis 20, influenza virus A 21,22, Bacillus anthracis 23, e il virus del vaiolo 24 in N. benthamiana lascia. mediata da Agrobacterium espressione transiente è anche un metodo promettente per la produzione simultanea di più proteine ​​2,25-27. Ad esempio, i sistemi di espressione transiente vegetali sono stati utilizzati per produrre anticorpi ricombinanti tumore-specifici 28,29, un anticorpo ricombinante glicosilata contro il fattore di crescita epidermico 30, e un anticorpo monoclonale specifico per antrace antigene protettivo 31,32. Co-infiltrazione di Nicotiana benthamiana piante con un gene target e un soppressore dei risultati silenziamento genico in una maggiore espressione della proteina bersaglio 33,34. Agroinfiltration è un metodo comune per introdu uniformementebatteri cendo che ospitano un gene di interesse in pianta tessuti 35-37. Vacuum infiltrazione di Agrobacterium per l&#39;espressione genica transiente in pianta intatta foglie è un metodo rapido, scalabile, e utile per la produzione di proteine ​​estranee, senza la necessità di generare piante transgeniche 38-41. Durante agroinfiltration vuoto, le piante sono capovolte a testa in giù e parti aeree immersi in sospensione Agrobacterium. Poi viene applicato il vuoto causando gas da evacuare dagli spazi intercellulari foglia attraverso gli stomi. Rapid ri-pressurizzazione seguente rilascio dei risultati vuoto nell&#39;infusione della sospensione Agrobacterium nella foglia. A seguito di vuoto infiltrazione di Agrobacteria, le piante vengono ulteriormente coltivate e di espressione obiettivo è monitorato. I più alti livelli di espressione di destinazione vengono tipicamente osservati 2-3 giorni dopo l&#39;infiltrazione (dpi) con un vettore binario e 4-7 dpi con un vettore di lancio, dopo che il livello di espressione tipicamente diminuises 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens è il veicolo più utilizzato per la consegna di un gene di interesse in un impianto per la produzione di proteine. Agroinfiltration funziona particolarmente bene in N. benthamiana ma relativamente poco nella maggior parte delle altre piante, tra cui Arabidopsis thaliana 46. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo semplice, efficiente ed economico per la produzione di proteine ​​transitoria in 5-6 settimane di età N. benthamiana utilizzando A. tumefaciens infiltrazione. Il principale inconveniente di scala industriale della tecnica agroinfiltration è centrifugazione di batteri raccolti e risospensione del pellet batterico in terreno contenente 4&#39;-idrossi-3 &#39;, 5&#39;-dimethoxyacetophenone (acetosyringone), monosaccaridi, e 2 - (N-morfolino) -etansolfonico acido (MES) tampone per l&#39;induzione dei geni Vir. Siamo stati in grado di superare questi problemi, ottimizzando l&#39;Agrobacterium </em&gt; crescita AB medio (minimo) seguita da direttamente diluendo in acqua Milli-Q e controllando la durata e condizioni di infiltrazione. Abbiamo anche confrontato obiettivo di produzione di proteine ​​nella wild-type specie ospite tabacco N. e N. benthamiana excelsior, nonché in ibrido N. excelsiana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana benthamiana</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555478 TW16</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsior</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555685 TW47</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsiana</td>
			<td style="width:221px;">Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td>
			<td style="width:119px;">LSBC EBA 042304.02</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum skid</td>
			<td style="width:221px;">Abbas, Ashland, MA</td>
			<td style="width:119px;">Custom made</td>
			<td style="width:236px;">Plant infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rockwool</td>
			<td style="width:221px;">Grodan Inc., Ontario, Canada</td>
			<td style="width:119px;">AO 50/40</td>
			<td style="width:236px;">Hydroponic media for growing plant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid</td>
			<td style="width:221px;">Acros Organics, Thermo Fisher Scientific&#160; 
			NJ</td>
			<td style="width:119px;">172595000</td>
			<td style="width:236px;">Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog salt (MS salt)</td>
			<td style="width:221px;">Phyto Technology Lab</td>
			<td style="width:119px;">M524</td>
			<td style="width:236px;">Tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">D134406-5G</td>
			<td style="width:236px;">Agrobacterium induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immobilon-P transfer membrane</td>
			<td style="width:221px;">Millipore, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">I-block</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems, Foster City, CA</td>
			<td style="width:119px;">T2015</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Washington Biotechnology, Baltimore, MD&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti&#8211;poly-histidine monoclonal antibody</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen GmbH, Hilden</td>
			<td style="width:119px;">34670</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperSignal&#174; West Pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td>
			<td style="width:119px;">34078</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td>
			<td style="width:221px;">Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P-LICHN</td>
			<td style="width:236px;">Lichenase Activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Congo Red&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">C6277&#160;</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital camera&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Olympus, Center Valley, PA</td>
			<td style="width:119px;">C-8080</td>
			<td>Chemiluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneGnome</td>
			<td style="width:221px;">Syngene, Frederick, MD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP standard&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Made in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plant fertilizer solution</td>
			<td style="width:221px;">Griffin Greenhouse &#38; Nursery Supplies, Newark, DE</td>
			<td style="width:119px;">67-23-20</td>
			<td>Plant growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lichenase Standard</td>
			<td style="width:221px;">Purified in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BioRad, Hercules, CA&#160;</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>Agrobacterium transformation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana

Produzione di proteine ​​transiente mediata da Agrobacterium in piante è un metodo promettente per produrre antigeni e proteine ​​terapeutiche entro un breve periodo di tempo. Tuttavia, questa tecnologia è solo cominciando ad essere applicate alla produzione come molti ostacoli tecnologici su larga scala per scalare vengono ora superati. Qui, dimostriamo un metodo semplice e riproducibile per la produzione su scala industriale di proteine ​​transitorio basato su vuoto infiltrazione di piante di Nicotiana con Agrobacteria trasportano vettori di lancio. Ottimizzazione della coltivazione Agrobacterium in AB mezzo permette diluizione diretta della coltura batterica in acqua Milli-Q, semplificando il processo di infiltrazione. Tra le tre specie testate di Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) è stato selezionato come host più promettente a causa della facilità di infiltrazione, elevato livello di giornalista produzione di proteine, e circa due-fvecchio maggiore produzione di biomassa in condizioni ambientali controllate. Induzione di Agrobacterium ospitare pBID4-GFP (virus del mosaico del tabacco-based) con prodotti chimici quali acetosyringone e monosaccharide ha avuto alcun effetto sul livello di produzione di proteine. Pianta infiltrandosi sotto 50 a 100 mbar per 30 o 60 secondi provocato circa il 95% infiltrazione dei tessuti foglia della pianta. Infiltrazione con ceppo di laboratorio Agrobacterium GV3101 ha mostrato la più alta produzione di proteine ​​rispetto al Agrobacteria ceppi di laboratorio LBA4404 e C58C1 e wild-type Agrobacteria ceppi at6, AT10, at77 e A4. Co-espressione di un silenziamento dell&#39;RNA virale soppressore p23 e p19, in N. benthamiana portato ad un accumulo precedente e un aumento della produzione (15-25%) di proteine ​​bersaglio (emoagglutinina virus dell&#39;influenza).

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Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Produzione di proteine ​​transitoria nelle piante di Nicotiana sulla base di infiltrazione sottovuoto con Agrobacteria trasportando i vettori di lancio (Tobacco Mosaic Virus-based) è un approccio rapido ed economico per la produzione di antigeni e proteine ​​terapeutiche. Abbiamo semplificato la procedura e migliorato l&#39;accumulo di destinazione ottimizzando le condizioni di coltivazione batteri, selezionando specie ospite e co-introduzione di silenziamento dell&#39;RNA soppressori.

Ottimizzazione e utilizzo di<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediata transitoria produzione di proteine ​​in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

optimization-utilization-agrobacterium-mediated-transient-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

41.2K Views.  Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology.  Produzione di proteine ​​transitoria nelle piante di Nicotiana sulla base di infiltrazione sottovuoto con Agrobacteria trasportando i vettori di lancio (Tobacco Mosaic Virus-based) è un approccio rapido ed economico per la produzione di antigeni e proteine ​​terapeutiche. Abbiamo semplificato la procedura e migliorato l'accumulo di destinazione ottimizzando le condizioni di coltivazione batteri, selezionando specie ospite e co-intr...

Video: Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

Produzione di replica-difettoso da Retrovirus trasfezione transiente di cellule 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Ricerca

Biologia

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

Un metodo per la produzione di proteine ​​ricombinanti mCD1d in cellule di insetto.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virale silenziamento genico (VIGS) in Nicotiana benthamiana E Pomodoro

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Mediata da Agrobacterium Virus-Induced tacere Assay Gene In Cotone

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

Produzione di Microarrays tessuto, colorazione immunoistochimica e digitalizzazione All&#39;interno della Atlas proteina umana

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

Agroinfiltrazione e Agroinfezione PVX in Benthamiana di Patate e Nicotiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...