Ringraziamo Lab membri Jeffrey Adijanto, Tina Banzon, Li Rong, Qin Wan, Congxiao Zhang Jing Zhao, Connie Zhi, Awais Zia, Natalia Strunnikova aiuto per caratterizzare queste colture cellulari. Un ringraziamento speciale a Zhao Jing, Connie Zhi, e Tina Banzon per il loro aiuto nel mantenere grandi scorte di colture cellulari. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Research Programma Intramural.

1. Tessuto fetale umano Tutte le ricerche tessuti umani legati segue i principi della Dichiarazione di Helsinki e il comitato di revisione istituzionale NIH. Gli occhi del feto sono ottenuti da un lenone indipendente, avanzata Risorse Bioscience (ABR, Alameda, CA), da donatori random a 16 a 22 settimane di gestazione, posto in RPMI-1640 supporti contenenti tubi (forniti da ABR), imballati su ghiaccio, e consegnati da un servizio notturno di consegna prioritaria. I tessuti rimangono vitali fino a 48 ore dopo l&#39;enucleazione. 2. Colture Cellulari Media MEM-alfa modificato medio (Sigma-Aldrich) è usato come mezzo di base per la preparazione del 5% e il 15% di siero contenenti supporti per la coltura di cellule dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE medio; tabella 1). <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Sigma </td><td> Gibco </td><td> Quantità </td><td> Immagazzinamento </td></tr><tr><td> MEM, alfa modifica </td><td> M-4526 </td><td></td><td> 500 ml </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> N1 supplemento </td><td> N-6530 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina </td><td></td><td> 15140-148 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> GlutaMax - I </td><td></td><td> 35050 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Non amminoacidi essenziali </td><td> M-7145 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> THT * </td><td></td><td></td><td></td><td> -80 ° C </td></tr><tr><td> La taurina </td><td> T-0625 </td><td></td><td> 125 mg </td><td></td></tr><tr><td> Idrocortisone </td><td> H-0396 10 </td><td></td><td> 10 mcg </td><td></td></tr><tr><td> Triiodo-thyronin </td><td> T-5516 </td><td></td><td> 0,0065 mg </td><td></td></tr><tr><td> ** Siero fetale bovino </td><td></td><td></td><td> 5% o 15% </td><td> -80 ° C </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Fetale umano RPE medio dei componenti per la preparazione di 500 ml di mezzo THT * è preparata sciogliendo taurina-idrocortisone-triiodo-thyronin in 1 1,5 ml di PBS prima di effettuare il mezzo. Diverse aliquote sono realizzati e conservati a -80 ° C per semplificare la preparazione coltura del terreno di coltura. ** Siero fetale bovino non è ottenuta da Sigma-Aldrich o Gibco. Siero fetale bovino utilizzato nella preparazione dei media è ottenuta da Atlanta Biologicals (Norcross, GA). Ogni bottiglia del siero è inattivato con il calore (56 ° C per 1 ora) prima dell&#39;uso. Per garantire coerenza grandi quantità di cellule cultura di siero prelevati dallo stesso lotto vengono acquistati e conservati in -20 ° C fino a quando non sono utilizzati per la preparazione dei media. Cellule scarsamente seminate da un lotto specifico di cellule hfRPE sono cresciute in 24 - o 12 - piastre per alcune settimane in un mezzo contenente 20% FBS di lotti diversi. Le cellule in più rapida crescita melanated con la morfologia RPE più classico (ciottoli) indicano un lotto appropriato siero che può essere utilizzato per la coltura cellulare. Terreno di coltura cellulare contenente anche: N1 supplemento (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / mL, GlutaMax / penicillina-streptomicina 1:100 mL / mL (Gibco), e la soluzione di aminoacidi non essenziali (Sigma-Aldrich) 1:100 ml / mL. Inoltre, idrocortisone (20 mg / L), taurina (250 mg / L), e triiodo-thyronin (0,013 mg / L) (THT) è preparato in anticipo, sciogliendo questi tre componenti in PBS alla concentrazione finale di 1:500 (ml / ml). Aliquote di THT sono conservati a 80 ° C fino a quando in un terreno di RPE. 3. Colture Cellulari Al ricevimento, globi intatti sono sciacquato in soluzione antibiotica antimicotico (diluito a 10 volte;.. Gatto non 15240-096; Invitrogen) più gentamicina (1 mg / ml) per 3 a 5 minuti (figura 1). <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Dopo l&#39;incubazione antibiotici sono risciacquato due volte con medium come HBSS o PBS. Un globo oculare al momento è trasferito al piatto cm 10 Petri con rivestito con Sylgard-184 (WPI) e fissato con aghi 27G. Utilizzando netta SidePort coltello (Alcon) un&#39;incisione è fatta attraverso la sclera sotto il corpo ciliare (1 / 3 della distanza dall&#39;equatore occhio sulla superficie anteriore). Questa incisione viene utilizzato per avviare un taglio circolare per la rimozione della porzione anteriore dell&#39;occhio. Questo taglio è realizzato con un carburo di tungsteno rivestiti forbici curve iride con una lama seghettata (FST). Prima della rimozione della parte anteriore dell&#39;occhio, un taglio è fatto attraverso il corpo vitreo per evitare di staccare il retina dal RPE al polo posteriore. Dopo la parte anteriore dell&#39;occhio viene rimosso, il polo posteriore è incubato con dispasi-I soluzione (2 U / mL, cat non 04942086001;.. Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) nel 5% siero supporto contenente per 40-60 minuti a 37 ° C-5% di CO 2. Dopo il trattamento dispasi, i poli posteriori sono trasferiti ad un HBSS in piastre di Petri con imbottiture in silicone (Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI) e sezionato in quadranti o pezzi più grandi a sufficienza per appiattire tessuti. Poi la retina è delicatamente rimosso con una pinza. Cella singola strati RPE sono stati staccata in fogli e raccolti direttamente nel freddo tripsina-EDTA (Gibco, # 25200-056) soluzione. Dopo l&#39;RPE sono raccolti, tubi con tessuti in tripsina-EDTA sono sigillate e trasferiti in bagnomaria per 10-15 minuti a 37 ° C. Dopo 10 minuti di incubazione, i tubi sono vigorosamente scossi per separare RPE in piccoli gruppi. Se la separazione non è completa, i tubi sono posti di nuovo in bagno d&#39;acqua per altri 5 minuti. Dopo tripsina-EDTA incubazione, le provette vengono ispezionati per un eventuale non-disciolti gruppi di cellule miste. Ogni cluster osservati sono rimossi con punta sottile vetro pipetta Pasteur. Dopo riducendo la velocità (1,4 giri a centrifuga clinica per 4 min), le cellule hfRPE sono risospese in media RPE 15% e poi messo in Primaria palloni (esempio: Cat. 08-772-45, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.. ). Questo mezzo è sostituito dopo 1 giorno con 5% di siero contenente medio RPE, e successive modifiche sono state fatte ogni 2 o 3 giorni. Dopo 3 o 4 settimane, le cellule si confluenti e uniformemente pigmentate. Vengono poi trypsinized a 0,25% tripsina-EDTA per 10 a 15 minuti, risospese nel 15% di siero contenente cellule RPE media cultura, e seminate su inserti chiari colture cellulari da 150 a 200K cellule per pozzetto (Transwell; Corning Costar, Corning, NY), con 12 mm di diametro inserti, pori 0,4 um, membrane in poliestere (esempio: Cat. 07-200-161, Fisher Scientific)... Prima della semina, i pozzi sono stati rivestiti con umana matrice extracellulare (10 mg in 150 microlitri HBSS per pozzetto, Cat. 354237;.. BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) e curata con luce UV nella cappa per 2 ore. In alcuni casi, la procedura tripsinizzazione è stata ripetuta per la seconda volta, per raccogliere le cellule che non si sia staccata dopo il tripsinizzazione prima. Lo stesso protocollo (ad esclusione di rivestimento con ECM) è stato utilizzato per le cellule in coltura i flaconi per generare la popolazione di cellule P1. Queste cellule sono stati utilizzati in esperimenti, quando avevano una resistenza totale dei tessuti di ≥ 200 Ω • cm 2 e sono stati uniformemente pigmentate. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/2032/2032fig1full.jpg">Fare clic qui per una cifra più grande 1</a> . 4. Procedure passo-passo <ol><li> Preparare 12-pozzetti con soluzioni multiple (per ogni occhio 4 pozzi necessari): <ol class="lalpha"><li> aggiungere 10x soluzione antibiotica antimicotico - 1 e / occhio </li><li> aggiungere PBS / HBSS soluzione per lavare - 2 pozzi / occhio </li><li> aggiungere soluzione dispasi - 1 e / occhio </li></ol></li><li> Preparare dissezione Petri da spacchettamento 5 aghi di fissaggio e lo riempie di HBSS </li><li> Disimballare occhi e metterli in antibiotico-antimicotico soluzione per 3-5 minuti (preparata al punto 1) </li><li> Lavare gli occhi in due pozzi (preparata al punto 1) con PBS / HBSS, poi trasferirli dissezione piatto. </li><li> Assetto muscolare eccessivo e tessuto connettivo attorno agli occhi </li><li> 27G utilizzando aghi sicuro (da definire a base di silicio) gli occhi a sezionare piatto di allineamento in un modo in cui cornea rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Utilizzando coltello fare un&#39;incisione sotto porta laterale della cornea, dove taglio circolare inizierà </li><li> Utilizzando le forbici iris fanno tagliare intorno all&#39;occhio, poi con le forbici tagliare vitreo stesso e sollevare porzione anteriore dell&#39;occhio distanza. Nota: in passi 3-8 evitare una pressione eccessiva meccanica bulbo oculare. </li><li> Trasferimento occhio aperto in soluzione dispasi (preparata al punto 1) </li><li> Incubare oculare per 40-60 minuti a 37 ° C con 5% di CO 2 </li><li> Sostituire la soluzione HBSS a sezionare piatto con uno fresco. </li><li> Trasferimento occhio dalla soluzione dispasi al piatto dissezione. </li><li> Occhio posizione nella capsula di Petri (coppa bulbo oculare verso l&#39;alto) e fissarlo con due aghi 27G. </li><li> Sollevare delicatamente retina parzialmente separata e con le forbici taglio della retina retina lontano dal nervo ottico. Scartare retina. </li><li> Utilizzando le forbici iris fare una incisione dalla periferia degli occhi verso nervo ottico. </li><li> Utilizzando tutti e cinque gli aghi 27G appiattire strato RPE occhio facendo ben teso. </li><li> Utilizzando le forbici taglio della retina fare circolare intorno nervo ottico Strato di separazione RPE dall&#39;attaccamento al nervo ottico. Nota: i passaggi 13-17 può essere fatto con bassi ingrandimenti o senza microscopio stereo </li><li> Regolare stereomicroscopio di ingrandimento 250xo più e trovare margini del foglio RPE vicino al nervo ottico lungo il taglio effettuato da forbici iris. </li><li> Utilizzando due pinze membrana separata RPE-Bruch dallo strato di tessuto coroide. Si può richiedere alcuni tentativi per trovare spazio lungo il bordo dove la connessione di RPE e coroide è più debole. </li><li> RPE fogli in luogo freddo tripsina-EDTA in 15 ml tubo </li><li> Dopo l&#39;RPE sono raccolti, tubi cappuccio e trasferimento con tessuti in tripsina-EDTA in bagnomaria per 10-15min a 37 ° C. </li><li> Dopo 10 minuti di incubazione, scuotere vigorosamente provette da 15 ml per separare RPE in piccoli gruppi. Se la separazione non è completa, luogo tubi di nuovo in bagno d&#39;acqua per altri 5 minuti. </li><li> Ispezionare i tubi per un eventuale non-disciolti gruppi di cellule miste. Ogni cluster osservato deve essere rimosso utilizzando vetro sottile a punta della pipetta Pasteur. </li><li> Spin down (1,4 rpm centrifuga clinica per 4 min), le cellule hfRPE, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule nel 15% RPE dei media (9 totali ml) </li><li> Mettere 3 ml di sospensione cellulare in fiasche Primaria aggiungere 2 ml di fresca dei media il 15% RPE, borraccia posto in incubatrice fino al giorno successivo (37 ° C, 5% CO 2) </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Validazione funzionale di colture cellulari hfRPE In esperimenti precedenti abbiamo usato queste colture primarie per determinare l&#39;, polarizzazione espressione e la funzione delle proteine ​​di membrana plasmatica di trasporto e di individuare specifiche vie di segnalazione che regolano la funzione RPE 1-11 Queste caratteristiche così come sono accumulati fornire una validazione insieme di proprietà che possono essere applicate ad ogni generazione cellulare. Gli esperimenti sono riassunte qui di seguito identificare le proteine ​​che determinano il trasporto transepiteliale fluido e l&#39;integrità del percorso paracellulare. Questi esperimenti in vitro sono stati validati in un modello animale di ri-riattacco della retina 6. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Localizzazione di CFTR nelle cellule hfRPE Sinistra pannello superiore:. CFTR è stata rilevata nelle cellule hfRPE con membrana arricchiti estratti. M, marcatore di peso molecolare, corsia 1, grandi maturi (fascia C) e immaturi (fasce A e B) pannello centrale inferiore: la localizzazione di immunofluorescenza CFTR (etichetta verde) In alto a destra del pannello: allargata vista in sezione trasversale attraverso il piano z che mostra.. massima intensità di proiezione con l&#39;asse z. ZO-1 (etichettato come rosso) serve come un marcatore nodo stretto delineando i lati apicale e basolaterale della RPE. DAPI (blu) le etichette dei nuclei situato vicino alla membrana basale. ZO-1 appare come giallo / arancio, dal momento che la sua fluorescenza verde sovrapposizioni etichetta rossa CFTR. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Cambiamenti fisiologici IFNγ-indotta in hfRPE A:. Aggiunta di IFNγ al bagno basale maggiore di trasporto transepiteliale fluido (J v) in monostrato di primario, le cellule in coltura hfRPE J v è un grafico in funzione del tempo nella traccia superiore e fluido rete. assorbimento (apicale a bagno basale) è indicato da valori positivi; potenziale transepiteliale (TEP) e la resistenza dei tessuti totale (R T) vengono riportati in funzione del tempo nelle tracce fondo. B: L&#39;aggiunta di CFTRinh-172 (5 micron) al bagno basale inibito l&#39;IFNγ-stimolata J aumentare v. Di seguito è riportato un esempio di esperimenti modello animale confermando hfRPE risultati in vitro. In questo esperimento, create artificialmente distacco di retina è risultata significativamente ridotta dopo l&#39;aggiunta di IFNg alla superficie esterna dell&#39;occhio (Figura 4 A, B). Questo effetto può essere parzialmente bloccata da: (1) aggiunta del bloccante cAMP (fig. 4D), (2) completamente bloccato dopo l&#39;aggiunta di JAK bloccanti cAMP +. Le immagini di seguito sono ottenuti utilizzando lo scanner ottobre <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Esperimenti in vivo distacco di retina. Le procedure per tali esperimenti in vivo sono stati precedentemente descritti in dettaglio 6. In questi esperimenti, distacco della retina dell&#39;occhio sono stati creati nel ratto mediante iniezione di 0,5-3 ml di soluzione PBS modificato nello spazio sottoretinico (SRS), da soli o con una combinazione di JAK-STAT e di inibitori della via di PKA. Ogni esperimento ha avuto un periodo iniziale di controllo di 40-70 minuti dopo la creazione del distacco di retina. Durante questo periodo, il tasso di variazione del volume bleb è stata misurata per assicurare la stabilità vescichetta. Tomografia a coerenza ottica per immagini (Istituto di Fisica Applicata, Accademia Russa delle Scienze, Nizhniy Novgorod, Russia) è stato utilizzato per misurare i tempi del cambiamento volume in SRS. La durata di ri-attaccamento volcambiare UME è stata misurata mediante tomografia a coerenza ottica (OCT). Immagini dal 4 ottobre esperimenti diversi (pannelli a sinistra; dC) che mostrano un cambiamento della dimensione distacco (frecce in A, B e D) dopo l&#39;aggiunta di IFNγ sulla superficie anteriore per 40-70 min. Pannelli A e B mostrano che IFNγ aumentato Jv dal suo tasso di controllo (≈ 2 microlitri • cm 2 • h -1) a 14 e 12 microlitri • cm 2 • h-1, rispettivamente. In seguito all&#39;aggiunta di JAK-STAT e di inibitori della PKA (C e D), l&#39;IFNγ - tasso di assorbimento indotti erano significativamente ridotti a 0,2 e 7,9 microlitri • cm 2 • h-1, rispettivamente. Le frecce indicano il confine della vescichetta per il confronto con l&#39;area racchiusa tra la linea tratteggiata, (volume di partenza). Lato destro della figura: il pannello superiore in-sintesi delle misurati i tassi di Jv da diversi esperimenti; mezzo pannello-film ( <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/2032/Bleb%205.wmv">clicca qui</a> ), inferiore del pannello 3D-sezioni di esperimenti riassunti in B. PseudoColor in blu indica l&#39;estensione spaziale, di distacco a t = 0 e 40 minuti dopo l&#39;aggiunta di INFγ. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con l&#39;Associazione per la Ricerca in Oftalmologia Visione e dichiarazione. Il protocollo è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+paradigm:+Retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+stem+cells+or+induced+pluripotent+cells.">The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells.</a> Pigment Cell &#38; Melanoma Research. , .</li><li>Strunnikova, N. V., Maminishkis, A., Barb, J. J., Wang, F., Zhi, C., Sergeev, Y., Chen, W., Edwards, A. O., Stambolian, D., Abecasis, G., Swaroop, A., Munson, P. J., Miller, S. S., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+and+molecular+signature+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium.</a> Hum Mol Genet. 19 (12), 2468-2486 (2010).</li><li>Miller, S. S., Maminishkis, A., Li, R., Adijanto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+184:+Phototransduction:+RPE+transport+Retina+Phototransduction:+RPE+transport.">Chapter 184: Phototransduction: RPE transport Retina Phototransduction: RPE transport.</a> Encyclopedia of the Eye. , 2540-2540 (2010).</li><li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cells+to+organs:+Building+polarized+tissue.">From cells to organs: Building polarized tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (11), 887-901 (2008).</li><li>Maminishkis, A., Chen, S., Jalickee, S., Banzon, T., Shi, G., Wang, F. E., Ehalt, T., Hammer, J. A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li><li>Shi, G., Maminishkis, A., Banzon, T., Jalickee, S., Li, R., Hammer, J., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+chemokine+gradients+by+the+retinal+pigment+epithelium.">Control of chemokine gradients by the retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 4620-4630 (2008).</li><li>Economopoulou, M., Hammer, J., Wang, F. E., Fariss, R., Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+localization,+and+function+of+junctional+adhesion+molecule-C+(JAM-C)+in+human+retinal+pigment+epithelium.">Expression, localization, and function of junctional adhesion molecule-C (JAM-C) in human retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (3), 1454-1463 (2008).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Banzon, T., Wan, Q., Jalickee, S., Chen, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN{gamma}+Regulates+Retinal+Pigment+Epithelial+Fluid+Transport.">IFN{gamma} Regulates Retinal Pigment Epithelial Fluid Transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 297, C1452-C1465 (2009).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Wang, F. E., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-C+and+-D+induced+proliferation/migration+of+human+RPE+is+abolished+by+inflammatory+cytokines.">PDGF-C and -D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 5722-5732 (2007).</li><li>Maminishkis, A., Jalickee, S., Blaug, S. A., Rymer, J., Yerxa, B. R., Peterson, W. M., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y(2)+receptor+agonist+INS37217+stimulates+RPE+fluid+transport+in+vitro+and+retinal+reattachment+in+rat.">The P2Y(2) receptor agonist INS37217 stimulates RPE fluid transport in vitro and retinal reattachment in rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3555-3566 (2002).</li><li>Wang, F. E., Zhang, C., Maminishkis, A., Dong, L., Zhi, C., Li, R., Zhao, J., Majerciak, V., Gaur, A. B., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB J. 24, (2010).</li><li>Adijanto, J., Banzon, T., Jalickee, S., Wang, N. S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CO2-induced+ion+and+fluid+transport+in+human+retinal+pigment+epithelium.">CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium.</a> J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha5beta1+mediates+attachment,+migration,+and+proliferation+in+human+retinal+pigment+epithelium:+relevance+for+proliferative+retinal+disease.">Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).</li><li>Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+activates+calcium+signaling,+ion,+and+fluid+transport+in+retinal+pigment+epithelium.">Extracellular ATP activates calcium signaling, ion, and fluid transport in retinal pigment epithelium.</a> J Neurosci. 17, 2324-2337 (1997).</li><li>Voloboueva, L. A., Liu, J., Suh, J. H., Ames, B. N., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R)-alpha-lipoic+acid+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+damage.">R)-alpha-lipoic acid protects retinal pigment epithelial cells from oxidative damage.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4302-4310 (2005).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Negli esperimenti attuali, si descrivono ulteriori modifiche delle nostre tecniche precedentemente pubblicato 3, intesa a semplificare il più passaggi necessari a produrre coerente culture hfRPE primaria con un numero maggiore di cellule disponibili per occhio. Ogni modifica della procedura originale è stato rigorosamente testato in fisiologia e più esperimenti di biologia molecolare per garantire che le modifiche non introdurre artefatti e di essere continuamente testati da molti altri laboratori usando queste cellule. Infine, ulteriori esperimenti sono stati condotti per confrontare i risultati in vitro a perturbazioni simili in modelli animali.

Strumenti necessari per il protocollo dissezione <ol><li> Stereo microscopio - qualsiasi X250 disponibili con ingrandimento di lavoro necessario per la dissezione </li><li> Piatto dissezione - ad esempio Kimble 100 x 20mm # 23062 (uno per dissezione) qualsiasi fonte </li><li> Sylgard 184 - Cat WPI. # SYLG184 * * Per preparare la dissezione piatto seguire Sylgard 184 incluso delle istruzioni di miscelazione, versare misto elastomero liquido in piastra di Petri per formare 5-8mm layer. Lasciare elastomero di cura per almeno 24 ore. Piatto con elastomero curate possono essere sterilizzati con etanolo al 70% e riutilizzabili più volte (~ 100 volte) </li><li> Aghi da 27 G BD PrecissionGlide 1 ¼ lunghezza (5 per dissezione) qualsiasi fonte </li><li> HBSS 1X Soluzione contenente sali di Ca e Mg - Cat # 14025 GIBCO 500ml (buona per dissezioni multiple). </li><li> Iris forbici carburo lama seghettata, curva - FST Cat # 14559-11 (uno). </li><li> Forbici della retina - Katena Cat # K4-5300 (uno). </li><li> Pinza - per esempio pinzette Dumont # 5 con punte lucido da Cat WPI # 500085 (2 pezzi). </li><li> Sideport coltello - Alcon, clearcut 1mm, Bevel Dual, Cat angolato # 8065921540. </li><li> Centrifuga tubo 15ml - (uno per occhio) qualsiasi fonte </li><li> Pipetta Pasteur in vetro - (uno per dissezione) qualsiasi fonte </li><li> Tavola 12 bene (uno per dissezione) qualsiasi fonte </li><li> Primaria 25 centimetri Pallone 2 - (2-3 per occhio) qualsiasi fonte </li></ol>

experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology

Abbiamo sviluppato un procedimento di coltura cellulare in grado di produrre grandi quantità di monostrati confluenti di primaria umano fetale epitelio pigmentato retinico (hfRPE) culture morfologiche, fisiologiche e genetiche autoctone di RPE umano. Queste colture cellulari hfRPE mostra pigmentazione pesante, e la microscopia elettronica mostrano ampie microvilli della membrana apicale. I complessi giunzionali sono stati identificati con etichettatura immunofluorescenza di varie proteine ​​di giunzione stretta. Polarità epiteliale e la funzione di queste culture facilmente riproducibile primarie sono molto simili precedentemente studiato i modelli di RPE mammiferi nativi, compresi gli esseri umani. Questi risultati sono stati estesi con lo sviluppo di interventi terapeutici in diversi modelli animali di malattie dell&#39;occhio umano. Ci siamo concentrati sulle strategie per la rimozione di anomalo accumulo di liquido nella retina o spazio sottoretinico. Lo spazio extracellulare subretinico separa i segmenti esterni dei fotorecettori e la membrana apicale del RPE ed è fondamentale per il mantenimento degli allegati della retina e tutta una serie di RPE / retina interazioni.

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Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Forniamo un metodo riproducibile per la coltura monostrati confluenti di cellule fetali dell&#39;epitelio pigmentato retinico (hfRPE), le cellule che presentano morfologia, fisiologia, polarità e proteine ​​e schemi di espressione genica dei tessuti adulti nativi. Questo lavoro è stato esteso ad un modello animale di malattie degli occhi diversi.

Modelli sperimentali per lo Studio di Fisiologia dell&#39;epitelio pigmentato retinico e fisiopatologia

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

experimental-models-for-study-retinal-pigment-epithelial-physiology

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.2K Views.  National Institutes of Health. Forniamo un metodo riproducibile per la coltura monostrati confluenti di cellule fetali dell'epitelio pigmentato retinico (hfRPE), le cellule che presentano morfologia, fisiologia, polarità e proteine ​​e schemi di espressione genica dei tessuti adulti nativi. Questo lavoro è stato esteso ad un modello animale di malattie degli occhi diversi.

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Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissezione di un occhio mouse per un monte intero di dell&#39;epitelio pigmentato retinico

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Ricerca

Neuroscienze

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Saggi olfattive per modelli murini di malattia di Neurodegenerative

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello per lo Studio della Fisiopatologia Cellulare in Globoid Leucodistrofia cellulare

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

A bassa densità primaria ippocampale Cultura Neuron

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.

Modelli sperimentali per studiare la neuroprotezione del post-condizionamento acido contro l&#39;ischemia cerebrale

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Preparazione delle sezioni ricrello della retina

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

Coltivazione a lungo termine e priva di siero di estipe di retina di topo organotipico con epitelio pigmentato retinico intatto

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...