Questo lavoro è stato sostenuto da Innovative Giovane Biotechnologist Award BT/BI/12/040/2005 e BT/PR13289/BRB/10/745/2009 concessione dal Dipartimento di Biotecnologie, Governo dell&#39;India e dei fondi fondamentali del Centro per l&#39;impronta digitale del DNA e diagnostica, Hyderabad. MNR e GB sono i destinatari di Junior e Senior Research Fellowships del Consiglio di ricerca scientifica e industriale verso il perseguimento di un dottorato di ricerca dell&#39;Università Manipal. SB è il destinatario di Junior e Senior Research Fellowship del Dipartimento di Biotecnologie verso il perseguimento di un dottorato di ricerca dell&#39;Università Manipal.

Si consiglia di eseguire C. glabrata esperimenti di infezione in un laboratorio con livello di biosicurezza di contenimento 2 (BSL-2). <ol><li> Preparazione di THP-1 macrofago monostrato. </li><li> Preparazione di C. sospensione cellulare glabrata. </li><li> Infezione di cellule THP-1 macrofagi con C. cellule glabrata. </li><li> Misurazione della frequenza fagocitosi e replicazione intracellulare tramite unità formanti colonie saggio. </li><li> Monitoraggio della replica intracellulare mediante microscopio confocale a scansione laser. </li></ol> 1. Preparazione di THP-1 macrofagi Monolayer <ol><li> THP-1 è una linea cellulare monocitica umana derivata dal sangue periferico di un 1 anni figlio maschio affetto da leucemia monocitica 14. THP-1, una linea cellulare di sospensione, viene normalmente mantenuta a 37 ° C in umidificata al 5% di CO 2 nel terreno di coltura RPMI-1640 supplementato con 10% FBS (siero fetale bovino). Il trattamento con phorbol 12-myristaTE 13-acetato (PMA, un estere del forbolo) provoca differenziazione terminale di cellule THP-1 monociti in macrofagi. È importante sottolineare che il trattamento PMA non pregiudica la vitalità cellulare e le cellule differenziate non si dividono. </li><li> Seme circa 1,5 x 10 6 THP-1 monociti in 100 piatti mm cultura in RPMI-1640 completa (medio RPMI-1640 integrato con il 10% di siero, glutammina 2 mM e 1x antibiotici, 10 ml / piatto) e lasciare le cellule crescono a 37 ° C in 5% CO 2 per 2 giorni. </li><li> Una volta THP-1 le cellule hanno raggiunto una densità di 8 x 10 5 cellule / ml, trasferire il piatto cultura alla cappa di coltura cellulare a flusso laminare e agitare delicatamente per risospendere le cellule insediate. </li><li> Pipettare la sospensione cellulare, posizionate in una provetta sterile 15 ml e centrifugare a 1000 rpm (130 xg) per 4 min. Gettare il surnatante e sospendere THP-1 pellet di cellule in 5 ml fresco, preriscaldata, medie completo RPMI-1640. </li><li> Enumerare le celle con un emocitometro e diluire il celsospensione l per una densità finale di 10 6 cellule / ml con mezzo completo RPMI preriscaldata-1640 </li><li> Aggiungere 1 ml di 160 mM PMA magazzino (phorbol soluzione di 13-acetato 12-myristate preparato in dimetilsolfossido) a 10 ml THP-1 sospensione cellulare (concentrazione finale 16 nM) e mescolare bene. Pipettare 1 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti ed incubare piastra in incubatore mantenuto a 37 ° C con 5% di CO 2 per 12 ore. </li><li> Rimuovere il vecchio mezzo, aggiungere 1 ml preriscaldata RPMI-1640 completa e consentono alle cellule di recuperare per 12 ore a 37 ° C in 5% di CO 2. </li><li> Osservare le cellule sotto un microscopio invertito per garantire che forma ovale cellule THP-1 monocitiche in sospensione sono stati differenziati in appiattite, macrofagi mandrino a forma e aderenti. Queste cellule differenziate sono ora pronti a condurre C. Gli studi di infezione glabrata. </li></ol> 2. Preparazione di C. glabrata &amp; #Sospensione cellulare; 160 C. glabrata ceppo selvatico Bg2 verrà utilizzato per infettare THP-1 macrofagi. C. cellule glabrata sono ordinariamente coltivate in YPD liquido (estratto di lievito (1%)-Peptone (2%)-destrosio (2%)) medio. Mezzo YPD solido viene preparata aggiungendo 2% agar prima media autoclave. <ol><li> Per preparare una coltura di C. glabrata, scegliere una singola colonia su dalla piastra di agar con una sterile, monouso ciclo e inoculare in 10 ml di mezzo YPD liquido e incubare per 14-16 ore con agitazione (200 rpm) a 30 ° C. </li><li> Centrifugare questa cultura (1 ml) a 4.000 giri (1.800 xg) per 5 minuti in una microcentrifuga da tavolo superiore, lavare le cellule tre volte con PBS sterile (PBS, pH 7,4) e sospendere pellet di cellule in 1 ml di PBS. </li><li> Misurare OD 600 di C. sospensione cellulare glabrata e diluire con un volume adeguato di PBS sterile per ottenere una densità di 2 x 10 6 cellule / ml (OD 600= 0.1). In alternativa, la densità cellulare desiderata può essere ottenuta contando le cellule di lievito con un emocitometro. </li></ol> 3. Infezione di cellule THP-1 Macrofagi con C. Celle glabrata <ol><li> Aggiungere 50 microlitri C. sospensione cellulare glabrata di THP-1 macrofagi (10 6 cellule seminate in ogni pozzetto di una piastra di coltura a 24 pozzetti) per ottenere un MOI (molteplicità di infezione) di 0,1 e Incubare la piastra a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Per determinare i conteggi vitali di lievito, diluire 50 ml C. glabrata cell sospensione 100 volte in PBS sterile e piatto 100 microlitri su terreno solido YPD. Incubare le piastre a 30 ° C e contare manualmente il numero di colonie di lievito che compaiono dopo 1-2 giorni. Questi numeri, d&#39;ora in poi, essere indicate come 0 hr C. glabrata CFU (unità formanti colonie). </li><li> Dopo 2 ore coculturing di cellule THP-1 con C. cellule glabrata, terreno di coltura di rigetto invertendo 24-pozzetti di coltura tissutale ina serbatoio e lavare delicatamente tre volte con PBS sterile preriscaldata per rimuovere nonphagocytosed extracellulare C. cellule glabrata. Lavaggi delicati con PBS sono assolutamente essenziali per realizzare la completa rimozione di tutti lievito extracellulare senza causare alcun danno al THP-1 macrofagi monostrato. </li></ol> 4. Misurazione della fagocitosi Rate e intracellulare replica tramite Colony Forming saggio Unità <ol><li> Lyse C. glabrata infettato THP-1 macrofagi in 1 ml sterile H 2 O per 2 min, raschiare delicatamente per rimuovere i detriti macrofago dal pozzo e raccogliere lisato cellulare in una provetta da microcentrifuga. Verifica microscopica di completa lisi dei macrofagi è fondamentale per il recupero di tutti lievito interiorizzato. </li><li> Preparare una diluizione 100 volte di lisato in PBS sterile, piatto 100 microlitri su terreno solido YPD e incubare le piastre a 30 ° C. </li><li> Dopo 1-2 giorni, contare manualmente il numero di C. glabrata colonie che appeared su terreno YPD, si moltiplicano con fattore di diluizione (2 ore CFU) e calcolare tasso di fagocitosi che si riferisce alla percentuale di C. cellule glabrata che vengono ingerite da THP-1 macrofagi dopo 2 ore coincubation utilizzando la seguente formula. % Fagocitosi = [(CFU a 2 h) / (CFU a 0 h)] X 100 </li><li> Per misurare la velocità di replicazione intracellulare di C. cellule glabrata in THP-1 macrofagi, raccolgono lievito intracellulare in tempi diversi punti dall&#39;infezione esempio. 4, 6, 8, 10, 12 e 24 ore, ripetendo i passaggi 3,3-4,3. </li><li> Calcola piega sopravvivenza / replica di C. cellule glabrata in THP-1 macrofagi dividendo CFU totali in qualsiasi punto del tempo con quelli di 2 ore (lievito fagocitati). </li></ol> 5. Monitoraggio della replica intracellulare Uso confocale Laser Microscopia a Scansione <ol><li> Seguendo i passi descritti nella Sezione 1, sementi PMA-trattati 5 x 10 5 cellule THP-1 in ciascun pozzetto di due diapositive da camera a quattro pozzetti e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per 12 ore. </li><li> Sostituire il vecchio mezzo con preriscaldata RPMI-1640 completa e consentono alle cellule di recuperare dal trattamento PMA per 12 ore. </li><li> Preparare GFP (green fluorescent protein)-tagged C. sospensione cellulare glabrata come descritto nella Sezione 2 e infettare di THP-1 macrofagi ad una MOI di 1. Se C. glabrata ceppi che esprimono GFP non sono disponibili, le cellule di lievito marcate con FITC (fluoresceina isotiocianato) possono essere utilizzati per monitorare eventi precoci dall&#39;infezione vale a dire. tasso di fagocitosi e fagolisosomale maturazione a 2 ore. </li><li> Incubare i vetrini per 2 ore a 37 ° C con 5% di CO 2, capovolgere con attenzione a scartare medie e lavare 3x con sterile, preriscaldata PBS. </li><li> Aggiungere 500 ml preriscaldata RPMI-1640 medi completoum a ciascuna camera di uno scivolo e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per 22 hr. </li><li> Per risolvere 2 hr C. glabrata-infettati THP-1 macrofagi, aggiungere 500 ml di 3,7% di formaldeide (preparato in PBS) per ciascuna camera dell&#39;altro vetrino ed incubare a temperatura ambiente per 20 minuti al buio. </li><li> Lavare il vetrino tre volte con PBS, aggiungere 500 microlitri Triton-X (0,7%), e incubare a temperatura ambiente per 5 min in scuro. </li><li> 3x diapositive Lavare con PBS, rimuovere camera dalla cultura vetrino e asciugare all&#39;aria per 3-5 minuti al buio. </li><li> Montare con cura un vetrino con mezzo Vectashield di montaggio contenente DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole) sulla trasparenza evitando la formazione di bolle. Rimuovere delicatamente il liquido in eccesso con Kimwipe e sigillare i bordi coprioggetto con smalto per unghie. Conservare scivolo al buio a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Ripetere i punti 5.4 e 5,6-5,9 per elaborare cellule THP-1 24 ore dopo l&#39;infezione. </li><li> Celle di immagine utilizzando un confo scansione lasermicroscopio cal (60X obiettivo ad immersione in olio, eccitazione a 405 nm e 488 nm per DAPI e macchia GFP, rispettivamente). </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Sistema immune innato svolge un ruolo importante nel controllo delle infezioni fungine opportunistiche. I macrofagi contribuiscono alla difesa antimicotici per ingestione e la distruzione del patogeno fungino. Così, delucidazione di fattori che sono necessari per la sopravvivenza e / o contrastare le funzioni antimicrobiche di macrofagi avanzerà la nostra comprensione delle strategie di virulenza fungine. In questo contesto, abbiamo stabilito un sistema cellulare modello vitro in coltura utilizzando macrofagi derivati ​​da una linea cellulare monocitica umana THP-1 per caratterizzare l&#39;interazione di un patogeno fungino opportunistica umana C. glabrata con fagociti ospiti. Sebbene questo THP-1 sistema modello macrofago è stato usato con successo per identificare C. mutanti glabrata con ridotta sopravvivenza che mostrava virulenza attenuata in un modello murino di candidosi sistemica 8, una limitazione plausibile di questo sistema è il suo contesto isolato e, quindi, i risultati ottenuti non possonosempre applicabile per il complesso sistema immunitario ospite mammifero. Inoltre, questo sistema, a differenza dei metodi di imaging cellulare dal vivo, è in grado di spiegare cellule di lievito che non sono o assorbiti dalle THP1-macrofagi o sacrificati durante la fagocitosi. Il significato di questo protocollo sta nella sua semplicità, riproducibilità e scalabilità. Il metodo può essere ridotta ad una piastra a 96 pozzetti e scalata fino a un tessuto matraccio 150 centimetri 2 cultura. I passaggi critici in questo protocollo sono la selezione di un adeguato MOI ed estese lavaggi PBS per ridurre al minimo la replica extracellulare e placcatura di opportuna diluizione lisato di ottenere 100-200 lievito colonie per piastra. Un MOI di 0,1 è ideale per monitorare la replica intracellulare in un periodo di 24 ore il numero di cellule di lievito extracellulari rimane minimo durante questa coculturing prolungato di THP-1 macrofagi con C. cellule glabrata. Inoltre, una MOI di 1,0 è ottimale per la visualizzazione del numero massimo di <em&gt; C. glabrata infetti-macrofagi per campo per analizzare eventi precoci di C. infezione glabrata microscopio senza alcun effetto sui profili replica intracellulari di cellule di lievito. In particolare, extracellulare C. cellule glabrata, tra cui il lievito nonphagocytosed che rimangono attaccati alla membrana dei macrofagi, possono essere differenziati da cellule di lievito interiorizzate da dentro-fuori colorazione 8. Per enumerare specificamente intracellulare di sopravvivenza / replica, il confronto CFU deve essere effettuato tra il numero di lievito interiorizzato a 2 ore e quelli a punti temporali successivi. Confronto con 0 hr CFU sarà falsare i risultati se i tassi di attaccamento e fagocitosi iniziali sono diversi per diversi ceppi. È interessante notare qui che il numero di cellule di lievito intracellulari durante il periodo infezione può anche essere misurata con citometria a flusso e approcci di microscopia confocale imaging cellulare / vivo. Inoltre, intracellulare lievito recuperanorosso a tempi diversi dopo l&#39;infezione usando questo protocollo può essere utilizzato per diverse analisi compreso microscopia, specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) accumulo, estrazione cromatina, e RNA e isolamento delle proteine ​​di discernere il epigenetica, trascrizionale e risposta metabolica delle cellule C. glabrata al milieu interno dei macrofagi. È importante eliminare completamente i lieviti extracellulare e detriti macrofagi prima di eseguire qualsiasi analisi biochimiche su lievito macrofago-internalizzato. Un&#39;altra applicazione di questo sistema cellulare modello di coltura in vitro è la sua adattabilità a mutanti di schermo per i profili di sopravvivenza alterati, individualmente o multiplexati in una piscina di 96 ceppi con firma-tagged mutagenesi approccio (STM). Un vantaggio della strategia STM è la proiezione parallela di centinaia di mutanti in un singolo esperimento. Questo approccio è stato recentemente utilizzato per schermare una C. glabrata li mutantebrary che comprende 18.350 casuali Tn 7 mutanti inserimento e assemblato in un totale di 192 piscine in cui ciascun pool è costituito da 96 mutanti univoco oligonucleotide-etichettati 8 &#39;15. Figura 2 illustra pittoricamente il contorno della metodologia schermo STM che consiste di tre passaggi principali. In primo luogo, una piscina di notte-adulto di 96 C. mutanti glabrata è coltivato sia in mezzo ricco (input) o infetto a THP-1 macrofagi in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Dopo 2 ore l&#39;infezione, le cellule di lievito extracellulari sono rimosse mediante lavaggi con PBS e infettati THP-1 le cellule vengono incubate a 37 ° C. 24 ore dopo l&#39;infezione, le cellule di lievito intracellulari (output) vengono recuperati da osmolysis di cellule THP-1. La seconda fase prevede l&#39;estrazione del DNA genomico da campioni di ingresso e uscita seguita da amplificazione di tag firma unica con 32 P-marcato dCTP usando primERS complementare alla regione invariante fiancheggiante ciascun oligonucleotide sequenza unica. Terzo, tag radiomarcati di piscine ingresso e di uscita sono ibridate ad una membrana Hybond-nylon che contiene 96 plasmidi recanti ciascuno un tag firma unica. Segnale di ibridazione per una sequenza oligonucleotide unico riflette l&#39;abbondanza del ceppo mutante, portando quel particolare tag, in una piscina di 96 mutanti. Uscita (Op) all&#39;ingresso (Ip) rapporto per ogni tag è calcolato dividendo l&#39;intensità del segnale di uscita per l&#39;intensità del segnale di ingresso. Mutanti che mostrano almeno 6 volte superiori e di 10 volte la sopravvivenza inferiore può essere considerato &#39;up&#39; (Op / Ip = 6.0, ha aumentato la sopravvivenza) e (Op / Ip = 0.1, sopravvivenza ridotta) mutanti &#39;giù&#39;, rispettivamente (Figura 2). In alternativa, fluorescenza marcata DNA microarray sonda-dipendenti possono essere utilizzati per determinare qualsiasi variazione nell&#39;intensità del tag in ingresso e l&#39;uscita del segnale campione che rispecchia il comporta intracellulareior del mutante. Questo metodo può anche essere impiegato per studiare ROS e risposta delle citochine e fagolisosomale acidificazione dei fagociti upon infezione con patogeni fungini. Infine, a causa della adattabilità di questa procedura per entrambi, vari tipi di cellule immunitarie comprese le cellule primarie nonché organismi fungini, questo protocollo è adatto per risolvere diversi aspetti di interazione ospite-fungo.

Specie di Candida sono la principale causa di infezioni fungine invasive potenzialmente letali nei pazienti immunocompromessi 1. Candida glabrata, un patogeno nosocomiale emergente, è il secondo o il terzo più frequentemente isolati specie di Candida da pazienti nell&#39;unità di terapia intensiva a seconda della posizione geografica 1-3. Filogeneticamente, C. glabrata, un lievito in erba aploidi, è più strettamente legato alle Saccharomyces non lievito modello patogeno cerevisiae che a patogeni Candida spp. tra cui C. albicans 4. Coerentemente con questo, C. glabrata manca di alcune caratteristiche di virulenza fungine chiave, tra cui l&#39;accoppiamento, attività proteolitica secreto e la plasticità morfologica 4-5. Sebbene C. glabrata non forma ife, può sopravvivere e riprodursi nei macrofagi murini ed umani 6-8 suggerendo che essa ha sviluppato meccanismi di patogenesi unici. Sono disponibili informazioni limitate circa le strategie che C. glabrata impiega per sopravvivere nell&#39;ambiente intracellulare dei macrofagi poveri di nutrienti e contrastare ossidativo e risposte dell&#39;ospite nonoxidative montati da ospite cellule immunitarie 5. Un pertinente modello di sistema dei macrofagi è un prerequisito per delineare l&#39;interazione di C. glabrata con fagociti host tramite approcci di genomica e proteomica funzionale. Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e macrofagi derivate dal midollo osseo (BMDMs) di origine umana e murina, rispettivamente, sono prima stati utilizzati per studiare l&#39;interazione di C. glabrata con ospite cellule immunitarie 7,9. Tuttavia, la difficoltà nell&#39;ottenere PBMC e BMDMs, la loro durata di vita limitata e la variazione intrinseca tra i diversi donatori mammiferi limitano l&#39;utilizzo di queste cellule sistemi modello come versatili. Qui, descriviamo un metodo per la creazione di un sistema in vitro per studiare la intracellulcomportamento ar di C. cellule glabrata in macrofagi derivati ​​dalla linea cellulare monocitica umana THP-1. L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di stabilire un modello di sistema di coltura cellulare semplice, poco costoso, veloce e riproducibile che può essere facilmente manipolato per studiare diversi aspetti di interazione ospite-patogeno fungino. Cellule THP-1 sono stati precedentemente utilizzati per decifrare la risposta immunitaria contro una vasta gamma di agenti patogeni quali batteri, virus e funghi 10-12. Monocitaria THP-1 le cellule sono di facile manutenzione e possono essere differenziati, previo trattamento esteri phorbol, ai macrofagi che imitano i macrofagi derivate da monociti di risorse umane ed esprimono adeguatamente i marcatori macrofagi 13. I principali vantaggi di THP-1 sistema modello macrofagi sono la facilità d&#39;uso e la mancanza di sofisticate apparecchiature requisito. Il protocollo qui presentato è facilmente adattabile a studiare l&#39;interazione di altri patogeni fungini umani con host cellule immunitarie. L&#39;attuale procedura può anche essere impiegato per identificare i fattori di virulenza per l&#39;agente patogeno di interesse utilizzando schermi mutanti alto rendimento. Questa prova di concetto è stato esemplificato dal successo nell&#39;uso di THP-1 sistema modello di coltura per identificare un insieme di 56 geni che sono necessari per la sopravvivenza di C. glabrata in macrofagi umani 8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:40px;width:163px;">THP-1</td>
			<td style="width:105px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:85px;">TIB 202</td>
			<td style="width:243px;">Human acute monocytic leukemia cell line</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:105px;">Hyclone</td>
			<td style="width:85px;">SH30096.01</td>
			<td style="width:243px;">For maintaining THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:105px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:85px;">P 8139</td>
			<td style="width:243px;">Caution: Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">YPD&#160;</td>
			<td style="width:105px;">BD-Difco</td>
			<td style="width:85px;">242710</td>
			<td style="width:243px;">For growing Candida glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:105px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:85px;">F8775</td>
			<td style="width:243px;">For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,&#160; pH 7.4) for washes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Saline-sodium citrate (SSC)&#160;</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Prehybridization buffer</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (50% formamide, 5x Denhardt&#8217;s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">VECTASHIELD mounting medium</td>
			<td style="width:105px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:85px;">H-1200</td>
			<td style="width:243px;">For mounting slides for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">32P-labeled &#945;-dCTP</td>
			<td style="width:105px;">JONAKI-BARC</td>
			<td style="width:85px;">LCP-102</td>
			<td style="width:243px;">For radiolabeling of signature tags</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">100 mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:105px;">Corning</td>
			<td style="width:85px;">430167</td>
			<td style="width:243px;">To culture THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">24-well tissue culture plate</td>
			<td style="width:105px;">Corning</td>
			<td style="width:85px;">3527</td>
			<td style="width:243px;">To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">4-chamber tissue culture-treated glass slide</td>
			<td style="width:105px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:85px;">REF354104</td>
			<td style="width:243px;">To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:105px;">Rohem India</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">For enumeration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Table top microcentrifuge</td>
			<td style="width:105px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:85px;">Microfuge 18</td>
			<td style="width:243px;">For spinning down cells in microtubes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Table top centrifuge</td>
			<td style="width:105px;">Remi</td>
			<td style="width:85px;">R-8C</td>
			<td style="width:243px;">For spinning down cells in 15 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:105px;">Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:85px;">Ultraspec 10</td>
			<td style="width:243px;">To monitor absorbance of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Plate incubator</td>
			<td style="width:105px;">Labtech</td>
			<td style="width:85px;">Refrigerated</td>
			<td style="width:243px;">To grow C. glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Shaker incubator</td>
			<td style="width:105px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:85px;">Innova 43</td>
			<td style="width:243px;">To grow C. glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Water jacketed CO2&#160; incubator</td>
			<td style="width:105px;">Thermo Electron Corporation</td>
			<td style="width:85px;">Forma series 2</td>
			<td style="width:243px;">To culture THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:105px;">Carl Ziess</td>
			<td style="width:85px;">Ziess LSM 510 meta&#160;</td>
			<td style="width:243px;">To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td style="width:85px;">CKX 41</td>
			<td style="width:243px;">To observe C. glabrata and THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">PCR machine</td>
			<td style="width:105px;">BioRad&#160;</td>
			<td style="width:85px;">DNA Engine</td>
			<td style="width:243px;">To amplify unique tags from input and output genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Hybridization oven</td>
			<td style="width:105px;">Labnet</td>
			<td style="width:85px;">Problot 12S</td>
			<td style="width:243px;">For hybridization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PhosphorImager</td>
			<td style="width:105px;">Fujifilm</td>
			<td style="width:85px;">FLA-9000</td>
			<td style="width:243px;">For scanning hybridized membranes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:85px;">Thermomixer Comfort</td>
			<td style="width:243px;">For denaturation of radiolabeled signature tags</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:163px;">Gel documentation unit</td>
			<td style="width:105px;">Alphainnontech</td>
			<td style="width:85px;">Alphaimager</td>
			<td style="width:243px;">To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an in vitro system to study intracellular behavior of candida glabrata in human thp-1 macrophages

Un sistema cellulare modello di coltura, se un vicino mimo di condizioni ambientali ospitanti, può servire come un&#39;alternativa economica, riproducibile e facilmente manipolabile per sistemi modello animale per lo studio di una fase specifica di infezione microbica patogeno. Una linea cellulare monocitica umana THP-1 che, al momento phorbol trattamento estere, è differenziato in macrofagi, è già stata utilizzata per studiare le strategie di virulenza di molti patogeni intracellulari, tra cui Mycobacterium tuberculosis. Qui, discutiamo un protocollo di emanare una cellula in vitro modello di cultura sistema che utilizza THP-1 macrofagi per delineare l&#39;interazione di un opportunista lievito Candida glabrata agente patogeno umano con fagociti host. Questo sistema modello è semplice, veloce, suscettibili di schermi mutanti high-throughput, e non richiede attrezzature sofisticate. Un tipico esperimento THP-1 infezione dei macrofagi richiede circa 24 ore con un ulteriore 24-48 ore per permettere intracellulare recuperatolievito di crescere su terreno ricco di formanti colonia analisi fattibilità basato su unità. Come altri sistemi modello in vitro, un possibile limite di questo approccio è la difficoltà di estrapolare i risultati ottenuti da una circuiteria cellule immunitarie altamente complesso esistente nell&#39;ospite umano. Tuttavia, nonostante questo, l&#39;attuale protocollo è molto utile per chiarire le strategie che un patogeno fungino può utilizzare per eludere / contrastare risposta antimicrobica e sopravvivere, adattarsi e proliferare in un ambiente povero di nutrienti delle cellule immunitarie dell&#39;ospite.

Infezione analisi di PMA trattati THP-1 macrofagi con C. tipo selvatico glabrata (wt), le cellule hanno rivelato che le cellule wt stati fagocitati dai macrofagi ad un tasso del 55-65% dopo 2 ore coincubation. Inoltre, C. glabrata cellule erano in grado di resistere uccisione da parte THP-1 macrofagi ed hanno subito un moderato 5 - a 7 volte maggiore CFU dopo 24 ore di coculturing con THP-1 macrofagi 8. Replica intracellulare di cellule di tipo selvatico, trasformate con GFP che esprimono plasmide, in THP-1 macrofagi stato inoltre verificato con microscopia confocale in cui il numero di cellule di lievito intracellulari per THP-1 macrofago aumentato da uno o due per sette a dodici su un periodo di 24 ore (Figura 1). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50625/50625fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50625/50625fig1.jpg" /> Figura 1. Una immagine confocale di formaldeide fisso, GFP-tagged C. glabrata-infettati THP-1 macrofagi che espongono la replica intracellulare di cellule THP-1 ospitare 1-2 e 5-8 lievito in 2 ore e 24 ore, rispettivamente. nuclei sono colorati con DAPI. Barra = 10 micron. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50625/50625fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50625/50625fig2.jpg" /> Figura 2. Rappresentazione schematica del C. glabrata schermata della libreria mutante per i profili di sopravvivenza alterati in THP-1 macrofagi tramite mutagenesi firma targhetta (STM) approccio. rossi e cerchi verdi su membrane ibridati denotano ridotti ed elevata rappresentanza delle modifiche, rispettivamente, in campioni di uscita rispetto ai campioni di ingresso.

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Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

L&#39;attuale articolo descrive un protocollo per stabilire un sistema cellulare modello di coltura in vitro per studiare l&#39;interazione di una facoltativo intracellulare patogeno fungino umano Candida glabrata con i macrofagi umani che saranno un utile strumento per far progredire la nostra conoscenza dei meccanismi di virulenza fungine.

Istituzione di un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema per studiare intracellulare Comportamento<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In umani THP-1 macrofagi

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

establishment-an-vitro-system-to-study-intracellular-behavior-candida

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

11.5K Views.  Centre for DNA Fingerprinting and Diagnostics, Andhra Pradesh, India.  L'attuale articolo descrive un protocollo per stabilire un sistema cellulare modello di coltura in vitro per studiare l'interazione di una facoltativo intracellulare patogeno fungino umano Candida glabrata con i macrofagi umani che saranno un utile strumento per far progredire la nostra conoscenza dei meccanismi di virulenza fungine. 

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piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

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Immunologia e infezioni

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Studio di fagolisosoma Biogenesis nei macrofagi in diretta

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Uso di<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Per studiare le interazioni autofagia-Citoscheletro

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Trasfezione altamente efficiente di umani THP-1 da macrofagi Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

L&#39;applicazione di un sistema di espressione inducibile per studiare interferenza di fattori batterici di virulenza con segnalazione intracellulare

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...