הערכת בטיחות הלב היא מרכיב מכריע בתהליך פיתוח התרופה. קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC אנושי הוכיחו את עצמם כמודל אמין, יעיל ומבוסס על בני אדם להערכת בטיחות לב פרה-קלינית. הקמנו מתודולוגיות כדי לחקור באופן מקיף את המאפיין הפונקציונלי של קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC אנושי, שהם בעלי מודלים חשובים מאוד של מחלות, בדיקת רעילות אירובית הנגרמת על ידי תרופות ורפואה מדויקת.
השילוב הגובר של קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC אנושי בתהליך הערכות הבטיחות הפרה-קליניות הסטנדרטיות הוא בעל פוטנציאל לשפר את הדיוק של חיזוי רעילות של תרכובות של מועמד. התחל על ידי culturing iPSC נגזר iPSC אנושי cardiomyocytes לפחות 10 ימים לפני ביצוע המדידה. הפעל את בקר הטמפרטורה והגדר אותו על 37 מעלות צלזיוס.
הפעל את המיקרוסקופ, המצלמה ואספקת הפחמן הדו-חמצני. מלאו את מעיל המים של מחזיק הצלחת בכמות מתאימה של מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה. מניחים את צלחת 96 הבאר על מחזיק הצלחת, ודוגרים את התאים במשך חמש דקות לפחות.
פתח את תוכנת התצוגה ולאחר מכן הגדר את קצב המסגרות של המצלמה ל-75 פריימים לשנייה, ואת רזולוציית הווידאו או התמונה ל-1024 x 1024 פיקסלים. החל את פונקציות המיקוד האוטומטי והבהירות האוטומטית, הקלט סרטונים ותמונות של קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC אנושי. הנח בזהירות טיפת שמונה מיקרוליטר של תמיסת ציפוי מטריצה תאית נוספת על שטח אלקטרודת ההקלטה של כל באר של 48 לוחות מערך מיקרואלקטרודות היטב.
לאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטר של מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה לאזור המקיף את הבארות כדי למנוע אידוי תמיסת ציפוי. באמצעות קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, הסר את רוב מדיום המטריצה התאית הנוספת משטח הבאר באותה שורה או עמודה בודדת מבלי לגעת באלקטרודות. זרע 50, 000 תאים לכל באר בטיפה של שמונה מיקרוליטר של מדיום זריעה מעל אזור אלקטרודת ההקלטה.
חוזרים על הפעולה עד שכל הבארות מצופות בתאים. לאחר מכן דגרו את לוחות מערך המיקרואלקטרודות באינקובטור של תרביות תאים לחות. הוסיפו באיטיות 150 מיקרוליטרים של מדיום זריעה לכל באר של לוחות מערך המיקרואלקטרודות.
ביום 10 לאחר הציפוי, בדוק את הצפיפות של הכאה ספונטנית אנושית iPSC CM monolayer תחת מיקרוסקופ. הנח את צלחת מערך 48 המיקרואלקטרודות היטב במכשיר ההקלטה. ודא שהטמפרטורה היא 37 מעלות צלזיוס והפחמן הדו חמצני הוא 5% פתח את תוכנת הנווט.
בחלון ההתקנה הניסיונית, בחר תצורה בזמן אמת של הלב והקלטות פוטנציאליות בשדה. החל תצורות ספונטניות או הדבקות. בפרמטרים של זיהוי פעימות, הגדר את סף הזיהוי ל-300 מיקרו-וולט, את תקופת ההכאה המינימלית ל-250 אלפיות השנייה ואת משך ההכאה המרבי לחמש שניות.
בחר רגרסיה פולינומית לחישוב משך פוטנציאל השדה. בדוק אם אות הפעילות החשמלית הבסיסית בוגר ויציב, ורכוש את פעילות הלב הבסיסית למשך דקה עד שלוש דקות. בצע את ההקלטה 10 ימים לאחר הציפוי.
החלף את מדיום התחזוקה האנושי iPSC CM בתמיסה של טירוד, ואפשר לתאים להתאקלם למשך 15 דקות. הכנס את חיישני הטמפרטורה לתא, והכנס את צלחת 35 המילימטר פנימה. כוונן את הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס.
משוך את המיקרו פיפטות מנימי זכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך מיקרו פיפטה. מלאו את המיקרו-פיפטות בתמיסה התוך-תאית, והכניסו אותן למחזיק המחובר לשלב הראשי של מגבר המדבקה. פתח את תוכנת הרכישה, טען את פרוטוקול הקלטת פוטנציאל הפעולה ובחר את תצורת מהדק המתח.
הכנס את המיקרו פיפטה לתמיסת האמבטיה, ובחר CMs iPSC אנושיים בודדים מתאימים. התאם והנמיך את מיקום המיקרו פיפטה ליד התא שנבחר באמצעות מיקרומניפולטור. כאשר קצה הפיפטה מוכנס לתמיסת האמבטיה, בדוק את עמידות הפיפטה על צג האוסצילוסקופ.
מקם את הפיפטה קרוב לתא, והפולסים הנוכחיים יפחתו מעט כדי לשקף את התנגדות האטם הגוברת. החל יניקה עדינה עם לחץ שלילי כדי להגביר את ההתנגדות. זה יהווה ג'יגה-זל.
לאחר מכן החל את פונקציית האיטום. החל יניקה נוספת כדי לשבור את הממברנה כדי לקבל תצורת הקלטה של תא שלם. בשלב זה, עבור ממצב מהדק מתח למצב מהדק זרם, או ללא הזרקת זרם באמצעות דיאלוג המגבר.
לחץ על כפתור ההקלטה כדי ליצור ולשמור את קבצי ההקלטה הפוטנציאליים של הפעולה. יש לבצע את מדידת הסידן החולפת לפחות 10 ימים לאחר הציפוי. הכינו את הפתרון של טירוד טרי ואת פתרון הטעינה Fura-2 AM.
שאפו את מדיום התחזוקה האנושי של iPSC CM, ושטפו את התאים בתמיסה של טירוד פעמיים. יש למרוח 100 מיקרוליטרים של תמיסת ההעמסה Fura-2 AM ולדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. החלף את תמיסת ההעמסה Fura-2 AM בתמיסה של tyrode ודגירה למשך חמש דקות לפחות לצורך דה-אסטרציה מלאה של Fura-2 AM. הוסיפו טיפה של שמן טבילה על מטרת טבילת השמן פי 40 של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך.
מניחים את תא התא במתאם הבמה של המיקרוסקופ. התקן את חוטי בקר הטמפרטורה לתא האמבטיה, והגדר אותו ל -37 מעלות צלזיוס. התקן את אלקטרודות גירוי השדה החשמלי, והגדר את הפולסים על 0.5 הרץ עם משך של 20 אלפיות השנייה.
הפעל את מקור האור המחליף אורכי גל במהירות גבוהה במיוחד, והגדר אותו למצב מיתוג מהיר של 340 ננומטר ו-380 ננומטר. החל זמן חשיפה של 20 אלפיות השנייה עבור שני אורכי הגל, וזמן הקלטה של 20 שניות. הקלט את הסרטון המשקף שינויים בזמן אמת של סידן חולף, ייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני לניתוח.
מונולייר קרדיומיוציטים אנושי שמקורו ב-iPSC שימש למדידת תנועת הכיווץ. ניתוח של עקבות של תנועת הרפיית הכיווץ באמצעות תוכנת האנליזה זיהה את התחלת הצירים, שיא הכיווץ, סוף הכיווץ, שיא ההרפיה וסוף ההרפיה. כיסוי מלא של מונולאייר קרדיומיוציטים שמקורו ב- iPSC אנושי נצפה על כל האלקטרודות בתוך לוחות מערך המיקרואלקטרודות.
צורות הגל הבוגרות שנרשמו על ידי כל אלקטרודה שיקפו את פוטנציאל שדה הלב בעל המאפיינים הניתנים לזיהוי. לאחר ניתוח התקבלו תקופת פעימה, משך פוטנציאל שדה ומשרעת ספייק. הקלטות מהדקי טלאי תאים שלמים במצב הידוק הנוכחי תיעדו את פוטנציאל הפעולה הספונטני של קרדיומיוציטים בודדים.
לאחר הניתוח התקבלו מספר פרמטרים, כולל המשרעת, הפוטנציאל הדיאסטולי המרבי ומשך פוטנציאל הפעולה. לאחר ניתוח של הדמיית סידן, F340 על ידי F380 יחס לאורך זמן התקבל, ועקבות גולמיים של ארעי סידן מגורה הותאמו. בנוסף, התקבלו פרמטרים כגון משרעת, סידן דיאסטולי ודעיכת סידן.
חשוב להשתמש בקרדיומיוציטים הנגזרים מ- iPSC אנושיים הנמצאים בתנאי מכות טובים, כמו גם כדי להבטיח את הטוהר הגבוה של הקרדיומיוציטים האנושיים שמקורם ב- iPSC. פרוטוקול זה כולל ארבע טכניקות ספציפיות לחקר פונקציונליות קרדיומיוציטים שמקורה ב- iPSC אנושי, תצורה אחרת, או אוטומטית אם לחקור זרמים יוניים לבביים הממלאים תפקיד מכריע בלב
