Ringraziamo il dottor Grant Sumida per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un Premio Giovani Investigator Beckman (SY), una famiglia Hellman New Faculty Award (SY), EUREKA NIH, l&#39;Università della California Cancer Research Coordinating Committee.

1. Generazione di linee cellulari stabili (per esempio cellule MDCK) <ol><li> Cellule di germi a 80-90% confluenza in un piatto p35. Non lasciate che le cellule forma al 100% monostrato confluenti, che ridurrà l&#39;efficienza di trasfezione. </li><li> Trasfezione delle cellule con il plasmide di interesse utilizzando Lipofectamine 2000. Ottimizzare le condizioni di transfezione utilizzando il protocollo del produttore. </li><li> Il giorno dopo, il passaggio delle cellule in due p150 piastre Petri. Il grande piatto è consigliato per permettere distanza sufficiente tra le colonie stabili. </li><li> Il giorno dopo, cambiare i media e aggiungere 500 mg / ml di G418 per ogni piatto. La concentrazione G418 dovrebbe essere ottimizzato per le linee di cellule singole. </li><li> Sostituzione dei supporti a giorni alterni per circa 2 settimane. Dopo 2 settimane, G418 resistenti colonie dovrebbe iniziare a formare, e sarà visibile ad occhio nudo. </li><li> Utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza, identificare le colonie GFP positive. Segna queste colonie sulla piastra con una penna Sharpie. </li><li> Per selettivamente trypsinize le colonie dalla piastra di coltura tissutale, aspirare i mezzi di comunicazione, e lavare le cellule due volte con PBS o soluzione tripsina. Al secondo lavaggio, non aspirare fuori tutta la soluzione. Lascia un sottile strato di liquido sul fondo del piatto per evitare che le cellule si asciughi. </li><li> Per ogni colonia segnato: utilizzare un batuffolo di cotone sterile per pulire il più possibile intorno al bordo della colonia. Questo creerà un &#39;isola di zona umida contenente la colonia di cellule. Pipettare 10 ml di tripsina sulla colonia. Ripetere l&#39;operazione per ogni colonia, e procedere rapidamente per evitare l&#39;essiccamento. Un ricercatore esperto di solito può scegliere ~ 12 colonie per piastra p150. </li><li> Incubare piastra a 37 ° C per 5-10 minuti fino a quando le cellule si staccano dal piatto e appaiono rotondo. </li><li> Per ogni colonia: Pipettare 10 ml di tripsina sulla colonia, e la pipetta su e giù per un paio di volte per staccare le cellule dalla piastra. Pipettare quindi tutte le cellule dalla colonia in un singolo pozzo in un piatto ben 24. </li> &lt;li&gt; Dopo colonie stabili sono cresciuti, espressione di proteine ​​di ogni colonia è analizzata utilizzando standard di western blot e immunofluorescenza. Espandere queste linee cellulari per ulteriori analisi. </li></ol> 2. Modifica della superficie di piatto fondo di vetro per la rilegatura collagene ottimale (opzionale) <ol><li> Per silanize il vetro, pipetta 300 ul del 2% 3-Aminopropyltrimethoxysilane soluzione sulla parte in vetro di ogni piatto p35 con apertura 10 mm. Vedere la Figura 1 per la silanizzazione e cross-linking schematico. 3-Aminopropyltrimethoxysilane viene diluito in acqua filtrata. </li><li> Incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il 3-Aminopropyltrimethoxysilane soluzione e lavare con acqua filtrata tre volte per 10 minuti ciascuno. </li><li> Aspirare i piatti l&#39;acqua e posto sulla piastra calda impostata a 50 ° C per 1,5 ore. Cime luogo di piatti leggermente fuori il piatto in modo che l&#39;umidità nel piatto può sfuggire. </li><li> Togliere dal fuoco e piatti permettono di cool. </li><li> Pipettare 300 ml di soluzione di glutaraldeide al 2% sulla parte in vetro di ogni piatto. La glutaraldeide viene diluito in PBS. </li><li> Incubare per 1 ora. </li><li> Aspirare la soluzione di glutaraldeide e lavare i piatti con PBS per tre volte per 10 minuti ciascuno. </li><li> Sterilizzare i piatti da esposizione a luce UV per 1 ora. I piatti silanizzata possono essere conservati a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Preparazione del gel di collagene 3D con le particelle traccianti <ol><li> Lavare le particelle traccianti fluorescenti riducendo la velocità 100 l di brodo di particelle traccianti (10 10 particelle / ml) in una centrifuga a 15.000 rpm per 5 minuti, aspirare liquido fuori, e aggiungere 500 ml di media. Ripetere 5 volte. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, risospendere le particelle in 30 l di media. </li><li> Trypsinize cellule GFP che esprimono come al solito. </li><li> Risospendere il pellet cellulare di circa 2 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Pipettare 240 ml di terreni di crescita in una provetta Eppendorf. </li><li> Aggiungere 12,6 ml di Hepes 1M, 20 ml di acqua filtrata, 50 ml di soluzione di cellule, poi 10 ml di particelle fluorescenti. </li><li> Infine, aggiungete 167 ml di derma collagene bovino soluzione (per ottenere una concentrazione di lavoro di 1 mg / ml). </li><li> Mescolare accuratamente una soluzione, poi pipetta 80 ml di soluzione sulla parte in vetro del piatto silanizzata fondo di vetro. </li><li> Piatto posto in incubatrice e consentire al gel di polimerizzare a 37 ° C per 30 minuti. Vedi Figura 1A per il gel di collagene tipica in un piatto fondo di vetro p35. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreni di crescita con attenzione per ogni piatto. </li></ol> 4. Procedura per la time-lapse di acquisizione di immagini <ol><li> Accendere il controllo della temperatura della custodia microscopio e lasciare la camera di portata equilibrare a una temperatura allo stato stazionario a 37 ° C. Vedere la Figura 2 per un esempio di live-cell sistema di imaging. </li><li> Modificare i media ai nuovi media integrati con 25 mM Hepes a mantenere un pH neutro. PerDIC immagini, scambio la parte superiore del piatto con uno che ha un piano in vetro. Utilizzando una sottile striscia di parafilm, coprire il lato del piatto per evitare l&#39;evaporazione dei media. </li><li> Per un obiettivo ad immersione olio, mettere una goccia di liquido ad immersione sull&#39;obiettivo. </li><li> Posizionare il gel di collagene contenente piatto sul palco microscopio, e assicurarsi il piatto entra in contatto con il liquido ad immersione. </li><li> Messa a fuoco il campione e ricerca per le cellule di interesse per l&#39;immagine. Per ridurre al minimo deriva fase, permettono piatto di stabilirsi per circa 45 minuti prima di iniziare una cattura a lungo. </li><li> Specificare i parametri di acquisizione delle immagini. Minimizzare l&#39;esposizione a laser, che potrebbe danneggiare le cellule, modulando la potenza del laser, il tempo di esposizione, la frequenza e la durata del tempo di acquisizione. I parametri di effettiva varia a seconda del sistema di microscopio e tipo di cellula. </li><li> Durante il time-lapse di acquisizione, un inibitore può essere aggiunto. Per l&#39;esperimento Inoltre inibitore, non sigillare il piatto con parafilm. <ol><li> PrepHepes sono integrati con i media farmaco ad una concentrazione di lavoro desiderato. </li><li> Quando si è pronti per aggiungere farmaco ai media, mettere in pausa la cattura delle immagini, e rimuovere con attenzione la parte superiore piatto senza disturbare il piatto. </li><li> Aspirare i mezzi di comunicazione nel piatto, e pipetta il farmaco contenente mezzi di comunicazione nel piatto. Poi, con cura sostituire il top piatto. </li><li> Il campione può essere out-of-focus per l&#39;aggiunta dei nuovi media, regolare la messa a fuoco. </li><li> Riavviare la cattura, quindi monitorare la cattura per i prossimi 30 minuti, e regolare la messa a fuoco, se necessario. Vedi Figura 4 per un esempio di esperimento di droga oltre. </li></ol></li></ol> 5. FRAP procedura e analisi <ol><li> Il setup FRAP varia tra i sistemi, seguite le istruzioni del produttore. </li><li> Impostare i parametri per il live-cell imaging. </li><li> Impostare i parametri per photobleaching. Usare il potere sufficiente laser per photobleach il segnale fluorescente senza danneggiare la cellula. Prova questi parameters sulle cellule pratica. </li><li> Avviare la cattura delle immagini, e attendere almeno 5 fotogrammi della cattura dell&#39;immagine prima photobleaching la regione di interesse. </li><li> Continua la cattura, e il tempo di recupero dovrebbe essere sufficiente a catturare il pieno recupero di fluorescenza. Vedere la Figura 5 per un esempio di esperimento di FRAP. </li><li> Analizzare il recupero di fluorescenza, misurando l&#39;intensità media di fluorescenza nell&#39;area fotodecolorate (prima e dopo photobleaching) nel tempo. Utilizzando un software di analisi statistica (ad esempio Excel), montare la curva di recupero per l&#39;equazione esponenziale: I = f (1-e-kt), dove I è l&#39;intensità, I f è l&#39;intensità finale, t è il tempo, e τ ½ è il tempo necessario per l&#39;intensità per raggiungere la metà del valore finale: τ ½ = ln (2) / k. Il primo tempo è una misura del tasso di mobilità della proteina. </li><li> Ottenere i parametri, primo tempo e l&#39;intensità finale del-curva esponenziale. Calcola °e frazione mobili prendendo il rapporto tra la finale di iniziale intensità di fluorescenza. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Un esempio di live-imaging di cellule sane cellule epiteliali all&#39;interno della matrice è mostrata in Figura 3. Le cellule sane presentano una superficie liscia, membrana continua, e nucleo distinto, mentre le cellule malsane spesso hanno una membrana interrotto, e un numero eccessivo di vacuoli. In una matrice 3D, singole cellule epiteliali migrano 1, e nel corso di diversi giorni, le cellule epiteliali forma tridimensionale, sferico, multi-cellulare cisti all&#39;interno della matrice 2. Le cellule sono altamente dinamici, e migrano all&#39;interno della cisti (Figura 3). La deformazione della matrice come risultato delle forze di trazione esercitata dalla migrazione delle cellule viene analizzato attraverso lo spostamento delle particelle traccianti incorporati nella matrice circostante (Figura 4). I movimenti delle particelle traccianti vengono visualizzati come immagine di proiezione massima di diversopunti tempo ORL, e ogni punto il tempo è pseudo-colore per indicare il tempo (Figura 4B). In alternativa, le immagini di una particella tracciante singolo vengono visualizzati come un montaggio per mostrare il movimento della particella tracciante nel tempo (Figura 4C). Tutte le analisi delle immagini è stata effettuata usando ImageJ. Queste valutazioni qualitative di deformazione della matrice, e quindi le forze esercitate dalle cellule migrano, sono utili prima approssimazione della distribuzione forza di trazione. La stima quantitativa delle forze di trazione esercitata dalla migrazione delle cellule in 3D va oltre lo scopo di questo protocollo ed è descritto altrove 3,4. Una ripresa tipica fluorescenza dopo photobleaching esperimento è mostrato in Figura 5. La regione di interesse deve essere fotodecolorate utilizzando le impostazioni ottimizzate per laser in modo che l&#39;intensità di fluorescenza è visibilmente diminuito rispetto ai livelli di fondo (per massimizzare il rapporto segnale-rumore), mantenendo le cellule sane e senza danni. L&#39;impostazione ottimale deve be determinati empiricamente come ogni impostazione FRAP è diverso (per esempio, FRAP utilizzando scansione laser confocale sistema). L&#39;esposizione e il tempo-intervallo di post-FRAP acquisizione delle immagini deve essere attentamente controllata per evitare photobleaching sfondo. L&#39;utilizzo di energia laser inferiore, breve tempo di esposizione, e l&#39;uso della macchina fotografica sensibile e di alta ottiche efficienti è essenziale per l&#39;imaging di alta qualità FRAP. Se la fluorescenza sbiancamento durante l&#39;acquisizione delle immagini è notevole, questa dissolvenza sfondo deve essere quantificato e normalizzato compreso tra il recupero osservato intensità di fluorescenza. A causa della natura 3D dell&#39;ambiente, la componente z di recupero intensità di fluorescenza può diventare significativo. Pertanto, è importante definire un volume fotodecolorate prendendo pre e post-stack di immagini 3D di regione fotodecolorate. Ulteriori analisi e modellazione di recupero fluorescenza è discusso altrove 5,6. La combinazione unica di vivere a cellule di imaging techniques: GFP per seguire la dinamica delle proteine ​​del citoscheletro, fluorescenza rossa particelle traccianti per monitorare la deformazione della matrice, e l&#39;aggiunta di inibitori, possono essere usati contemporaneamente per l&#39;analisi della dinamica delle proteine, la forza di trazione e percorsi molecolari. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig1.jpg" /> Figura 1. Preparazione del gel di collagene. A) polimerizzata matrice di collagene su un fondo di vetro piatto. Il colore rosa del gel è dovuto a particelle fluorescenti incorporato. B) Procedura per trattare i piatti in vetro basso per reticolare il gel di collagene alla superficie del vetro. In primo luogo, il piatto fondo di vetro è trattato con 3-Aminopropyltrimethoxysilane soluzione, soluzione di glutaraldeide che reticola la matrice di collagene per il vetro. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig2.jpg" /> Figura 2. Schema di confocale / FRAP configurazione microscopio. Il confocalemicroscopio si basa su un AxioObserver Zeiss con una macchina fotografica HQ CoolSnap II CCD e completamente automatizzato da Slidebook software (Intelligent Imaging Innovations). L&#39;unità confocale è progettato su misura e basate su unità disco Yokogawa filatura CSU10 e due laser a stato solido (488 nm con 50 mW e 561 nm con 40 mW) con Acusto-filtro ottico sintonizzabile (AOTF) per consentire millisecondi il passaggio tra due laser. I filtri di emissione sono nm nm 525/50 e 620/60 (# 118661 e # 118085, Tecnologia Chroma) e specchio dicroico è 488-568 banda Brightline Dual (Semrock). Gli obiettivi sono una lunga distanza di lavoro 40x C-Apochromat obiettivo con NA 1.1 e distanza di lavoro di 0,62 millimetri, e un 63x Plan-Apochromat obiettivo con NA 1,4 e una distanza di lavoro di 0,19 mm. Il microscopio comprende anche un sistema di fotoablazione FRAP che consiste in una fibra di pompaggio ottico dye laser, un raggio del computer controllato posizione e l&#39;intensità, e una limitata dimensione dello spot di diffrazione. Inoltre, il microscopio è dotato diuno stadio XY motorizzato che include 0,1 micron encoder lineari su ogni asse. Durante il time-lapse imaging, la temperatura ambientale è mantenuto da una camera di costume microscopio progettato e un riscaldatore con controllo della temperatura feedback. Per isolare il rumore e le vibrazioni, il sistema intero microscopio è su un tavolo senza vibrazioni. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig3.jpg" /> Figura 3. Dal vivo imaging cellulare delle cellule epiteliali che esprimono GFP-actina. Queste cellule formano una cisti dopo 4 giorni di cultura in una matrice di collagene 3D. Alcune cellule si muovono lungo la superficie della cisti (freccia gialla), mentre altri migrano all&#39;interno l&#39;interno della cisti (freccia rossa). Scala bar 10 micron, il tempo in ore. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig4.jpg" /> Figura 4. L&#39;effetto di inibizione della Rho-chinasi sulla forza di trazione. A) DIC immagine di una cellula migrazione MDCK esprimere GFP tag marcatore nucleare. L&#39;immagine è stata presa immediatamente prima del trattamento della Rho-chinasi inibitore Y-27632. Scala bar 10 micron. B) lo spostamento delle particelle risultanti dalla somma di Y-27632. Le posizioni delle particelle in vari momenti (0 - 52 min) sono stati pseudo-colore secondo la scala di intensità, poi proiettata su una singola immagine. La regione bianco è il nucleo GFP positive nelle cellule migrano. Scala bar 10 micron. Tempo in minuti. C) Il movimento delle particelle al bordo d&#39;uscita della cella (vedi freccia in B). Asterisco indica l&#39;ultimo fotogramma catturato prima di Y-Oltre 27.632. La particella tracciante spostato verso e lontano dal bordo di uscita della cellula migrazione prima e dopo l&#39;aggiunta di Y-27632, rispettivamente. Scala di misura 1 micron. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig5.jpg" /> Figura 5. FRAP analisi di actina-GFP che esprimono migrazione delle cellule in una matrice tridimensionale. A) le immagini Timelapse della GFP-actina esprimendo cellulari di prima e dopo la photobleaching. Una piccola regione della GFP-actina accumulato nella parte posteriore cella era fotodecolorate (freccia rossa) a timepoint 0. Tempo in secondi, scala bar 5 micron. B) L&#39;intensità media di fluorescenza della regione fotodecolorate (linea continua), e la misura esponenziale della ripresa fluorescenza (cerchi) tracciati nel tempo. L&#39;intensità della fluorescenza è stata normalizzata al valore iniziale prima photobleaching.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui si descrive un metodo per l&#39;utilizzo live-cell imaging per studiare i meccanismi di migrazione delle cellule in una matrice tridimensionale. Il successo di questa tecnica dipende da ottenere &quot;buoni&quot; cloni che esprimono stabilmente GFP-tagged proteine. Il basso livello di proteine ​​GFP richiede un&#39;esposizione eccesso di eccitazione che compromette la salute delle cellule, mentre il livello troppo alto GFP avrà effetti collaterali indesiderati sulla cellula. Così, la scelta vettore per trasfettare geni nelle cellule è importante (per esempio, il promotore, tag fluorescenza, ecc.) Ci sono molti tag fluorescente GFP diversi, tra cui rosso proteina fluorescente (RFP) 7,8. Questi tag proteine ​​richiedono una specifica lunghezza d&#39;onda della luce di eccitazione, e quindi diversi set di filtri fluorescenza. Inoltre, diversi geni resistenti agli antibiotici (per esempio, G418, Hygromycin, puromicina etc) sono anche disponibili e possono essere utilizzati per generare cloni stabili. Per vivere a cellule di imaging, le cellule trasfettate transitoriamente cuno anche essere usato. Anche se questo riduce al minimo il tempo e lo sforzo richiesto per sviluppare una linea stabile di cellule, le cellule trasfettate transitoriamente sono generalmente insalubri, e quindi meno affidabile per l&#39;utilizzo negli esperimenti. Inoltre, la popolazione di cellule trasfettate transitoriamente è una miscela eterogenea di esprimere e non le cellule che esprimono, e le cellule che esprimono perderà l&#39;espressione di proteine ​​fluorescenti nel tempo. In confronto, in modo stabile cellule che esprimono sono tipicamente clonato da una singola colonia di cellule e di espressione delle proteine ​​dovrebbe essere stabile ed omogeneo, anche se il livello di espressione sarà inferiore a quello delle cellule che esprimono transitoriamente. Dal momento che la colonia di cellule stabili è probabile che abbia avuto origine da una singola cellula, è importante scegliere le colonie che hanno morfologia e comportamento simile a quello normale, le cellule untransfected, per evitare di fenotipi che sono specifici solo a quello clone (a meno che il plasmide trasfettate è progettato per turbare morfologia cellulare). Più colonie deve essere usato per experiments per evitare di fenotipi a causa della variazione clonale. In alternativa, trasfezione virale o elettroporazione può essere utilizzato per introdurre geni di interesse. Questo trasfezione virale è particolarmente utile per le cellule di difficile trasfezione o cellule primarie (vedi i protocolli dettagliata delle tecniche di trasfezione altre descritto altrove in questa rivista). La parte più difficile di questa procedura è subcloning. Cloni stabili possono essere raccolti con il metodo descritto qui tampone di cotone, o, in alternativa, utilizzando un anello di clonazione. Un altro metodo per la selezione di cellule GFP-positive sta usando FACS. FACS seleziona le celle basata esclusivamente sulla grandezza di intensità di fluorescenza. In confronto, utilizzando il metodo della clonazione qui descritte, l&#39;utente può identificare visivamente non solo il livello di espressione e GFP, ma anche la sua localizzazione cellulare utilizzando un microscopio. Inoltre, la clonazione mediante FACS risultati in genere in una popolazione più eterogenea di cellule. Le cellule a superare questo problema, FACS-ordinati possono essereplaccato direttamente in 96 piatti bene, in modo che ogni bene contiene una sola cella. Colonie provenienti da singole cellule dovrebbe essere una popolazione omogenea. Il metodo utilizzato per fissare la matrice di collagene per il piatto fondo di vetro (Figura 1) è fondamentale per vivere a cellule di imaging e la coltura delle cellule in un gel per un periodo prolungato di tempo. Il primo passo per collegare la matrice al vetro è la formazione di un monostrato silano. Fallimento di silano per depositare in un monostrato risulta spesso in distacco matrice di collagene dal vetro. Questo perché le cellule incorporate nella matrice esercitano forze di trazione contrattile, e causare la matrice a ridursi, aumentando così la probabilità di distacco matrice dal piatto. Pertanto, il trattamento silano / glutaraldeide del piatto è fondamentale per mantenere l&#39;attaccamento gel al piatto. Si noti che le condizioni di assemblaggio del collagene (concentrazione, tempo e pH) potrebbe dover essere ottimizzato per il collagene di tipo diverso e batch. InInoltre, il protocollo può essere utilizzato con diversi tipi di collagene o di altri gel 3D, come Matrigel o fibroblasti derivati ​​matrice 9. Anche se molte cellule non mostrano effetti avversi in risposta a tampone HEPES, alcune cellule sono più schizzinoso. Per mantenere la salute delle cellule durante il time-lapse di acquisizione, un incubatore CO 2 può essere aggiunta per controllare il pH all&#39;interno della custodia microscopio. Inoltre, l&#39;esposizione laser per le cellule devono essere ridotti al minimo. Se la fluorescenza emessa dalle cellule è troppo debole, la fluorescenza possono essere raccolti in modo più efficace utilizzando una fotocamera più sensibile, o un obiettivo migliore, o un insieme più efficiente filtro, Cell morfologia ecc all&#39;interno della custodia microscopio dovrebbe essere confrontato con la sua morfologia nella CO 2 incubatore per assicurarsi che le cellule sono sane e di comportarsi normalmente. Poiché questo metodo descrive saggi singola cellula base, qualche cellula-cellula variazione è previsto. Pertanto, ripetendo gli esperimenti e dati quantification è essenziale.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Collagene, bovino, tipo I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> Magazzino è di circa 3 mg / ml </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltrimethoxysilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 281778 </td><td> Diluire in acqua </td></tr><tr><td> glutaraldeide </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 340855 </td><td> Diluire in PBS </td></tr><tr><td> Hepes 1M </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheres polistirolo microsfere di 1 micron, fluorescenza rossa (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> Cultura dei media componenti: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> Siero bovino fetale </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

Tradizionalmente, la migrazione delle cellule è stato studiato su due dimensioni, superfici in plastica rigida. Tuttavia, durante importanti processi biologici come la guarigione delle ferite, la rigenerazione dei tessuti, e le metastasi del cancro, le cellule devono navigare attraverso complesse, tridimensionali tessuto extracellulare. Per meglio comprendere i meccanismi alla base di questi processi biologici, è importante esaminare il ruolo delle proteine ​​responsabili per la guida migrazione cellulare. Qui, delineare un protocollo per studiare i meccanismi della migrazione cellulare utilizzando la linea delle cellule epiteliali (MDCK) e una tridimensionale, fibroso, auto-polimerizzazione della matrice come sistema modello. Questa matrice extracellulare otticamente chiaro è facilmente riconducibile a vivere a cellule studi di imaging e meglio imita il fisiologico, l&#39;ambiente dei tessuti molli. Questa relazione dimostra una tecnica per la visualizzazione diretta di localizzazione delle proteine ​​e la dinamica, e la deformazione del circostante matrice tridimensionale. Esameminazione della localizzazione delle proteine ​​e delle dinamiche durante i processi cellulari fornisce informazioni chiave in funzioni delle proteine. Geneticamente codificato tag fluorescenti di fornire un metodo unico per osservare la localizzazione delle proteine ​​e la dinamica. Utilizzando questa tecnica, possiamo analizzare l&#39;accumulo subcellulare di chiave, la forza che generano componenti del citoscheletro in tempo reale come le manovre cellula attraverso la matrice. Inoltre, utilizzando più tag fluorescenti con diverse lunghezze d&#39;onda, possiamo esaminare la localizzazione delle proteine ​​contemporaneamente, permettendoci così di prova, ad esempio, se diverse proteine ​​hanno ruoli simili o divergenti. Inoltre, la dinamica delle proteine ​​fluorescenti tag può essere quantificata l&#39;utilizzo di recupero dopo photobleaching fluorescenti (FRAP) analisi. Questo test misura la mobilità delle proteine ​​e come stabilmente le proteine ​​sono legati alla rete del citoscheletro. Grazie alla combinazione di live-cellulare imaging con trattamento di inibitori della funzione della proteina,possiamo esaminare in tempo reale i cambiamenti nella distribuzione delle proteine ​​e della morfologia delle cellule migrano. Inoltre, abbiamo anche combinare live-cell imaging con l&#39;uso di particelle traccianti fluorescenti incorporate nella matrice di visualizzare la matrice di deformazione durante la migrazione cellulare. Quindi, possiamo visualizzare come una cellula migrazione distribuisce la forza che generano le proteine, e dove le forze di trazione sono esercitate alla matrice circostante. Attraverso queste tecniche, siamo in grado di acquisire una conoscenza diretta dei ruoli delle proteine ​​specifiche e il loro contributo ai meccanismi della migrazione cellulare.

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Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Processi cellulari come la migrazione delle cellule sono stati tradizionalmente studiati su due dimensioni, superfici in plastica rigida. Questo rapporto descrive una tecnica per la visualizzazione diretta di localizzazione delle proteine ​​e l&#39;analisi dinamica della proteina in cellule di migrare in modo più fisiologicamente rilevanti, matrice tridimensionale.

Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

live-cell-imaging-migrating-cells-expressing-fluorescently-tagged

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.1K Views.  University of California, Davis. Processi cellulari come la migrazione delle cellule sono stati tradizionalmente studiati su due dimensioni, superfici in plastica rigida. Questo rapporto descrive una tecnica per la visualizzazione diretta di localizzazione delle proteine ​​e l'analisi dinamica della proteina in cellule di migrare in modo più fisiologicamente rilevanti, matrice tridimensionale.

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

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Bioingegneria

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Stampa planare e tridimensionale di inchiostri conduttivi

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Universale Mano libera tridimensionale optoacustica Imaging Probe per Deep Tissue angiografia umana e funzionali studi preclinici in tempo reale

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Analisi della migrazione delle cellule all&#39;interno di una tridimensionale di collagene Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Generazione di una tridimensionale a tutto spessore della pelle Equivalent e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Imaging Live Cell durante meccanica Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all&#39;interno di matrice extracellulare

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Sciogliere elettrofilatura scrittura di scaffold tridimensionale Poly(ε-caprolactone) con morfologie controllabile per applicazioni di ingegneria del tessuto

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Coltura di cellule di mammifero in scaffold tridimensionale Peptide

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale