הפרוטוקול שלנו מספק שיטת חיסון ומיצוי צמחית עדינה המאפשרת לשחזר אוכלוסיות חיידקים הגדלות באפופלסט העלה המתאים לניתוח ביטוי גנים של תא בודד כגון ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת מיצוי של כמות ניכרת של חיידקים מהאפופלסט מבלי לזהם משמעותית את הדגימות בפסולת תאית צמחית. שיטה אופטימלית זו לשחזור חיידקים אפופלסטיים יכולה להיות מיושמת ישירות או עם שינויים קלים במספר מערכות חיידקים צמחיות הכוללות חיידקים פתוגניים צמחיים או חיידקים אנדוציטיים מועילים.
מי שתדגים את ההליך תהיה ניבס לופז-פגאן, דוקטורנטית מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, מלאו עציץ בקוטר 10 ס"מ בתערובת מצע צמחי ורמיקוליט 1:3 שהושקה בעבר. מכסים את העציץ ברשת מתכת מחוררת ומתאימים את רשת המתכת לאדמה הרטובה באמצעות גומייה.
לאחר מכן, לזרוע זרעי Arabidopsis לתוך החורים של רשת מתכת עם קיסם רטוב. מניחים שלושה-ארבעה זרעים במקומות מרוחקים בתוך העציץ. מכסים את הסיר בכיפת פלסטיק כדי לשמור על לחות יחסית גבוהה ודגרים לריבוד בארבע מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
מעבירים את העציץ לתא גידול של הצמח בתנאים קצרים. כדי לחשוף את הסיר, הסירו את כיפת הפלסטיק. לאחר שהזרעים נובטים, השתמשו בפינצטה כדי להסיר את רוב השתילים, תוך שמירה על שתיל אחד בכל אחד ממיקומי העציץ.
לאחר מכן הכינו צמחי שעועית Phaseolus vulgaris על ידי כיסוי תחתית צלחת פטרי בחתיכת מגבת נייר רטובה והנחת זרעי השעועית מעליה. אוטמים את צלחת הפטרי בסרט כירורגי ודגרים בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד ארבעה ימים. מעבירים את הזרעים המונבטים לעציץ בקוטר 10 ס"מ מלא בתערובת רטובה של מצע צמחי ורמיקוליט ביחס 1:3 ודגרים בתא גידול של צמחים בתנאים ארוכי יום.
פזרו את מלאי הגליצרול של זן מזרקי Pseudomonas המעניין ממינוס 80 מעלות צלזיוס לתוך צלחת LB בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה. לדגור על הצלחת ב 28 מעלות צלזיוס במשך 40 עד 48 שעות. לגרד את הביומסה החיידקית ולהשהות אותה מחדש בחמישה מיליליטר של מגנזיום כלורי 10 מילימולרי.
מדוד את הצפיפות האופטית ב- 600 ננומטר והתאם אותה ל- 0.1 על ידי הוספת מגנזיום כלורי 10 מילימולרי. בצע דילולים סדרתיים במגנזיום כלורי של 10 מילימולר כדי לקבל ריכוז חיסוני סופי של פי חמש פי 10 עד החמישי CFU למיליליטר. לאחר מכן, להכין 200 מיליליטר של inoculum עבור צמחי Arabidopsis ו 50 מיליליטר עבור צמחי שעועית.
לפני החיסון, יש להוסיף את חומר פעילי השטח סילווט L-77 לריכוז סופי של 0.02% לחיסון שעועית ו-0.01% לארבידופסיס. לחדירת ארבידופסיס מניחים שני מקלות עץ היוצרים X מעל הסיר ומניחים את הסיר עם הפנים כלפי מטה מעל צלחת פטרי בקוטר 14 ס"מ המכילה 200 מיליליטר אינקולום. לחיסון עלי שעועית, הכניסו את הצמחים ואת תמיסת האינקולום לתא ואקום והכניסו את העלה לצינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מיליליטר המכיל את החיסון.
תן דופק של 500 מיליבר במשך 30 שניות כדי לחדור את העלים. מסננים את תמיסת החיסון העודפת בעזרת פיסת נייר ומחזירים את התוכניות לתא הגידול המתאים להן. ארבעה ימים לאחר החיסון, חותכים את החלק האווירי של צמח הארבידופסיס או את העלה המחוסן מצמח השעועית ומניחים אותו במזרק של 20 מיליליטר ללא מחט.
עבור עלי שעועית, לגלגל את העלה על עצמו, משאיר את הפנים abaxial כלפי חוץ. מוסיפים מספיק נפח של מים מזוקקים כדי לכסות את הרקמה. לאחר מכן, הכנס את הבוכנה המחזיקה את המזרק במצב זקוף והסר את עודפי האוויר ובועות האוויר בתוך המזרק על ידי הקשה עדינה על החבית עד שכל האוויר ממוקם ליד הקצה, ולאחר הסרת האוויר, כסה את קצה חבית המזרק בסרט פרפין.
עכשיו בזהירות לחץ על הבוכנה כדי ליצור לחץ חיובי עד הרקמה הופך כהה יותר. לאחר מכן, משוך את הבוכנה כדי ליצור לחץ שלילי. הסר את סרט הפרפין ואת הבוכנה ולאסוף את הנוזל המכיל את החיידקים שחולצו אפופלסט.
לאנליזה של תא בודד, הכינו תמיסת אגרוז של 1.5% במים מזוקקים. לאחר ההמסה, הוסף מספיק נפח כדי למלא את החלל בין שתי שקופיות מיקרוסקופיה המונחות זו לצד זו והניחו שקופית נוספת למעלה. תן להם לנהוג במשך 15 דקות והסר את המגלשה שהונחה על החלק העליון בזהירות.
בעזרת להב, חותכים את כרית האגרוז לחמישה מילימטר על חמישה מילימטר לפני השימוש. במקביל, צנטריפוגה מילימטר אחד של החיידק המופק אפופלסט. בזהירות להסיר את supernatant באמצעות פיפטה ו resuspend את הגלולה לתוך 20 מיקרוליטר מים כדי לרכז את התאים.
מניחים טיפה של שני מיקרוליטר של התאים המרוכזים על מכסה 0.17 מ"מ ומכסים את הטיפה עם חתיכת כרית אגרוז. דמיינו את הכנת החיידקים תחת המיקרוסקופ הקונפוקלי כדי לזהות חיידקים פלואורסצנטיים ירוקים באמצעות לייזרים ספציפיים. זהה את כל החיידקים באמצעות השדה הבהיר ומיזג את שני השדות.
כדי לבצע ניתוח על ידי ציטומטריית זרימה, לקחת aliquot של תרחיפים חיידקים אפופלסט. לנתח באמצעות ציטומטר זרימה ולרכוש 100, 000 אירועים. ביטוי של hrpL GFP מנוטר על ידי פלואורסצנטיות GFP.
גרפי תרשים הנקודות מראים את התפלגות עוצמת הפלואורסצנטיות של GFP לעומת גודל התא באוכלוסייה, ואילו ההיסטוגרמות מראות את עוצמת הפלואורסצנטיות של GFP לעומת ספירת תאים. אחוזי hrpL ON היו גבוהים מהאחוזים המקבילים של hrpL OFF. תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראות רמות הטרוגניות של GFP הקשורות לביטוי של hrpL.
החיידקים המציגים פלואורסצנטיות GFP נמוכה או ללא פלואורסצנטיות נצפים. לקבלת תוצאות מיטביות, היו עדינים במהלך שלבי מיצוי החיידקים כדי למנוע פגיעה ברקמת הצמח ובכך להגביל את הזיהום מתכולת תאי הצמח. דגימות החיידקים המתקבלות יכולות לשמש למטרות אחרות שבהן הפחתת זיהום הצמח היא יתרון, כגון מיצוי חומצות גרעין לניתוח גנומי חיידקי או שעתוק לאחר מכן.
