Vorremmo ringraziare il Dott. Cashdollar Bill per il suo supporto per l&#39;uso del Core citometria a flusso.

<ol><li> Prima di avviare il processo, i seguenti elementi devono essere raccolte e preparate per: <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Ghiaccio </li><li> Provette da 15 ml per le cellule colorazione e 12 x 75 mm per tubi di flusso colorazione controlli singolo colore. </li><li> Colorazione buffer: tampone fosfato salino (PBS) + 3% di siero fetale bovino (FCS) </li><li> Pipette </li><li> Fc bloccare (se necessario) e gli anticorpi colorazione. Gli anticorpi devono essere titolati per la colorazione ottimale. </li><li> Compensazione perline </li><li> Buffer di sospensione: soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) + 25 HEPES mM + 3% FCS </li><li> Trypan blu e emocitometro </li><li> Cellule filtro (40 micron nylon) </li><li> Provette per la raccolta: due tipi di tubi di raccolta può essere utilizzato a) 12 x 75 tubi in polistirolo mm (contenente 300 ml di FCS e 25 HEPES mM) o b) 15 ml provette coniche (FCS contenente 1 ml + 25 HEPES mM). Qualsiasi mezzo ricco di alta concentrazione sierica può essere utilizzato per la raccolta di cellule ordinati. </li></ol></li><li> Generare una sospensione singola cella della popolazione di cellule di partenza. </li><li> Opzionale: Arricchire per la popolazione cella desiderata con un metodo di purificazione di massa quali la riduzione del complemento o di smistamento magnetico. Il vantaggio principale della fase di arricchimento è che riduce il tempo di sorta. </li><li> Lavare le cellule una volta con colorazione buffer. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in colorazione tampone ad una concentrazione fino a 50 x 10 6 per la colorazione efficiente. </li><li> Opzionale: Per le cellule che esprimono alti livelli di FCR, bloccare i recettori utilizzando un metodo appropriato di blocco. Un metodo di scelta è l&#39;utilizzo di un anticorpo monoclonale che si lega a FcγR in ghiaccio per 10-15 minuti. Questi anticorpi sono disponibili in commercio. </li><li> Aggiungere la appropriato mAb (a una concentrazione predeterminata) per colorare la popolazione cella desiderata e incubare per 20-30 minuti sul ghiaccio al buio, seguito da due lavaggi con tampone colorazione. Opzionale: colorazione con un colorante vitale, come lo ioduro di propidio, possono essere usate per discernere le cellule morte (5). Se multicolore colorazione deve essere utilizzato, i controlli solo colore sono obbligatori. Noi usiamo CompBeads BD per preparare i controlli singolo colore utilizzando il protocollo del produttore. </li><li> Se non si utilizza direttamente gli anticorpi coniugati, ripetere il punto 7 con l&#39;anticorpo secondario appropriato o coniugato streptavidina. </li><li> Dopo il lavaggio, risospendere le cellule in terreno di coltura e determinare la concentrazione di cellule utilizzando un colorante vitale come tripan blu. </li><li> Regolare la concentrazione cellulare a 15-20 x 10 6 / ml. Per le popolazioni di cellule che formano i cluster, che possono ostruire lo strumento durante l&#39;ordinamento, filtrare le cellule attraverso un colino. </li><li> Impostare e ottimizzare la cell sorter. Il processo di creazione di un citofluorimetro varia a seconda della produzione e deve essere eseguita da personale adeguatamente addestrato. Le raccomandazioni generali sono i seguenti: <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Selezionare l&#39;ugello appropriato a seconda del tipo di cellula da ordinare. </li><li> Per i tipi sterile, sterilizzare lo strumento. </li><li> Effettuare il controllo della qualità dello strumento con perline di verificare i laser funzionano, ed è l&#39;ordinamento con precisione. </li><li> Installare il dispositivo richiesto raccolta e impostare i torrenti laterali. </li><li> Guarda laser dello strumento e il rivelatore fissati per determinare le etichette fluorescenti che possono essere utilizzati (il nostro BD FACS Aria ha tre laser e in grado di rilevare fino a nove colori). </li><li> Una volta determinato ciò etichette fluorescenti saranno utilizzati sul cell sorter, la compensazione può essere effettuata (come spiegato di seguito). </li></ol></li><li> Eseguire compensazione con il campione di controllo negativo e positivo i controlli singoli. La compensazione è necessario rimuovere la sovrapposizione dello spettro tra due rivelatori. E &#39;il caso di osservare che la compensazione non è infallibile ed è influenzata negativamente da come brillantemente alcuni marcatori macchia, e con la fluorescenza delle cellule che hanno autofluorescenza basso, che può portare ad una risoluzione molto bassa tra le popolazioni debole e negativo. Per ottenere i migliori risultati, il disegno sperimentale dovrebbe includere utilizzando fluorocromi luminoso con marcatori che hanno una bassa espressione o che non hanno un pattern di colorazione nota. Marcatori che garantiscono una buona separazione tra le popolazioni delle cellule e sono altamente espresso deve essere usato con fluorocromi dimero come quelli eccitati dal laser di colore rosso o viola. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Compensazione può essere eseguita con perline di compensazione, che sono microparticelle di polistirene che è stato accoppiato ad un anticorpo specifico per la catena leggera Kappa di Ig di topo, ratto o topo / criceto. Le perle sono facili da macchia, un segnale forte e forniscono un modo semplice di preparare singoli controlli che hanno macchiato il fluoroforo stesso i campioni sperimentali. </li><li> Impostare un modello che include un complotto bivariata per visualizzare scatter in avanti (FSC) e side scatter (SSC), e uno istogramma perogni fluorocromo che verrà utilizzato. </li><li> Esegui il tubo di controllo negativo e regolare la dispersione in avanti (FSC) e side scatter (SSC) per posizionare la popolazione di interesse su scala. </li><li> Regolare le impostazioni PMT fluorescenza per posizionare la popolazione negativo o autofluorescenza nella porzione mano all&#39;estrema sinistra dell&#39;istogramma. </li><li> Registra il tubo di controllo negativo. </li><li> Eseguire i tubi singolo controllo positivo e registrare i dati per ogni tubo. </li><li> Disegnare un cancello intervallo intorno alla parte positiva dei dati sul istogramma, e un altro cancello intervallo sulla porzione negativa dell&#39;istogramma. </li><li> Compensazione manuale viene effettuata regolando la mediana (mediana è una stima migliore della tendenza centrale rispetto alla media su una scala logaritmica) dei positivi fino a quando non è uguale alla media dei negativi. Questo deve essere fatto per ciascuna delle etichette fluorocromo utilizzato nell&#39;esperimento. </li><li> Per regolare la mediana, regolare i valori spettrali si sovrappongono sia superiore o inferiore fino a quando le mediane per ogni partita parametro fluorescente il più possibile. </li><li> Compensazione può essere effettuata anche automaticamente con il software di analisi. Compensazione automatica utilizza i dati registrati dai controlli di compensazione per calcolare una matrice algebrica di tutti i fluorofori utilizzati nell&#39;esperimento. Questi valori vengono utilizzati per sottrarre i contributi dei non-colori primari che sono il sanguinamento in rivelatore di un colore primario. </li></ol></li><li> Registrare il campione sperimentale da ordinare e utilizzare strumenti e metodi di sottoinsiemi gating per definire le popolazioni di interesse. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Impostare il modello sperimentale con un dot plot che mostra FSC vs SSC e utilizzare uno strumento di gating, poligono, rettangolo, intervallo o al quadrante porta la popolazione di interesse. Il grafico a dispersione visualizza le proprietà fisiche della cellula che è distinto per il tipo di cellula. </li><li> Il modo migliore per determinare la strategia di fluorescenza gating è quella di utilizzare fluorescenza meno uno (FMO) controlli. In una provetta di controllo FMO tutti i reagenti utilizzati nell&#39;esperimento sono inclusi ad eccezione di quello di interesse. La FMO aiuta a discriminare tra le popolazioni scarsamente colorati e ampia popolazioni negativo. </li><li> Utilizzare i dati registrati da tubi FMO a determinare la posizione cancelli all&#39;interno del tubo sperimentale. </li></ol></li><li> Una volta che cancelli sono stati determinati, le porte possono essere selezionati per l&#39;ordinamento in tubi di raccolta esterni. Fino a quattro porte (o popolazioni) possono essere ordinati in una sola volta a seconda della strumentazione disponibile. </li><li> Esegui il tubo sperimentale campione a 4 ° C, girare su piatti di deflessione, e ordinare il campione. 5 x 10 5 -1,5 x 10 6 cellule possono essere ordinati in un tubo di 12 x 75 mm e 1,5 x 10 6 - 4,5 x 10 6 cellule possono essere ordinati in un ml 15. </li><li> Una volta che il numero di cellule è stata ottenuta, interrompere manualmente l&#39;ordinamento. </li><li> Eseguire una sorta di post-analisi per determinare la purezza delle popolazioni cellulari ordinati. </li></ol> Rappresentante risultati Abbiamo mostrato qui i risultati per B del mouse splenica e l&#39;ordinamento delle cellule T CD4 (Figura 1). Splenociti sono state colorate con PE Texas Red-coniugato anti-topo B220, FITC-coniugato anti-topo TCRβ e Alexafluor-700-coniugato anti-topo CD4 per identificare le cellule B (B220 + TCRβ-) e le cellule T CD4 (CD4 + + TCRβ ). La selezione è stata effettuata con lo strumento BD FACS Aria. Dopo la cernita la purezza delle cellule B era&gt; 97% e la purezza delle cellule T CD4 era&gt; 98%. <img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La purezza delle cellule B della milza e le cellule T CD4 dopo FACS. Splenociti topo sono state colorate con anticorpi anti-topo B220, TCRβ e anticorpi CD4. FACS per le cellule B è stata effettuata utilizzando un BD FACS Aria di gating su B220 + TCRβ-cellule (Fig. 1A, pannello di sinistra, quadrante in basso a destra). Una sorta di analisi post è stato eseguito per determinare la purezza delle cellule B (Fig. 1A, pannello di destra). Colorazione B220 viene visualizzato l&#39;asse delle ascisse e colorazione TCRβ sulla y.. FACS di cellule T CD4 è stata eseguita con lo stesso citometro di flusso di gating su TCRβ + cellule CD4 + (Fig. 1B, pannello di sinistra, quadrante superiore destro). Una sorta di analisi post è stato eseguito per determinare la purezza delle cellule T CD4 (Fig. 1B, pannello di destra). Colorazione TCRβ viene visualizzato l&#39;asse delle ascisse e CD4 macchie sulla y.. Le cellule positive per cento in ogni quadrante viene visualizzato. <!--<img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Purezza delle cellule T CD4 splenica dopo FACS. Murini cellule T della milza sono stati arricchiti con la rimozione delle cellule B di panning. Successivamente, le cellule sono state colorate con anticorpi anti-topo TCRβ e anticorpi CD4 (pannello di sinistra). FACS è stata effettuata utilizzando un BD FACS Aria di gating su TCRβ + cellule CD4 + (pannello di sinistra, in alto a destra quadrformica). Una sorta di analisi post è stato eseguito per determinare la purezza delle cellule T, che è stato superiore al 99% (pannello di destra). Colorazione TCRβ viene visualizzato l&#39;asse delle ascisse e CD4 macchie sulla y.. Le cellule positive per cento in ogni quadrante viene visualizzato. -&gt;

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FACS è una tecnica altamente sofisticata per purificare popolazioni cellulari di interesse, in cui una purezza molto elevata (95-100%) della popolazione ordinati può essere ottenuto. Pertanto, questa tecnica è particolarmente importante per gli esperimenti, in cui elevata purezza è un requisito essenziale (ad esempio l&#39;analisi microarray). FACS è particolarmente vantaggioso rispetto ad altri metodi disponibili di purificazione in cui una popolazione di cellule ha bisogno di essere purificata sulla base di un indicatore settimanale superficie espressa o quando due o più popolazioni bisogno di essere purificati, che hanno diversi livelli di espressione del marcatore di superficie stesso. Per esempio, la purificazione delle cellule B della zona marginale (B220 CD23 + CD21 hi int / basso) e le cellule B follicolari (B220 + CD21 int / hi basso CD23) sulla base di livelli di espressione di CD21 e CD23. Un&#39;altra applicazione crescente di FACS è smistamento singola cella che permette l&#39;analisi delle singole cellule (3, 4). FACS è anche comunemente usato per le cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti tipo che sono espressione genetica, come la proteina fluorescente verde proteine ​​tag (5). Se una sorta sterile viene eseguito le cellule possono essere coltivate. Tuttavia, la vitalità delle cellule e il rendimento può essere compromessa durante l&#39;ordinamento. Vitalità può essere migliorata utilizzando una cella dipendente dalla temperatura ottimale per la cernita e lavorazione tubi da collezione subito dopo il raggiungimento di capacità. Recupero può essere aumentata utilizzando provette in polipropilene, raccogliendo le cellule ordinati nel siero rich media e provette per la raccolta invertendo ad intermittenza, il mantenimento di tubi di raccolta ad una temperatura ottimale e la centrifugazione le cellule ordinati per circa 10 min (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm). Lo sviluppo di ultra ad alta velocità selezionatori ha esteso la possibilità di applicazione di smistamento del flusso in ambito clinico. Le potenziali applicazioni cliniche di FACS comprendono purificazione delle cellule staminali da sangue umano a scopo terapeutico, le applicazioni nella terapia del cancro, la sostituzione amniocentesi, l&#39;ordinamento dello sperma umano e rilevamenti malattia in fase precoce (6, 7). Per la colorazione multicolore, la selezione degli anticorpi è un passo critico e fluorocromi sono scelti in base al sistema di rilevazione per ogni strumento. Ci sono un certo numero di aziende che vendono i selezionatori delle cellule e la configurazione del laser varia a seconda delle esigenze degli utenti. Così non si può semplicemente utilizzare gli anticorpi esattamente lo stesso utilizzato in studi pubblicati senza confermare la compatibilità. Per la selezione degli anticorpi ottimali, si dovrebbe considerare il livello di espressione della proteina in esame. In generale, più brillanti gli anticorpi disponibili fluorocromo-tag deve essere usato per colorare marcatori di superficie debolmente espressa, mentre dim fluorocromi possono essere usati per la colorazione dei marcatori di superficie altamente espresso (8). Inoltre, gli anticorpi dovrebbero essere selezionati in modo tale che si sovrappongono tra loro spettri di emissione è minima. Per la colorazione multicolore, è estremamente difficile scegliere fluorocromo che non hanno sovrapposizione spettrale. In questa situazione, la compensazione viene eseguita. La compensazione è necessario eliminare matematicamente la sovrapposizione tra lo spettro di fluorescenza emissioni dei vari fluorocromi che è misurabile dai rivelatori (8-10). In altre parole, la sovrapposizione fluorescenza da un fluorocromo viene sottratto dallo spettro delle emissioni di un altro fluorocromo. Il calcolo dell&#39;indennità implica un controllo senza macchia e singoli controlli positivi per ogni fluorocromo utilizzato per una colorazione multicolore (9, 10). La compensazione può essere condotta utilizzando cellule o perline. Le perle sono facili da macchia, un segnale forte e forniscono un modo semplice di preparare singoli controlli che hanno macchiato la fluorofori stessi dei campioni sperimentali. Perle di compensazione sono particolarmente vantaggiosa quando la proteina della superficie delle cellule di interesse è espresso ad un livello basso e quando la popolazione di cellule è limitante nella popolazione iniziale di cellule di partenza. Una volta che gli anticorpi sono stati scelti, la loro attività deve essere ottimizzata per l&#39;esecuzione di un&#39;analisi di titolazione. Ciò è particolarmente importante se la macchina è FACS laser molto potenti. L&#39;uso di concentrazioni non ottimali di anticorpi colorazione può portare alla separazione povera della popolazione cellulare desiderato dalla popolazione cellulare totale. L&#39;uso di alte concentrazioni di anticorpi aumenta la possibilità per l&#39;antigene di colorazione aspecifica. Quindi la titolazione degli anticorpi permetterà la selezione della concentrazione anticorpale che dà la massima luminosità della popolazione positivo e la colorazione di fondo minima (8). FACS è ormai una tecnica standard per la purificazione delle sottopopolazioni di cellule. Può essere utilizzato per separare qualsiasi tipo di cellula in cui una sospensione singola cellula può essere generata e gli anticorpi sono a disposizione per identificare la popolazione cellulare desiderato. FACS è il metodo di scelta quando highly popolazioni di cellule pure sono necessari.

purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (facs)

Studi sperimentali e clinici spesso richiedono popolazioni di cellule altamente purificato. FACS è una tecnica di scelta per purificare le popolazioni di cellule fenotipo noto. Altri metodi di purificazione di massa comprendono panning, esaurimento integrare e separazione magnetica tallone. Tuttavia, FACS ha diversi vantaggi rispetto ad altri metodi disponibili. FACS è il metodo preferito quando purezza molto elevata della popolazione desiderato è necessario, quando la popolazione di cellule bersaglio esprime un livello molto basso del marcatore di identificazione o quando popolazioni di cellule richiedono la separazione in base alla densità differenziale marcatore. Inoltre, FACS è l&#39;unica tecnica di purificazione a disposizione di isolare le cellule in base alla colorazione interna o espressione della proteina intracellulare, come un marcatore geneticamente modificati proteina fluorescente. FACS permette la purificazione di singole cellule in base alle dimensioni, granularità e fluorescenza. Al fine di purificare le cellule di interesse, vengono prima colorati con fluorescenza-tagged anticorpi monoclonali (mAb), che riconoscono specifici marcatori di superficie sulla popolazione cella desiderata (1). Selezione negativa di cellule senza macchia è anche possibile. FACS purificazione richiede un citofluorimetro con capacità di smistamento e il software appropriato. Per FACS, le cellule in sospensione sono passati come un flusso in gocce con ciascuno dei quali contiene una singola cella di fronte a un laser. Il sistema di rilevamento a fluorescenza rileva le cellule di interesse sulla base di predeterminati parametri di fluorescenza delle cellule. Lo strumento si applica un addebito per la goccia che contiene una cella di interesse e di un sistema di deflessione elettrostatica agevola la raccolta delle gocce addebitato in provette di raccolta (2). Il successo della colorazione e, quindi, l&#39;ordinamento dipende in gran parte alla selezione dei marcatori individuazione e la scelta di mAb. Parametri di ordinamento può essere regolata a seconda del requisito della purezza e della resa. Anche se FACS richiede attrezzature specializzate e formazione del personale, è il metodo di scelta per l&#39;isolamento delle popolazioni di cellule altamente purificato.

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Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Per molti studi scientifici che richiedono una analisi biologiche e chimiche delle popolazioni di cellule le cellule devono essere in uno stato di purezza. Fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) è un metodo superiore, in cui per ottenere popolazioni di cellule pure.

Purificazione della popolazione di cellule specifiche per fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

72.9K Views.  BloodCenter of Wisconsin. Per molti studi scientifici che richiedono una analisi biologiche e chimiche delle popolazioni di cellule le cellule devono essere in uno stato di purezza. Fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) è un metodo superiore, in cui per ottenere popolazioni di cellule pure.

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Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

L&#39;esaurimento delle popolazioni di cellule specifiche da deplezione del complemento

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

Visualizzazione delle risposte tossina batterica provocata con diretta microscopia a fluorescenza cellulare

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generazione<em&gt; De Novo</em&gt; Antigene-specifici T umana recettori cellulari di trasduzione retrovirale di Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

rilevamento di<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variante superficie glicoproteina da magnetico cellulare Attivato Ordinamento e citometria a flusso

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Diffusione molecolare nel plasma membrane dei linfociti primari misurati da Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to efflux the DNA-binding dye Hoechst 33342. This "side population" of cells can be identified using flow cytometric methods after the Hoechst 33342 dye is excited by an ultraviolet (UV) laser. The side population of many cell types contains stem- or progenitor-like cells. However, not all cell types have an identifiable side population. Danio rerio, zebrafish, have a robust in vivo model of T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL), but whether these zebrafish T-ALLs have a side population is unknown. The method described here outlines how to isolate the side population cells in zebrafish T-ALL. To begin, the T-ALL in zebrafish is generated via the microinjection of tol2 plasmids into one-cell stage embryos. Once the tumors have grown to a stage at which they expand into more than half of the animal's body, the T-ALL cells can be harvested. The cells are then stained with Hoechst 33342 and examined by flow cytometry for side population cells. This method has broad applications in zebrafish T-ALL research. While there are no known cell surface markers in zebrafish that confirm whether these side population cells are cancer stem cell-like, in vivo functional transplantation assays are possible. Furthermore, single-cell transcriptomics could be applied to identify the genetic features of these side population cells.

Here, we describe a technique to isolate the side population cells from a zebrafish model of myc-induced T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). This side population assay is highly sensitive and is described for zebrafish T-ALL, but it may be applicable to other malignant and non-malignant zebrafish cell types.

Isolamento della popolazione Side di Myc-indotta delle cellule T leucemia linfoblastica acuta in Zebrafish

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Generazione di un gran numero di progenitori mieloidi e precursori delle cellule dendritiche dal midollo osseo murino utilizzando una romanzo cella ordinamento strategia

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...