Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concedere EY005102 di SCM e EY018640 di RCP

1. Intatti i preparativi retina neurale per pesci rossi, topi e conigli <ol><li> Eseguire tutte le seguenti operazioni, comprese quelle descritte nella &quot;2) Cut-loading&quot;, sotto costante ambiente (sfondo) illuminazione. Si prega di notare che ai fini del presente protocollo, le procedure sono descritti come eseguita nel buio costante (cioè sotto molto scuro (ad esempio &quot;scotopica&quot;) condizioni ≤ 0,0001 lux), utilizzando occhiali per la visione notturna a infrarossi, ma gli altri livelli di intensità maggiore di costante illuminazione ambientale può essere invece utilizzata per determinare l&#39;effetto di altri livelli di illuminazione ambientale sull&#39;accoppiamento gap junction tracciante. </li><li> Dark-adattare la sperimentazione animale (pesci rossi, mouse o di coniglio) per almeno 1 ora prima dell&#39;intervento chirurgico. </li><li> Come descritto in precedenza 7, profondamente anestetizzare pesci rossi mettendoli in tricaine metanosolfonato (MS222, 150 mg / L di pesci d&#39;acqua tamponata (bicarbonato di sodio contenenti) serbatoio), e profondamente anestetizzare topi con ketamina (100 mg/ Kg, ip) e rompun (10 mg / kg, ip). Profondamente anestetizzare conigli con uretano (dose di carico: 2,0 g / kg, ip) e anche usare l&#39;anestesia locale intraorbital (2% Xylocaine), come descritto in precedenza 8. Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono la cura e l&#39;uso di animali deve essere effettuata conformemente alle linee guida federali ed essere esaminato e approvato dalla locale università e la cura degli animali comitati uso. (Nota:. Negli esperimenti descritti qui, tutte le procedure sperimentali che coinvolgono la cura e l&#39;uso di pesce, topi e conigli sono stati eseguiti in conformità con le linee guida NIH e sono stati esaminati e approvati da Ohio State Cura degli animali dell&#39;Università istituzionale e Comitato Usa) </li><li> Per i pesci, topi e conigli, a seguito di enucleazione, rimuovere la parte anteriore di ogni bulbo oculare. Poi, posto un pezzo di carta da filtro in cima alla parte posteriore dell&#39;occhio ed invertire la carta da filtro e l&#39;occhio, in modo che la carta da filtro si trova sotto la parte posteriore dell&#39;occhio. Quindi, utilizzando beneforcipe sezionare la retina neurale intatta dalla parte posteriore dell&#39;occhio con delicatezza peeling via dell&#39;epitelio pigmentato / coroide / sclera, che sono attaccati l&#39;uno all&#39;altro, dalla retina neurale, che è collegato alla carta da filtro. Poiché si tratta di fatto, tagliato il nervo ottico con sottile molla forbici. La retina neurale, orientato fotorecettori rivolta verso l&#39;alto, ora dovrebbe essere allegato alla carta da filtro e separato dal resto dell&#39;occhio. </li></ol> 2. Cut-loading <ol><li> Immergere la retina in una soluzione ossigenata Ringer (Tabella 1) in un 6-pozzetti (~ 5 mL / pozzetto) per 30 minuti in ambiente costante (sfondo) illuminazione (ad esempio sotto molto scuro (ad esempio &quot;scotopica&quot;) condizioni) con o senza un test di droga. Mantenere la retina pesce in ossigenato (5% di CO 2 / 95% O 2) bicarbonato-based di Ringer a 22 ° C, tenuta il 6-pozzetti con parafilm e mantenere la retina topo e di coniglio a 36 ° C in un CO 5% 2 / 95% O <sub&gt; 2 incubatrice. Quando un farmaco di prova, dovrebbe essere presente durante tutte le fasi successive fino fissazione </li><li> Preparare la soluzione tracciante (tipicamente 100 mL), sciogliendo neurobiotin (0,5%), una molecola biotinilato, in soluzione di Ringer subito prima di tagliare attraverso la retina. Si noti che lo 0,5% rodamina destrano (alto (&gt; 10.000) MW) può essere aggiunto alla soluzione. Grazie al suo elevato peso molecolare, rodamina destrano non attraversa giunzioni gap e solo le cellule etichette che sono state danneggiate dal taglio. Come mostrato in fig. 3, questo è un modo utile per distinguere le cellule che si sono accumulate neurobiotin perché sono stati feriti, da quelli che hanno accumulato il tracciante per diffusione attraverso giunzioni gap. </li><li> Posizionare la soluzione neurobiotin su un vetro (o plastica) capsula di Petri, toccare la carta da filtro, a cui è collegata la retina, su un tovagliolo di carta per rimuovere l&#39;eccesso Ringer, immergere una lama di rasoio (o altro lama tagliente) nella soluzione neurobiotin e iln un taglio radiale attraverso la retina e la carta da filtro. Se si preferisce, distanziali può essere utilizzato in modo che il taglio è fatto attraverso la retina, ma non la carta da filtro. Il taglio deve essere orientato perpendicolarmente alla superficie della retina. Immergere la lama nella soluzione neurobiotin nuovo e tagliare la retina una seconda volta. Ripetere questa operazione fino a 4 tagli al retina (vedi fig. 1). Utilizzare un microscopio da dissezione quando tagli rasoio tramite mouse e altri piccoli retine. </li><li> Come mostrato in fig. 1, immergere la retina di nuovo nel medio Ringer fresco, con o senza droga test, con un 6-pozzetti (5 ml Ringer / pozzetto). Incubare la retina per 15 minuti per consentire il carico e diffusione. </li><li> Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con media Ringer fresco, con o senza droga test. </li><li> Fissare la retina con 4% paraformaldeide in tampone fosfato 0,1 M (PBS, pH 7,4) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare con 0,1 M PBS notte a 4 ° C. </li><li> Il giorno seguente, reagire with 2% streptavidina-Alexa 488 (concentrazione finale 10 mg / mL) in PBS 0,1 M + 0,3% Triton X-100, e mantenere una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare tre volte per 10 minuti ciascuno con 0,1 M PBS a RT </li><li> In PBS, staccare la retina dalla carta da filtro e poi, usando un pennello fine, luogo della retina, fotorecettori-orientato verso l&#39;alto, in una diapositiva. </li><li> Delicatamente il montaggio di media Vectashield montaggio (Vector Laboratories, Burlingame, CA). </li><li> Scatta foto con un microscopio confocale a scansione laser (per esempio, Zeiss 510 META) allo stesso ingrandimento, la risoluzione e le impostazioni per ogni condizione sperimentale, in modo da poter confrontare gli effetti delle diverse condizioni sperimentali (farmaci di prova per esempio, condizioni di illuminazione) sul grado di gap di giunzione tracciante di accoppiamento (Fig. 2A-C e fig. 4A-C). Anche se una sola immagine può contenere tutte le cellule etichettate, si consiglia di raccogliere un Z-Stack della zona di interesse e comprimerla in un unicoimmagine. </li></ol> 3. Quantificazione del tracciante giunto con ImageJ <ol><li> Nel browser di immagine LSM, aprire l&#39;immagine, fare clic su Esporta e salvare l&#39;immagine come TIF-16 bit non compresse dei file. Barra di scala dovrebbero essere inclusi in questa immagine TIF. </li><li> Utilizzando il software ImageJ NIH, misurare l&#39;intensità di fluorescenza di Alexa-488-etichettati neurobiotin a basso ingrandimento immagini di tutto il montaggio retine. Aprire il file TIF utilizzando il software ImageJ e quindi disegnare una linea retta corrispondente alla barra della scala. Vai a ANALIZZARE, SET SCALA e immettere la distanza conosciuta e unità di lunghezza, quindi fare clic su OK. Ora i risultati delle misurazioni possono essere presentati in unità calibrate, come ad esempio millimetri. </li><li> Selezionare l&#39;area di interesse utilizzando lo strumento selezione rettangolare. Il picco di fluorescenza dovrebbero essere posizionati al bordo sinistro della selezione. Assicurarsi che non vi è alcun segnale di fluorescenza vicino al bordo destro. In caso contrario, ruotare l&#39;immagine attiva (IMAGE, poi ruotate). </li><li> CliccareANALIZZARE e PLOT PROFILO. Si dovrebbe vedere una curva con un decadimento esponenziale da sinistra verso destra. </li><li> Clicca COPIA nella finestra pop-up e incollarlo in Excel. Ora si vedono due colonne che mostra la distanza dal taglio (colonna a sinistra) e l&#39;intensità di fluorescenza in funzione della distanza dal taglio (colonna destra). </li><li> Dividere ogni valore grezzo di fluorescenza per il valore massimo di fluorescenza di ottenere l&#39;intensità relativa di fluorescenza. </li><li> Copiare due colonne corrispondente alla distanza dal taglio (X) e l&#39;intensità di fluorescenza relativa (Y), e quindi incollarli in un software di origine. </li><li> Montare con il decadimento esponenziale # 1 funzione (Fig. 2D e Fig. 4D.), Che è nella forma: Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ) dove Y è l&#39;intensità relativa della fluorescenza, Y o è la fluorescenza di fondo, Y max è la fluorescenza massimo relativo, λ è la space (lunghezza) costante, e x è la distanza dal taglio. </li><li> Confrontare la costante di spazio (λ) valori a diverse condizioni sperimentali utilizzando il t-test o ANOVA (2E Fig. e fig. 4E). Si noti che le tecniche alternative di quantificazione sono stati descritti da altri 13,14. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Esempi rappresentativi di tracciante cellule fotorecettori accoppiamento come determinato dal taglio di carico sono presentati nelle Figure 2 e 3 (pesce) e la figura 4 (coniglio). Confocale immagini sono state scattate utilizzando le stesse impostazioni per il confronto (Fig. 2A-C e fig. 4A-C) e l&#39;intensità di fluorescenza è stata tracciata in funzione della distanza dal taglio e montato dalla funzione esponenziale mostrato in n. 3,8 sopra (Fig. 2D e fig. 4D). Valori di spazio costante per ogni condizionesono illustrati nelle figure 2E e 4E, dimostrazione del fatto che il grado di accoppiamento gap junction tracciante può essere quantificato utilizzando la tecnica del cut-loading. Inoltre, i risultati sono altamente riproducibili. Uso del cut-loading tecnica come un mezzo per quantificare il grado di accoppiamento gap junction tracciante è anche convalidata dalla constatazione che l&#39;intensità di fluorescenza decresce esponenzialmente in funzione della distanza dal taglio in tutti i casi esaminati 7,8 (vedi anche fig. 2D e 4D qui), indicando che neurobiotin entrati i fotorecettori attraverso il taglio rasoio e non da altri siti della retina. Inoltre, l&#39;qualitativamente simile giorno / notte differenza di accoppiamento tracciante cellulare dei fotorecettori osservato in pesci rossi con iniezioni tracciante in coni singoli e con taglio di carico 7 sostanzia cut-carico come un mezzo relativamente accurato per misurare il grado di accoppiamento dei fotorecettori. Il cut-loading tecnica può essere utilizzata anche per studiare altri tipi di sinapsi elettriche nella retina. Per esempio, la Figura 5 mostra che il coniglio di tipo A (Fig. 5A) e di tipo B (Fig. 5B), le cellule orizzontali mostrano omologhi tracciante di accoppiamento seguenti cut-caricamento e la diffusione di neurobiotin sotto adattato all&#39;oscurità condizioni. <table border="1"><tbody><tr><td> Composto </td><td> Pesce </td><td> Mouse </td><td> Coniglio </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 2,5 </td><td> 5 </td><td> 3,1 </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 1,2 </td></tr><tr><td> Glutammina </td><td> - </td><td> 0,1 </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,7 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Composizione delle soluzioni della suoneria per pesci rossi, mouse e retine di coniglio. Le concentrazioni sono presentati in mm. Le soluzioni di Ringer sono bollito con 5% di CO 2 / 95% O 2 e mantenuta a 22 ° C (di pesce) o 36 ° C (mammiferi). &quot;-&quot;: Non incluso nel Ringer per questa specie. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" /> Figura 1:. Diagramma di flusso che mostra il cut-procedura di caricamento. Dopo l&#39;isolamento of la retina neurale intatta, numerosi tagli radiali sono state fatte da una lama che per la prima volta immersa in una soluzione neurobiotin 0,5%. La retina è stato incubato per il caricamento e la diffusione del tracciante, e poi lavato prima di fissazione con paraformaldeide 4% (PFA) in 0.1M tampone fosfato (PB). Tracciante di accoppiamento è stato esaminato con streptavidina coniugata con Alexa-488. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" /> Figura 2. Giorno-notte differenza di accoppiamento dei fotorecettori tracciante nel pesce rosso è rivelata dal cut-loading tecnica. Divario di giunzione cellula fotorecettore neurobiotin tracciante accoppiamento era abbondante durante la notte (B) e nel giorno successivo all&#39;applicazione di spiperone (10 micron), un selettivo della dopamina D 2 antagonista del recettore (C), ma non nel giorno in condizioni di controllo (A). D) normalizzato intensità relativa fluorescenza in funzione della distanza dai tagli (indicato dalle frecce in AC). E) val spazio costanteUES desunti dai dati in esperimenti D e altri (n = 4). *** P &lt;0,001. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" /> Figura 3. Un esempio rappresentativo che mostra fluorescenza nello strato fotorecettore cella di una dark-adattato retina pesce rosso durante la notte seguente cut-carico con una soluzione di sia neurobiotin e rodamina destrano. Rodamina destrano (mostrato in rosso), che non si diffondono attraverso canali aperti gap junction grazie al suo elevato peso molecolare (&gt; 10.000 MW), solo le cellule etichettate vicino al taglio. Al contrario, neurobiotin (evidenziato in verde) diffusa attraverso giunzioni gap e può essere visto in cellule visive, lontano dal taglio. La posizione del taglio è indicata dalla freccia in ogni pannello. Scala grafica: 200 micron. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" /> Figura 4. Giorno-notte differisconoriferimento in fotorecettori tracciante di accoppiamento in retina di coniglio è rivelata dal cut-loading tecnica. Divario di giunzione cellula fotorecettore neurobiotin tracciante accoppiamento era abbondante durante la notte (B) e nel giorno successivo all&#39;applicazione di spiperone (10 mM) (C), ma non nel giorno in condizioni di controllo (A). In AC, vista perpendicolare della ricostruzione 3D dei fotorecettori coniglio vicino al taglio sono mostrati. D) normalizzato intensità relativa fluorescenza in funzione della distanza dai tagli. E) i valori dello spazio costante ottenuta dai dati in esperimenti D e altri (n = 3). *** P &lt;0,001. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" /> Figura 5. Cut-loading rivela che adattato all&#39;oscurità coniglio cellule orizzontali sono accoppiate tracciante. Sia di tipo A (A) e tipo B (B), le cellule orizzontali in adattato all&#39;oscurità retine di coniglio esposti omologo neurobiotin accoppiamento tracciante.

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Z., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+coupling+is+controlled+by+connexin+35+phosphorylation+in+zebrafish+retina.">Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina.</a> J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+tracer+movement+through+homologous+gap+junctions+in+the+rabbit+retina.">The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+biotinylated+tracers+distinguishes+three+types+of+gap+junction+in+retina.">A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina.</a> J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il cut-loading metodo qui descritto è una tecnica utile e semplice per determinare il grado di accoppiamento tracciante divario di giunzione tra i neuroni della retina in condizioni di illuminazione diverse e in momenti diversi del giorno e della notte. I vantaggi di questa tecnica sono la possibilità di quantificare l&#39;entità di accoppiamento tracciante gap junction tra i neuroni nel tessuto retinico intatto sotto una varietà di condizioni di illuminazione durante il giorno e la notte e di farlo per i neuroni accoppiati che hanno somata di piccolo diametro. Limiti della tecnica per lo studio delle giunzioni gap in autunno tessuto intatto in due categorie generali. In primo luogo, la diffusione del tracciante attraverso giunzioni gap aperto può essere relativamente difficile da osservare a causa di una), il piccolo diametro o la carica associata con i canali aperti e b) i volumi relativi accoppiato compartimenti cellulari 1,14,15. Cioè, la diffusione del tracciante da una piccola cella a una cella più grande o gruppo di cellule accoppiate, compared alla diffusione del tracciante da una cella più grande a una cella più piccola, può essere più difficile da individuare a causa della diluizione del tracciante. In secondo luogo, in determinate condizioni fisiologiche, il grado di diffusione del tracciante attraverso giunzioni gap nel tessuto intatto potrebbero non riflettere accuratamente la forza della conduttanza divario giunzionale a causa delle differenze nella conduttanza della piccola corrente elettrica che trasporta gli ioni, rispetto alla permeabilità del tracciante relativamente grandi molecole di 1,14,15. In generale, le prove di tracciante accoppiamento suggerisce fortemente la presenza di funzionamento, canali aperti gap junction, ma in alcune condizioni fisiologiche, la diffusione del tracciante non possono, accadere o essere osservate, anche se le registrazioni elettrofisiologiche suggeriscono la presenza di funzionamento, giunzioni gap aperto. Sembra probabile che il taglio di caricamento tecnica può essere utilizzata anche per indagare il grado di accoppiamento tracciante gap junction tra i neuroni nel tessuto intatto da altre regioni del sistema nervoso centraleTEM.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Tricaine solfonato metano (MS222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td><td> 150 mg / L di acqua tamponata pesce carro armato </td></tr><tr><td> Uretano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U2500 </td><td> 2 g / kgloading dosi </td></tr><tr><td> Doppio tubo Notte Vision Goggle </td><td> Notte Optics USA </td><td> D-221 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro di carta, N. Grado 4 </td><td> Whatman </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> Pinze bene, Dumont n. 5, Biologie, 11 cm di lunghezza </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> Forbici fine, a molla, 8 lama mm, dritto </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 15025-10 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> Vettore </td><td> SP-1120 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Streptavidina coniugata con Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Destrano rodamina (alto (&gt; 10.000) MW) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Vectashield montaggio medio </td><td> Vettore </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zeiss 510 META microscopio a scansione laser confocale </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8,0 </td><td> OriginLab Corp. </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cut-loading: a useful tool for examining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons

Oltre alla trasmissione sinaptica chimica, i neuroni che sono collegati da giunzioni gap può anche comunicare rapidamente via elettrica di trasmissione sinaptica. Crescente evidenza indica che giunzioni gap non solo permettono il flusso di corrente elettrica e l&#39;attività sincrona tra le cellule interconnesse o accoppiati, ma che la forza o l&#39;efficacia di comunicazione elettrica tra le cellule accoppiato può essere modulata a 1,2 in grande misura. Inoltre, il diametro interno di grandi dimensioni (~ 1.2 nm) su molti canali gap junction permette non solo il flusso di corrente elettrica, ma anche la diffusione di molecole di segnalazione intracellulare e piccoli metaboliti tra le cellule interconnesse, in modo che giunzioni gap può anche mediare la comunicazione metabolici e chimici . La forza della comunicazione giunzionale divario tra i neuroni e la sua modulazione mediante neurotrasmettitori e altri fattori possono essere studiate contemporaneamente la registrazione a partire da cellule elettricamente accoppiate e determinando tl&#39;ampiezza di diffusione di molecole traccianti, che sono divario di giunzione permeabili, ma non membrana permeabile, dopo l&#39;iniezione iontoforesi in singole cellule. Tuttavia, queste procedure possono essere estremamente difficili da eseguire sui neuroni con somata piccolo intatto tessuto nervoso. Numerosi studi sulle sinapsi elettriche e la modulazione della comunicazione elettrica sono stati condotti nella retina dei vertebrati, dal momento che ciascuno dei cinque tipi di neuroni della retina è collegato elettricamente con giunzioni gap 3,4. Crescente evidenza ha mostrato che il ritmo circadiano (24 ore), l&#39;orologio nella retina e cambiamenti di stimolazione luminosa regolare gap junction accoppiamento 3-8. Per esempio, un recente lavoro ha dimostrato che l&#39;orologio circadiano della retina diminuisce giunzione accoppiamento divario tra asta e cellule fotorecettori cono durante il giorno, aumentando l&#39;attivazione del recettore della dopamina D2, e aumenta notevolmente coni accoppiamento di notte, riducendo l&#39;attivazione del recettore D2 <sup&gt; 7,8. Tuttavia, non solo questi studi sono estremamente difficili da eseguire sui neuroni con somata piccolo intatto tessuto neurale della retina, ma può essere difficile controllare adeguatamente le condizioni di illuminazione durante lo studio elettrofisiologico di singoli neuroni della retina per evitare la luce cambiamenti indotti in gap junction conduttanza. Qui vi presentiamo un metodo diretto per determinare il grado di accoppiamento tracciante divario di giunzione tra i neuroni della retina in condizioni di illuminazione diverse e in momenti diversi del giorno e della notte. Questo taglio di caricamento tecnica è una modifica del carico raschiare 9-12, che si basa sul caricamento di colorante e diffusione attraverso canali aperti gap junction. Carico raschiare funziona bene in cellule in coltura, ma non in fette spesse, come retine intatte. Il cut-loading tecnica è stata utilizzata per studiare accoppiamento dei fotorecettori nei pesci e di mammiferi retine intatte 7, 8,13, e può essere usato per studiare accoppiamento traaltri neuroni della retina, come descritto qui.

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Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Un metodo semplice e pratico per determinare il grado di accoppiamento tracciante gap junction tra i neuroni della retina è descritta. Questa tecnica permette di studiare la funzione delle sinapsi elettrica tra i neuroni della retina intatta in condizioni di illuminazione diverse e in momenti diversi del giorno e della notte.

Cut-loading: uno strumento utile per esaminare fino di accoppiamento Tracer Junction Gap tra i neuroni della retina

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

cut-loading-useful-tool-for-examining-extent-gap-junction-tracer

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.4K Views.  Ohio State University College of Medicine. Un metodo semplice e pratico per determinare il grado di accoppiamento tracciante gap junction tra i neuroni della retina è descritta. Questa tecnica permette di studiare la funzione delle sinapsi elettrica tra i neuroni della retina intatta in condizioni di illuminazione diverse e in momenti diversi del giorno e della notte.

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The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Il organotipica ippocampale Cultura Modello Slice per l&#39;esame di danno neuronale

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

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Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissezione di un occhio mouse per un monte intero di dell&#39;epitelio pigmentato retinico

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Le analisi morfometriche delle sezioni della retina

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Single-cell Profiling dei neuroni retinici maturi e in sviluppo

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems. The ability to produce highly specific antibodies to target proteins has allowed for very precise biological questions to be addressed. Importantly, antibodies have been implicated in the pathogenesis of a number of human diseases including systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), paraneoplastic syndromes, multiple sclerosis (MS) and human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) 1-9. How antibodies cause disease is an area of ongoing investigation, and data suggests that interactions between antibodies and various intracellular molecules results in inflammation, altered cellular messaging, and apoptosis 10. It has been shown that patients with MS and HAM/TSP produce autoantibodies to the intracellular RNA binding protein heterogeneous ribonuclear protein A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Recent data indicate that antibodies to both intra-neuronal and surface antigens are pathogenic 3, 5-9, 11. Thus, a procedure that allows for the study of intracellular antibody:protein interactions would lend great insight into disease pathogenesis.
Genes are commonly transfected into primary cells and cell lines in culture, however transfection of antibodies into cells has been hindered by alteration of antibody structure or poor transfection efficiency 12. Other methods of transfection include antibody transfection based on cationic liposomes (consisting of DOTAP/DOPE) and polyethylenimines (PEI); both of which resulted in a ten-fold decrease in antibody transfection compared to controls 12. The method performed in our study is similar to cationic lipid-mediated methods and uses a lipid-based mechanism to form non-covalent complexes with the antibodies through electrostatic and hydrophobic interactions 13. We utilized Ab-DeliverIN reagent, which is a lipid formulation capable of capturing antibodies through non-covalent electrostatic and hydrophobic interactions and delivering them inside cells. Thus chemical and genetic couplings are not necessary for delivery of functional antibodies into living cells. This method has enabled us to perform various antibody tracing and protein localization experiments, as well as the analyses of the molecular consequences of intracellular antibody:protein interactions 9.
In this protocol, we will show how to transfect antibodies into neurons rapidly, reproducibly and with a high degree of transfection efficiency. As an example, we will use anti-hnRNP A1 and anti-IgG antibodies. For easy quantification of transfection efficiency we used anti-hnRNP A1 antibodies labelled with Atto-550-NHS and FITC-labeled IgG. Atto550 NHS is a new label with high molecular absorbtion and quantum yield. Excitation source and fluorescent filters for Atto550 are similar to Cy3 (Ex. 556 Em. 578). In addition, Atto550 has high photostability. FITC-labeled IgG were used as a control to show that this method is versatile and not dye dependent. This approach and the data that is generated will assist in understanding of the role that antibodies to intracellular target antigens might play in the pathogenesis of human diseases.

A rapid approach to investigate interactions and effects on molecular mechanisms related to the presence of antibodies in an intracellular environment is described. The method involves transfection of antibodies into live cells using a non-covalent complex formation based on a lipid formulation. The technique is adaptable to immortalized cell lines and primary cells.

Trasfezione anticorpo in neuroni come strumento per studiare patogenesi della malattia

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sequential Photo-sbiancante per Delineare cellule di Schwann singoli sulla giunzione neuromuscolare

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which&#160;11C-AcAc and 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET protocol. Prior to image analysis, PET and MRI images are coregistered to allow the measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum). A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate; &#956;mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function (IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain. Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases.

Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain&#39;s two main energy substrates:&#160;glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.